t—PA指形区,上皮生长因子样区缺失突变体cDNA克隆的构建及…

研究ｔ－ＰＡＦ区和ＥＧＦ区在ｔ－ＰＡ郭清中的作用。利用本室构建的ｔ－ＰＡｃＤＮＡ克隆，采用片段重组技术缺失突变指形区，上皮生长因子样区和部分三角区，组装了由逆转录病毒长末端重复顺序启动和终止的ｐＭＤＧＢ△ＦＥ表达质粒。     

重组血管生成抑制因子r—K4K5的分离纯化与功能鉴定

目的 分离纯化r-K4K5,探讨r-K4K5对牛毛血管内皮（BCE）细胞、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成及实验性人肺腺癌SPC-A1生长的抑制作用。方法 通过盐析、凝胶过滤提纯r-K4K5,BCE细胞在含r-K4K5的DMEM中培养24、48、72h后分别计数;孵化7d的鸡胚加r-K4K5后继续孵育72h,观察新生血管生成;已经接种入SPC-A1肺腺癌组织的荷瘤裸小鼠（Balb/c,nu/nu）,瘤旁注射r-K4K5继续饲养,观察肿瘤生长变化。结果 r-K4K5抑制BCE细胞增殖,48～72h作用明显;r-K4K5处理的CAM组中直径小于50um的小血管明显减少;高剂量r-K4K5治疗的荷瘤裸小鼠组,平均瘤重与对照组比较有统计学意义。结论 r-K4K5能够抑制BCE细胞增殖,抑制鸡胚CAM新生血管生成,抑制实验性人SPC-A1肺腺瘤生长。     

人可溶性TRAIL蛋白诱导多种肿瘤细胞的凋亡

探讨原核表达的凋亡激活因子－人可溶性ＴＲＡＩＬ蛋白放导多种肿瘤,尤其实体瘤细胞凋亡的人作用及与Ｐ５３突变的关系。方法ＰＣＲ扩增人ＴＲＡＩＬ密码子１１４－２８１,ＪＦ１１２５大肠杆菌表达,复发并纯化该可溶性片段。免疫组织化学分析各细胞株Ｐ５３的突变。     

人心肌肌钙蛋白T基因的克隆

人心肌肌钙蛋白Ｔ基因的克隆陈海波官孝群宋钢宋后燕童步高诸骏仁心肌肌钙蛋白Ｔ（ｃａｒｄｉａｃｔｒｏｐｏｎｉｎＴ，ｃＴｎＴ）是心肌的特异性抗原，是急性心肌梗塞等严重心肌缺血的血清标志物之一，我们克隆人心肌肌钙蛋白Ｔ基因，并实现了在大肠杆菌中的表达，为最终...     

Angiostatin及其结构类似物在血管生成中的作用

Angiostatin及其结构类似物是一大类重要的内源性血管生成抑制因子 ,在机体生理、病理性血管生成的调节中起重要作用。对其结构及作用机制的深入研究将有助于新的具有临床应用价值的抗血管生成药物的研制     

人纤溶酶原K5区基因真核表达载体的构建和活性鉴定

目的 构建含人纤溶酶原K5区基因的真核表达载体，转染人乳腺癌细胞株MDA—MB—231，观察阳性克隆表达的K5蛋白对人脐静脉内皮细胞株ECV304和MDA—MB—231细胞增殖的影响。方法 应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5cDNA，所得的目的片段与真核表达载体pcDNA3重组，构建重组质粒poDNA3K5，脂质体法将其转染MDA—MB—231，G418筛选阳性克隆，PCR鉴定，RT-PCR和Western blot检测K5的表达。将鉴定正确的阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞，MTT、法检测其增殖情况，并用MTT法检测转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖的影响。结果 构建的重组质粒pcDNA3K5经酶切鉴定、测序正确，将其转染MDA-MB-231后挑取的阳性克隆有3个经PCR鉴定正确，并经RT-PCR和Western blot检测证实K5的表达。阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞后，其存活率降低；转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖无明显影响。结论 应用脂质体法将带有人纤溶酶原信号肽序列的K5cDNA转染MDA-MB-231细胞后，其分泌产生的有生物学活性的K5，呈现对ECV304细胞增殖的抑制作用，而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。     

t－PA指形区、上皮生长因子样区缺失突变体cDNA克隆的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

研究ｔ－ＰＡＦ区和ＥＧＦ区在ｔ－ＰＡ廓清中的作用。利用本室构建的ｔ－ＰＡｃＤＮＡ克隆，采用片段重组技术缺失突变指形区（Ｆ）、上皮生长因子样区（ＥＧＦ）和部分三角区（Ｋ１）（包括２－１０６氨基酸），组装了由逆转录病毒长末端重复顺序（ＬＴＲ）启动和终止的ｐＭＤＢ△ＦＥ表达质粒。该质粒转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，阳性克隆的培液中测得纤溶活性，大量培养阳性克隆细胞，从培液中初步纯化了表达产物。结果：以小白鼠为动物模型，测定突变体的血浆半衰期。与天然ｔ－ＰＡ相比，△ＦＥｔ－ＰＡ的半衰期延长６倍。结果表明ｔ－ＰＡＦ区和ＥＧＦ区在体内ｔ－ＰＡ廓清中有显著作用。     

纳豆激酶原的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的　构建纳豆激酶原基因克隆 ,实现其在大肠杆菌中的表达。方法　从纳豆芽胞杆菌中分离纯化基因组DNA ,作为模板通过PCR扩增纳豆激酶原基因。运用重组DNA技术 ,构建表达质粒pESX 1,转化大肠杆菌JF112 5 ,温度诱导表达目的蛋白。结果　琼脂糖凝胶电脉及核苷酸序列分析证实 pESX 1为含纳豆激酶原基因的阳性克隆。在大肠杆菌中表达纳豆激酶原 ,经自体加工产生具有纤溶活性的纳豆激酶。结论　成功地构建了纳豆激酶原基因克隆 ,实现了在大肠杆菌中的表达。     

人组织型纤溶酶原激活剂cDNA糖基化位点突变体的构建

构建人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｕｅｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ糖基化位点突变体，为ｔ－ＰＡｃＤＮＡ在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达系统中的表达提供条件。方法运用ＤＮＡ重组技术，构建ｐＡＨＲ、ｐＡＲＨ质粒，然后应用改良的寡核苷酸诱导定位突变技术，构建ｐＭＡＨＲ、ｐＭＡＲＨ质粒，并用限制性核酸内切酶鉴定、核酸序列分析证实。结果琼脂糖凝胶电泳显示了特异的片段，序列分析证实获得的ｐＭＡＨＲ为Ａｓｎ１１７和Ａｓｎ１８４位点突变的阳性克隆，ｐＭＡＲＨ为Ａｓｎ４４８位点突变的阳性克隆。结论成功地构建了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ糖基化位点突变体。     

人微小纤溶酶原活性中心丝氨酸突变体基因在毕赤酵母中的表达

用ＰＣＲ方法将编码人微小纤溶酶原（ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ,ｍＰｌｇ）活性中心Ｓｅｒ的密码子转换为Ａｌａ密码子,突变体ｃＤＮＡ与分泌型酵母表达载体ｐＨＩＬ－Ｄ８重组,构成受醇氧化酶基因（ＡＯＸ１）的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化ＧＳ１１５酵母菌,经表型筛选、ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,以甲醇诱导表达,ＭｍＰｌｇ分泌至培养液,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实。培养液经离心,上清与重组葡激酶（Ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ,Ｓａｋ）孵育后,以酪蛋白－琼脂糖平板溶圈法、发色底物法检测,ＭｍＰｌｇ未显示纤溶活性。此研究为制备Ｓａｋ．ｍＰｌｇ复合物的晶体提供了条件。