活性氧类物质对精子DNA的损伤及其检测

活性氧类物质（ROS）产生过多会破坏精子核内DNA的完整性，促进了一系列男性生殖功能的病理学改变。DNA损伤发生DNA断裂（DSBs）均可诱导H2AX的磷酸化（γH2AX）和簇集。近年来γH2AX识别抗体免疫荧光法是检测DNA双链断裂的热点之一。     

甲基硝基亚硝基胍诱导的一种全核γH2AX染色的特性研究

目的：明确甲基硝基亚硝基胍（MNNG）诱导的全核γH2AX所代表的DNA损伤的性质。方法：利用免疫荧光方法观察人羊膜FL细胞中MNNG诱导的γH2AX焦点的形成，中性彗星实验检测DNA双链断裂的形成，碱性彗星实验检测DNA单链、双链及其他类型损伤。结果：MNNG在10mg／L时能诱导一种特殊的全核染色，1mg／L时能在一部分细胞中诱导这种全核染色，但作用比较微弱。在这类细胞中中性彗星实验不能检测到明显的DNA双链断裂的形成，而碱性彗星实验能显示有DNA损伤的存在。结论：尽管γH2AX焦点被认为是DNA双链断裂的特异性标志，这种全核染色可能代表着另外类型的DNA损伤。     

两种处理方法对精子顶体完整性和DNA损伤的影响

目的研究上游法和密度梯度离心法处理对精液常规参数、顶体完整性及DNA损伤的影响。方法 90例男性精液标本用上游法和密度梯度离心法处理,检测处理前后精液常规参数、精子顶体完整率及精子DNA碎片指数。结果两种方法处理后,精子浓度明显下降（P〈0.01）,精子活率、活力明显提高（P〈0.01）;正常形态精子比例和顶体完整率显著提高（P〈0.05）,DNA碎片指数显著降低（P〈0.01）,两种处理方法比较差异无统计学意义。结论两种处理方法均可以使顶体完整精子比例较处理前明显提高,DNA损伤精子比例较处理前明显降低,但两法之间无统计学差异。两种处理方法均可以不同程度优化精液质量,实验室可根据精液情况选择处理方法。     

胃癌前病变内镜活检组织γH2AX蛋白的表达及意义

目的 探讨胃癌前病变内镜活检组织γH2AX蛋白的表达及意义.方法 应用流式细胞技术检测53例患者胃癌前病变组织中γH2AX蛋白的表达情况.结果 肠型化生和异型增生组织γH2AX蛋白的相对含量高于正常组织(P＜0.01);异型增生组织γH2AX蛋白的相对含量高于肠型化生组织(P＜0.05).结论 γH2AX蛋白在胃癌前病变组织中的表达反映了胃黏膜上皮细胞发生DNA双链断裂的情况,可能与胃癌前病变演变成胃癌的几率大小有关.     

精子的氧化损伤与线粒体解偶联蛋白2(UCP2)表达的关联性

目的 通过研究过氧化氢（hydrogen peroxide, H₂O₂）处理对精子活性氧的（reactive oxygen species,ROS）产生,精子运动参数,精子DNA碎片化程度及UCP2 蛋白表达的影响,探讨精子的氧化损伤与UCP2 蛋白表达的相关性。方法 采用密度梯度离心法处理精液,选取离心后的沉淀精子为研究对象,以终浓度分别为50μmol/L,100μmol/L和200μmol/L的过氧化氢处理精子¹H,同时设立对照组（0μmol/L）。流式细胞仪检测各组精子活性氧（ROS）含量;计算机辅助精液分析系统（CASA） 分析各组精子运动参数;精子染色质结构分析试验（SCSA）检测精子DNA碎片化程度;Western blot法检测各组UCP2蛋白的表达情况。分析精子的氧化损伤与UCP2表达的关联性。结果 随着过氧化氢作用浓度的增加,各处理组的ROS含量,DNA碎片化程度和UCP2蛋白的表达均存在增加,且与对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）;同时各处理组精子运动参数等均呈下降趋势,尤其是100μmol/L和200μmol/L组,除侧摆幅度参数外,其他参数与对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 过氧化氢作用后对精子造成氧化损伤（ROS升高）,导致精子运动参数下降和DNA碎片化程度增加,对应的UCP2 蛋白表达的增加,证明精子的氧化损伤与UCP2 蛋白的表达存在关联性,提示UCP2可能参与精子体内的抗氧化作用。     

AGGF1在结直肠癌细胞DNA损伤修复及化疗敏感性中的作用

目的研究血管生成因子AGGF1在人结直肠癌细胞DNA损伤修复及化疗抵抗中的作用及机制。方法顺铂诱导结直肠 癌细胞株HCT116 细胞DNA损伤模型,运用siAGGF1 及siNC 转染结直肠癌细胞干扰AFFF1 的表达。Western blot 实验检测 AGGF1、γH2AX基因表达水平,免疫荧光法检测顺铂诱导HCT116细胞DNA损伤（双链断裂）后,γH2AX和AGGF1在损伤位点 的募集情况;MTS法检测损伤细胞的增殖情况;免疫组织化学方法检测结直肠癌及癌旁正常组织中AGGF1的表达水平。结果 Western blot结果显示顺铂处理HCT116细胞明显下调AGGF1表达,干扰AGGF1的表达抑制了γH2AX和NBS1;免疫荧光实 验表明AGGF1和γH2AX共定位,细胞增殖实验表明结直肠癌细胞对化疗的敏感性增加（P<0.01）;AGGF1在结直肠癌组织中表 达高于相应癌旁组织（P<0.01）,表明其可能与肿瘤的恶性表型相关。结论下调AGGF1基因可抑制结直肠癌细胞的DNA损伤 修复,提高其对化疗的敏感性,机制上可能与NBS1磷酸化相关。     

γ-H2AX与肿瘤治疗

DNA双链断裂后可诱导位于丝氨酸-139位C端保守区域内的H2AX磷酸化形成γH2AX,组蛋白H2AX在DNA损伤修复、细胞周期检查点调控、基因组稳定的维持和肿瘤抑制中起着重要作用。随着研究的不断深入,其在医学中的应用将越来越广泛。     

石英粉尘的DNA损伤作用研究

目的探讨石英粉尘对DNA的损伤作用。方法分析某矿山井下和井上,接触不同游离SiO2含量粉尘的工人尘肺发病率。用0、100、200、400μg/mL标准α石英刺激人胚肺成纤维细胞,采用免疫荧光技术检测H2AX磷酸化(γH2AX)水平作为DNA双链断裂损伤程度的指标。结果井下粉尘的游离SiO2含量高于井上,井下工人尘肺发病率(12.15%)高于井上(3.74%),差异有统计学意义(P﹤0.05)。γH2AX水平随石英剂量增高呈增高趋势,半定量结果分别为(521.9±233.1)、(823.3±201.5)、(1 375.5±311.5)、(1 545.6±145.7);差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结论石英粉尘可引起DNA双链断裂,且存在剂量效应关系。     

3种精子优化处理方法处理精液效果评价

目的：为了解上游法、Percoll梯度离心法、Isolate密度梯度离心法等精子优化处理方法处理精液的效果。方法：选取120例女性原因引起继发不孕的夫妇,将男方的精液标本按处理方法不同随机分4组,即为上游组、Percoll组、Isolate组和对照组,应用指标精子密度、a＋b级活力、正常形态率和绿色荧光精子百分率,对精液处理后的效果进行比较。结果：上游组、Percoll组和Isolate组,富集的精子a＋b级活力、正常形态率、绿色荧光精子明显高于对照组（P〈0.01）,Percoll组和Isolate组的精子密度与对照组无明显差异（P〉0.05）,但上游组的精子密度很明显低于对照组（P〈0.01） 上游组、Percoll组及Isolate组之间比较,富集的精子a＋b级活力、正常形态率没有明显差异（P〉0.05）,但精子回收Percoll密度梯度离心法和Isolate密度梯度离心法明显高于上游法（P〈0.01）,Isolate密度梯度离心法富集绿色荧光精子最多,上游法次之,Percoll密度梯度离心法最低。结论：Isolate密度梯度离心法处理精液效果较好。     

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白不同片段对胃癌细胞γH2AX表达的影响

目的 探讨幽门螺杆菌(H.pylori)细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白不同片段对胃癌细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)表达的影响.方法 取前期分离的H.pylori东亚株GZ7及其CagA敲除株H.pylori GZ7ΔCagA感染的癌细胞株AGS,采用免疫荧光方法检测DNA双链断裂标志物γH2AX的表达;构建...     

DNA-PKcs在DNA双链断裂应答过程中对H2AX磷酸化起主导作用

目的 研究在DNA双链断裂(double strand break,DSB)情况下,DNA-PKcs和ATM在磷酸化H2AX中所发挥的作用.方法 在HeLa细胞中,以高效的DNA双链断裂诱导剂新制癌菌素(neocarzinostatin,Ncs)诱导DSB形成,Western blot分析H2AX磷酸化的时间,剂量依赖及其去磷酸化的动态变化.DNA-PKcs抑制剂NU7026及ATM抑制剂Ku55933分别作用细胞,Western blot检测其对H2AX磷酸化的影响.以α-satellite序列为对象,γ-H2AX CHIP检测DNA-PKcs或ATM抑制前后H2AX磷酸化情况,得出定量数据.结果 γ-H2AX生成呈Ncs作用时间及剂量依赖过程.Ncs短时间作用后,γ-H2AX能够去磷酸化恢复.抑制DNA-PKcs明显影响γ-H2AX生成,而抑制ATM使得γ-H2AX生成高峰延迟.CHIP显示抑制DNA-PKcs后其DNA富集倍数仅为抑制前的27％,而抑制ATM后其富集倍数为抑制前的63％.结论 DNA-PKcs可能在DNA双链断裂应答过程中对H2AX磷酸化起主导作用.     

SIRT1增强青光眼小梁网细胞DSBs修复能力及抗细胞衰老的研究

目的 研究Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶SIRT1与青光眼小梁网细胞（GTM）DNA双链损伤（DSBs）修复能力及细胞衰老之间的关系。方法 首先通过RT-PCR和Western blot检测正常小梁网细胞（HTM）与GTM之间SIRT1表达的差异;然后将HTM、GTM细胞分别分为4组,白藜芦醇组（0.5 μmol/L Res干预24 h）、SIRT1-ShRNA组（构建成功的SIRT1干扰质粒转染细胞）、microRNA34a组（构建成功的microRNA34a表达质粒转染细胞）以及Control组,通过Western blot检测各组细胞中SIRT1表达水平的差异;SA-β-Gal衰老染色检测连续生长10 h、32 h、3 d、6 d后各组细胞的衰老变化;中性彗星电泳检测经1.33 mol/L H2O2液处理0 h、2 h时各组细胞中DNA双链损伤情况;Western blot检测1.33 mol/L H2O2液处理0 h、1 h、2 h后,各组细胞中γ-H2AX表达的变化情况。结果 HTM及GTM细胞中均存在SIRT1的表达,且HTM中的表达要高于GTM;HTM、GTM细胞各组内比较发现,SIRT1蛋白的表达水平呈Res组＞Control组＞microRNA34a组＞SIRT1-ShRNA组趋势;SA-β-Gal衰老染色则发现在相同时间点,GTM细胞的衰老程度均高于HTM细胞,而在同一类细胞中,SIRT1-ShRNA组细胞最先表现出衰老,且随着时间的延长,其衰老程度也最为严重,Res干预细胞24 h后,能明显延缓细胞衰老。中性彗星电泳检测表明经氧化剂处理后,GTM组双链DNA的损伤情况比HTM组严重,并呈现出SIRT1-ShRNA组>microRNA34a组>Control组>Res组的趋势,γ-H2AX表达量的检测结果与中性彗星电泳的结果一致。结论 SIRT1表达活性的下调可能是诱发青光眼的因素之一;Res能显著增强HTM细胞中SIRT1的表达活性,上调的SIRT1能促进HTM细胞DNA双链损伤修复的能力,维持细胞基因组的稳定性,进而减缓细胞的衰老。     

不育症患者精子质量与精子DNA碎片及血清微量元素、常量元素关系的研究

目的探讨精子质量、精子碎片及血液中微量元素、常量元素含量的关系,为男性不育的诊断和治疗提供理论依据。方法对500例不育患者行精液常规分析,并检测精子DNA损伤情况及血清中微量元素、常量元素的含量,计算DNA碎片指数（DFI）,分析精子DFI及血清元素与精液指标的关系。结果DFI与精子密度、正常精子形态率、精子总活动率、A、B级精子比例、直线速度、曲线速度、平均路径速度和侧摆幅度均呈负相关关系（p〈0．05）,DH与D级精子比例呈正相关关系（P〈0．05）。血锌含量与精子活率、直线运动精子活率呈负相关关系（P〈0．05）;镁含量与精子活率、直线运动精子活率、平均路径速度呈显著负相关（P〈0．05）;铅含量与侧摆幅度呈显著正相关关系（P〈0．05）。结论不育症患者血清中元素含量与精液参数密切相关。精子DNA损伤对男性精子质量有一定的影响,其可作为男性不育症诊疗的一个新指标。     

工频磁场对人晶状体上皮细胞DNA双链断裂的影响

目的:采用γH2AX免疫荧光法观察工频磁场对人晶状体上皮细胞DNA双链断裂的影响.方法:将人晶状体上皮细胞暴露于0.4 mT、50 Hz工频磁场2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,以0.1 μmol/L的DNA损伤剂4-硝基喹啉-1-氧化物作用1 h作为阳性对照,结束处理后进行γH2AX免疫荧光检测.计算细胞平均焦点数.将细胞平均焦点数及焦点阳性细胞率作为评价细胞DNA双链断裂程度的指标.结果:工频磁场暴露24 h的平均焦点数、γH2AX焦点阳性细胞率分别为(2.93±0.43)、(27.88±2.59)%,与假辐照组(1.77±0.37)、(19.38±2.70)%相比,差异具有显著性(P<0.05);工频磁场暴露48 h的平均焦点数、γH2AX焦点阳性细胞率分别为(3.14±0.35)、(31.00±3.44)%,与假辐照组相比,差异具有显著性(P<0.01);而工频磁场暴露2 h分别为(2.11±0.61)、(22.44±5.09)%,6 h分别为(2.18±0.47)、(22.59±3.08)%和12 h分别为(2.35±0.43)、(23.35±2.93)%,与假辐照组比较,差异没有显著性(P>0.05).结论:体外实验表明,0.4 mT工频磁场长时间辐照可以使人晶状体上皮细胞DNA双链断裂增加.     

男性不育患者精液活性氧对精子DNA损伤的研究进展

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是当今医学领域新出现的研究热点,与体内许多病理生理现象有关.近年来ROS在男性生殖中的作用也越来越受到人们的重视.精液中的ROS在高浓度时对精子质量和功能有较大的毒害作用.精液和精子细胞中过量的ROS引起精子活力和活率降低,精子畸形率增加.在一些不育男性的精液中检测到高浓度的ROS,ROS的过量产生不仅破坏精子质膜的流动性,而且损伤精子核内DNA的完整性.精子DNA的损伤与男性不育有直接关系,精子DNA的损伤关系到子代和亲代2代的健康.因为精子生成过程是一种多基因的连续或调控,任何一个环节受到损害均可使以后的基因表达受损,从而导致精子功能缺陷引起男性不育.故探讨ROS与精子损伤的关系对进一步研究及预防男性不育有重大意义.     

不同程度精索静脉曲张患者精液质量及精子形态分析

目的观察不同程度精索静脉曲张（VC）患者精液质量及精子形态。方法121例VC患者分为I、Ⅱ、Ⅲ度共3组,其精液按WHO标准常规分析并对精子形态进行评价,23例健康男性精液检查结果作为对照。结果不同程度VC患者与对照组比较,精液各项常规指标及正常形态精子百分率均下降（P〈0．01）,畸形精子中,小头、锥形头和无定形头精子均增多（P〈0．01,P〈0．05,P〈0．01）。不同程度VC患者间比较,常规检查各项指标无明显差异（P〉0．05）,形态检查Ⅲ度VC组正常形态精子百分率低于Ⅱ度VC组（P〈0．01）,而Ⅱ度VC组与I度VC组差异无统计学意义（P〉0．05）。具体畸形精子类别比较,Ⅲ度VC组的无定形精子百分率明显高于Ⅱ度VC组（P〈0．01）。结论精液常规检查不能区分不同程度VC对精液损害的影响,而精子形态检查可反映不同程度VC患者的精子状态。因此,VC患者不但应行精液常规检查还应行精子形态检查。     

男性生殖道Uu感染对精液主要参数及精液DNA碎片率的影响

目的:探讨解脲脲原体(Uu)感染对精子主要参数和精子DNA碎片率(DFI)的影响。方法:选取2021年1－8月九江市妇幼保健院男科收治的男性不育患者758例,根据患者是否感染Uu将其分为男性不育无Uu感染组(A组)和男性不育伴Uu感染组(B组,10;copies/ml),另选取412名已生育的男性健康体检者(C组),用PCR仪定量检测Uu含量,用染色质扩散法检测DFI,同时以精子质量检测分析系统(CASA)对精液的相关参数进行分析处理。结果:A组的精液p H值、精子浓度、DFI与B组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05);A组的精子活力显著高于B组(P<0.05)。结论:男性生殖道Uu感染会对患者精液质量造成影响,主要方面为抑制精子活力,从而导致男性不育症的发生,因此临床需要给予更多的关注,并及早处理,从而早日帮助患者获得子代。     

PRM 2 G398C多态性与386例汉族男性生育力的相关性研究

目的：研究鱼精蛋白2（PRM2）基因 G398C多态性与汉族男性生育力的相关性。方法选取386例原发不育男性患者为观察组,255例生育男性为对照组,分别分析两组常规精液参数及DNA 完整性、核蛋白成熟度等精子功能参数,采用DNA测序技术对PRM 2 G398C位点进行基因分型,统计该多态性位点与男性不育发病率的关系。结果不育患者 PRM 2 G398C位点CC基因型频率（11．92％）高于生育男性（6．67％）,分析显示CC基因型与男性不育的遗传易感性明显相关（OR＝2．002,95％CI＝1．097～3．653,P＜0．05）。CC基因型可使精子DNA完整性、核蛋白成熟度等精子功能参数明显下降,可能是其导致男性不育的主要因素。结论 PRM 2 G398C多态性改变与汉族男性生育力相关。     

以精子 DNA 碎片化指数辅助精液参数评估男性生育力

目的：研究精子 DNA 碎片化指数（DFI）与精子正常形态率、诱发顶体反应率等精液参数的相关性,探讨其在评估男性生育力方面的临床应用价值。方法收集787例男性不育症患者的精液标本,采用计算机辅助精液分析系统（CASA）分析精液常规参数;运用 Diff －Quick 染色法分析精子形态,严格参照《WHO 人类精液检验与处理实验室手册》（第5版）标准;采用钙离子载体 A23187诱导精子发生顶体反应（AR）;采用 SCD 法检测精子DNA 碎片化程度。按 DFI 值分为 DFI≤30％和 DFI ＞30％两组,对 DFI 与各项精液参数的相关性进行分析。结果精子总活动率、前向运动率、正常形态率和顶体反应率随 DFI 值的升高逐渐减低,各组间差异均有统计学意义（P ＜0．05）;DFI 与精子总活动率、前向运动率、正常形态率以及诱发顶体反应率均呈显著负相关（P ＜0．05）,与精液量无显著相关。结论精子 DNA 损伤可导致精子前向运动力下降、形态学异常和诱发 AR％降低,精子 DFI 是评估男性生育力的一个较好的参考指标。     

精子形态分析在男性不育诊断中的临床应用

目的探讨精子形态染色技术在男性不育诊断中的临床应用。方法已生育健康男性精液标本对照组40例、不孕组男性患者精液200例,精液经处理后涂片,用WHO推荐的改良巴氏染色法对精子进行形态染色,计数正常及异常形态精子,并计算精子正常形态的百分率和多重精子缺陷指数。结果对照组精液标本中精子正常形态率为40.85%,不孕组精子正常形态率为10.53%,显著低于对照组,两组相比有极显著性差异（P〈0.01）。结论精子形态染色在临床男性不育的诊断中占有重要地位。精子形态学染色对男性不育患者的诊治有很大帮助,有助于临床为不孕患者选择助孕方式,为有不良孕产史夫妇查找病因,作为临床诊治的依据。