分泌型重组铜绿假单胞菌外毒素A基因工程菌的发酵研究

目的：优化重组铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)基因工程菌的发酵条件，实现PEA的高效表达。方法：构建PEA的原核分泌型基因工程菌，利用摇瓶发酵研究PEA工程菌的最优表达条件，并放大至3．75L发酵罐水平。结果：摇瓶发酵的最优培养条件为温度30℃，摇床转速160r／min，在含2g／L葡萄糖的LB培养液中培养至A600≈2．5时，以终浓度为100μmol／L的异丙基硫基半乳糖(IPTG)诱导表达5h。3．75L发酵罐发酵与摇瓶发酵相比，发酵周期缩短了约三分之一，PEA表达水平接近摇瓶中发酵水平，目标蛋白表达率达到了26．6％。结论：利用摇瓶最优表达条件，较好地实现了重组PEA从摇瓶到发酵罐的放大。     

培养条件对重组毕赤酵母高密度表达猪胰岛素前体的影响

研究了基因工程菌P ich ia p astotis高密度、高表达的培养条件。在全合成摇瓶培养基的基础上,考察了诱导过程中甲醇浓度、温度、pH、(NH4)2SO4及磷酸盐浓度等因素对猪胰岛素前体(P IP)表达的影响。研究表明:甲醇的最佳诱导浓度为6 g/L,过高或过低的甲醇浓度都不利于菌体生长和蛋白表达;在菌体生长和蛋白表达阶段,pH应分别控制在5.5和4.0;诱导阶段,培养温度下降到28°C,可以提高重组蛋白质的表达量。上述结果用于15 L全自动发酵罐实验,P IP表达水平达到了1.69 g/L,是摇瓶结果的17倍。     

重组人肝细胞生长因子β链工程菌的高密度发酵

目的　实现重组人肝细胞生长因子 β链 (rhHGFβ)工程菌的高密度高表达发酵。 方法　首先在摇瓶中进行了培养条件的摸索 ,确定了该工程菌的培养条件、诱导起始时间和诱导时间 ,然后用 15L自控发酵罐进行分批补料培养 ,发酵中分阶段限制性流加氮、碳源 ,保持溶氧在 30 %以上。结果　菌体发酵密度达到 39g/L(湿菌重 ) ,达到并超过了重组蛋白在摇瓶中的表达水平 ,重组蛋白的表达占菌体总蛋白的 30 %左右。结论　本研究为rhHGFβ进一步下游纯化及功能研究奠定了基础。     

高密度培养大肠杆菌表达重组人胰高血糖素样肽-1

目的:高密度发酵培养表达重组人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1).方法:将构建的重组质粒pGEX-hGLP-1转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达hGLP-1的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pGEX-hGLP-1.在500 ml三角摇瓶中进行了诱导条件的摸索实验,之后用5 L自控发酵罐对工程菌进行高密度培养,以获取hGLP-1和谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白(GST-hGLP-1).结果:采用分批培养和补料分批培养相结合的技术,控制碳源和氮源的补加,控制溶解氧的量,可使重组工程菌发酵光密度D600值达52,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白量的28％,其含量达到2.1 g/L.用ESI质谱鉴定hGLP-1相对分子质量与理论值一致.结论:本研究为大规模生产重组hGLP-1奠定了基础.     

用重组大肠杆菌生产rhG-CSF高密度发酵的方法

目的 :优化重组人粒细胞集落刺激因子 (recombinanthumangranulocytecolony stimulatingfactor,rhG CSF)的生产工艺 ,了解菌体生长和产物合成规律 ,为rhG CSF的工业化生产提供依据 .方法 :以摇瓶发酵的研究结果为基础 ,在 5L发酵罐中 ,测定工程菌rhG CSF的生长曲线 ,根据在不同pH值、溶氧和诱导时机时工程菌生长的情况 ,研究重组大肠杆菌DH5(/pBV2 2 0生产rhG CSF分批补料培养的工艺条件 ,确定 5L发酵罐稳定的发酵工艺参数 .结果 :培养工程菌的优化条件为 :发酵前期流加 2mol/L的氢氧化钠控制pH值为 7.2 ,当开始诱导表达时 ,控制pH为 6 .8;溶氧水平控制在 5 0 %以上 ;选择菌体在对数生长中期A60 0nm值为 1 2 .0进行诱导表达 .在此优化的培养条件下 ,菌体A60 0nm值达到 (2 1 .3± 0 .9) ,细胞干质量可达 (1 2 .3± 0 .7)g/L ,细胞湿体积质量为 (4 3.8± 0 .9)g/L ,rhG CSF的表达量为 (4 1 .9± 1 .6 ) % .结论 :pH值、溶氧和诱导时机等培养条件对工程菌生长和表达有显著影响     

重组呼吸道合胞病毒G蛋白基因工程菌的发酵条件研究

目的研究呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）G蛋白基因工程菌的发酵工艺。方法通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件和表达条件，以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件，对发酵丁艺进行改良优化。结果确定了RSVG蛋白基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合：在LB＋葡萄糖的培养基中，搅拌速度为200r／min，培养温度为37℃，pH值为7．0，诱导时温度为25℃，IPTG浓度为0．01mmol／L，优化后T程菌菌体的产量可以达到39．20g／L，目的蛋白表达率平均为18．1％。结论建立了稳定高效的重组RSVGT程菌发酵工艺。     

肽抗生素hPAB-β制备工艺中基因工程菌的改建

目的 通过重新构建新的3拷贝串联体基因工程菌phPAB-β(3)/M15,在原有肽抗生素hPAB-β制备工艺路线基础上,使发酵后目的肽的最终产量得到提高.方法 重新构建含有重组质粒pQE31-hPAB-β(3)的基因工程菌M15,然后筛选出能够稳定而且高效表达目标蛋白的最佳工程菌株,进行传代稳定性分析,并明确新建工程菌中目标融合蛋白的表达形式和亲和层析的效果,最后通过相同条件下,在逐步放大的发酵规模(1 L摇瓶,3.7 L和10 L发酵罐),与以往的3拷贝串联体工程菌phPAB-β(3)/JM109进行对比研究(湿菌产量、目标蛋白表达率),同时观察新建工程菌在10 L发酵中目标蛋白的表达和遗传稳定性.结果 筛选出的最佳工程菌株的目标蛋白的表达效率为34.8%,经LB培养传代10次后,点种LB(AMP、KAN)平板,生长率为100%,质粒保存率达100%.在1 L摇瓶,3.7 L和10 L发酵罐的发酵规模下,phPAB-β(3)/M15与phPAB-β(3)/JM109一样,目标融合蛋白都以包涵体形式表达,亲和层析效果相近,目标蛋白表达率无显著性差异(P＞0.05),但发酵产量大于后者,有非常显著性差异(P＜0.01).且新建工程菌在10 L发酵中发酵产量达到55.15g/L,诱导表达后的第5小时,蛋白表达达到高峰,蛋白表达率为30.2%,重组质粒保存率为100%.结论 新构 建工程菌phPAB-β(3)/M15比起原来基因工程菌phPAB-β(3)/JM109,是更为理想且利于肽抗生素hPAB-β工业生产的基因工程菌.     

重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)高密度发酵工艺研究

目的建立重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、培养温度、pH值、活化时间、诱导时间及分批补加营养物质等条件进行优化。结果采用改良M9-CA培养基、37℃活化4 h后以0.2 mmol/L IPTG诱导表达4 h,以甘油为碳源,在生长期和诱导期分别以40 ml/h和70 ml/h的速率连续流加补料,全程滴加氨水保持培养基pH值保持在7.5,调节转速控制溶解氧在40%左右。最终菌体产量提高至40 g/L以上,CR1-SCR15-18蛋白表达率达28%以上。结论高密度发酵工艺显著提高了工程菌的产量和CR1-SCR15-18蛋白的表达水平。     

重组胸腺素α1 pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌三角摇瓶培养条件的优化

目的对重组胸腺素α1pMAL-C2x-Tα1/TB1工程菌的培养条件进行优化。方法在摇瓶培养条件下探讨工程菌的生长和表达规律,对pMAL-C2x-Tα1/TB1菌种的培养基装量、接种量、诱导剂异丙基硫化半乳糖苷(IPTG)加入时间和浓度、诱导时间进行了实验和优化。结果由摇瓶培养获得的数据表明pMAL-C2x-Tα1/TB1最优培养条件为:10%接种量、100 mL LB培养基、37℃培养,接种后3 h,入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导4 h后目的蛋白表达量最高。结论优化的培养条件为菌种的发酵工艺奠定了基础。     

大肠杆菌分泌表达重组水蛭素Ⅲ的新方法研究

目的:在已有的分泌表达载体pTASH基础之上构建一种更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体,并检验其分泌表达水平是否提高。方法:提取原始质粒pTASH作为模板,用PCR扩增重组水蛭素基因表达盒片段以后,再插入到原表达载体pTASH的BamHⅠ位点上,从而产生含有两个串联的水蛭素基因表达盒单元的质粒p(TASH)2,转入大肠杆菌进行摇瓶表达。结果:双表达盒菌种p(TASH)2进行摇瓶水平的培养,其上清液抗凝血酶活性可达3 500 ATU.ml-1。结论:与单表达盒质粒pTASH的表达水平(2 000 ATU.ml-1)相比,双表达盒质粒p(TASH)2的摇瓶表达水平显著提高。     

重组人白细胞介素10的融合表达及鉴定

目的 研究重组人白细胞介素10(rhIL—10)载体在大肠杆菌B121(DE3)pLyse细胞中的表达，为进一步研究IL-l0在动脉粥样硬化中的作用机制奠定基础。方法 用构建成功的IL-l0—PCRT7/NT-TOPO质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞，并通过SDS-PAGE鉴定融合表达蛋白。结果 PCRT7/NT—TOPO质粒载体成功载入rhIL-l0基因；在异丙基硫代—β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。结论 在IPTG诱导下，重组的IL-l0—PCRT7/NT—TOPO质粒载体在大肠杆菌BL2l(DE3)pLyse细胞内成功表达。     

人DNMT3B1原核表达载体的构建和表达

目的构建人DNMT3B1原核表达载体,并进行初步表达。方法据Genebank中人DNMT 3B1 cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT 3B1,并将扩增产物克隆到原核表达载体PGEX-4T.3中,并对重组质粒进行鉴定。转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。结果 PCR扩增得到人DNMT 3B1的cDNA片段大小为2.6 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到原核表达载体PGEX-DNMT3B1I,PTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明目的蛋白在E.coli BL21（DE3）中高效表达,相对分子质量约为100 kd。结论成功构建了人DNMT3B1原核表达载体并完成其在E.coli BL21（DE3）中的诱导表达,为进一步在体外研究DNMT3B异构体提供了条件。     

ING4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化ING4蛋白，制备多克隆抗体。方法构建表达载体pET-21a（＋）-ING4，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳检测。结果构建的表达载体pET-21a（＋）-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现750bp左右的条带，测序结果正确，用IPTG诱导转化菌有30KD大小的目的条带，表达的目的蛋白占菌体总蛋白10％以上，以包涵体形式存在，纯化后其纯度可达70％以上。用纯化的ING4蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结论制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

人肌纤生成调节因子1融合蛋白在大肠杆菌的表达和抗体制备

目的研究人肌纤生成调节因子1(MR-1)的表达,获得MR-1蛋白,制备MR-1抗体,为MR-1生物功能研究提供基础.方法利用大肠杆菌质粒pGEX-5X-1、pET30a( )及pET24a( ),分别构建MR-1及其两端与不同标签序列融合的表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中比较N端和/或C端融合标签序列对该基因表达的影响.通过凝胶蛋白电泳及电洗脱制备目的蛋白,免疫家兔.酶联免疫吸咐试验(ELISA)和Western b1ot检测所制备抗体的滴度和免疫原性.结果利用GST或T7-tag序列在其N端融合,使MR-1在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到表达.利用所表达获得的MR-1-T融合蛋白,制备了针对此蛋白的多克隆抗体.ELISA检测所制备抗体滴度达到1:105,Western hlot显示所制备的多克隆抗体可用于检测天然细胞中的MR-1蛋白.结论MR-1蛋白需在N端与GST或T7-tag序列融合方可实现表达.利用在大肠杆菌表达纯化的蛋白所制备的抗体可用于MR-1生物学功能的研究.     

HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的 :HIV- 1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法 :1PCR法扩增的 HIV-1p17基因片段克隆至 p ET2 8c质粒 ;2重组质粒分别在大肠杆菌 BL 2 1、BL 2 1(DE3)、BL 2 1(DE3) plys S及 HMS174 (DE3)中表达 ;3用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白 ;4用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果 :重组质粒在 BL (DE3)中表达量最高 ,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32 % ,纯化后其纯度达 95% ,纯化蛋白可与 p17Mc Ab和 HIV- 1阳性血清发生特异反应。结论 :带有HIV- 1p17片段的重组质粒 p ET2 8c在大肠杆菌 BL2 1(DE3)中获得高效表达 ,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究 ;用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化蛋白 ,方法简便 ,蛋白丢失少 ,纯度高 ;纯化的重组蛋白 HIV- 1p17可用来临床早期诊断 HIV- 1感染者 ,同时可预测患者的临床进程。     

人胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)成熟肽基因的克隆及原核表达

目的分离人胶质细胞源性神经营养因子(hGDNF)成熟肽基因，并在E．coil中获得表达。方法以人的白细胞基因组DNA为模板，合成特异引物，采用PCR技术分离得到hGDNF成熟肽基因，并构建表达载体pET-21a( )-hGDNF，转化大肠杆菌BL21(DE3)，分别用IPTG和乳糖诱导表达，SDS-PAGE电泳检测hGDNF蛋白表达。结果PCR扩增出了400bp的DNA片段，构建的表达载体pET-21a( )-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现400bp左右的条带，测序结果正确，用IPTG或乳糖诱导转化菌均有15kd大小的目的条带，表达的目的蛋白占菌体总蛋白30％以上，以包涵体形式存在。结论克隆得到人GDNF成熟肽基因并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

一种合成人血小板因子4基因的简便有效方法

目的:用一种简便有效的方法合成hPF4基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达.方法:根据hPF4基因的序列,用touch-down PCR的方法合成hPF4基因,将合成的基因片断克隆到表达载体pCEX-4T-1中,构建了重组质粒pGEX-4T-1-hPF4,并将之转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达由谷胱甘肽转移酶和hPF4组成的融合蛋白.结果:用touch-down PCR的方法成功合成了hPF4基因.融合蛋白形成包含体,表达量约为全菌体蛋白的30%.结论:Touch-down PCR方法可作为合成其它目的基因的简便有效方法.BL21(DE3)/pGEX-4T-1表达系统能高效表达合成的hPF4基因,为下一步hPF4的纯化与生物学活性研究打下了基础.     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达与纯化

目的：表达和纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC，研究福氏志贺菌的致病机制。方法：将含有ipaC基因的pET32a-i-paC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21（λDE3），在异丙基硫代－β－D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达，对诱导后的表达产物进行SDS－PAGE鉴定，并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统来纯化目的蛋白。结果：诱导后的表达产物经SDS－PAGE发现有一相对分子质量约为63000的条带，其含量约占总蛋白量的11％，以350mmol/L咪唑洗脱液洗脱，目的蛋白纯度可达90％以上，结论：pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后，可稳定，高效地表达目的蛋白，QIA－expressionistTM蛋白纯化系统是一种简便，高效的纯化系统，可获得高纯度的目的蛋白。     

人乳头瘤病毒16L1-E5表达质粒的构建及其蛋白表达

目的构建人乳头瘤病毒16L1-E5的原核表达质粒,并进行表达融合蛋白,为下一步探讨该蛋白是否能作为疫苗的研究作准备。方法以本室已构建好的阳性质粒pET32（＋）／HPV16E5为模板,PCR获得E5基因,经SalI和NotI双酶切插入已构建好的pGEX4T-1／HPV16L1,通过筛选获得正确的阳性克隆pGEX4T-1／HPV16L1-E5。pGEX4T-1／HPV16L1-E5转化入BL21感受态细胞,经IPTG诱导进行目的蛋白的表达,通过测定不同时间、不同IPTG浓度和不同温度时目的蛋白表达情况,获得蛋白表达的最佳条件,SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白表达。结果成功构建了质粒pGEX4T-1／HPV16L1-E5,在1mmol／L IPTG、34℃、4h诱导获得最大量的目的蛋白表达。结论成功构建的pGEX4T-1／HPV16L1-E5质粒能表达出目的蛋白,为进一步研究目的蛋白功能打下了坚实的基础。     

人DNMT3B7原核表达载体的构建和表达

目的:构建人类DNA甲基转移酶(DNMT)3B7原核表达载体,并进行初步表达。方法:根据Genebank中人DNMT3B7 cDNA序列设计并合成特异性引物;提取HCT116细胞总RNA并进行反转录,利用PCR技术扩增出DNMT3B7;将扩增产物克隆到原核表达载体PGEX-4T.3中,并对重组质粒进行鉴定;然后将重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白。结果:PCR扩增得到人DNMT3B7的cDNA片段大小为1.1 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到原核表达载体PGEX-4T.3-DNMT3B7;IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示目的蛋白在E.coli BL21中高效表达,分子量约为40 kD。结论:成功构建了人DNMT3B7原核表达载体,完成了其在E.coli BL21中的诱导表达,为进一步在体外研究DNMT3B异构体提供了条件。