γH2AX与男性不育患者精子DNA 损伤的关系及意义

目的：研究γH2AX在男性不育患者精液中的表达水平,探讨γH2AX用于评价男性不育患者精子DNA双链断裂（DSBs）损伤程度的可行性。方法选取就诊于广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心、男性科门诊并确诊为男性不育患者27例（男性不育组）,另外选取23例确认有生育能力的健康男性的精液样本作为对照组。通过 PureSperm 密度梯度离心法（DGC）优选精子,运用单向凝胶电泳技术（SCGE）和流式细胞术方法对健康男性、男性不育组患者的精液进行精子双链DNA损伤和γH2AX含量的测定和比较。结果男性不育组患者精子DSBs损伤程度和γH2AX表达含量均高于对照组（P＜0．01）,而经密度梯度离心法优选精子后,两组男性精子的DSBs损伤程度和γH2AX表达含量均显著下降（P＜0．01）。结论γH2AX在男性不育患者精子中的含量明显高于健康男性,可作为检测精子DNA双链断裂损伤程度的一个新的标志物。     

S期H1299细胞热损伤后的延迟性DNA双链断裂

目的研究S期细胞热损伤后DNA双链断裂形成规律,以阐明S期细胞热敏感原因,并分析DNA双链断裂延迟性形成的 可能机制。方法流式细胞术分析热损伤后细胞周期阻滞;EdU掺入实验检测DNA复制能力;血清饥饿法同步H1299细胞周 期;中性彗星实验动态观察热损伤后DNA双链断裂形成;台盼蓝拒染实验研究热损伤后细胞存活率;蛋白免疫印记实验检测 ATM磷酸化及DNA结合RAD18情况。结果流式结果显示H1299细胞经45 ℃热损伤1 h后S期细胞较未加热组明显增多（P< 0.01）;热损伤后EdU阳性率随时间变化趋势同S期比例变化;S期细胞热损伤后需经37 ℃正常孵育一定时间方可观察到“彗星 拖尾”现象,且随着正常孵育时间延长,反映DNA双链断裂的尾力矩值越大;台盼蓝拒染实验显示S期细胞受热后7.5 h内死亡 率保持较低水平,之后细胞死亡加速;热损伤后ATM磷酸化先增多后减少,热损伤导致DNA结合RAD18明显减少。结论细 胞热损伤后可发生S期阻滞,阻滞期间因复制继续、DNA损伤修复抑制而延迟形成的致死性DNA双链断裂是S期细胞热敏感 的可能原因。     

沉默Ku70后PARP1参与DNA双链断裂修复

目的研究碱基切除修复途径(base excision repair,BER)关键因子PARP1在Ku70缺失的条件下是否参加DNA双链断裂(double-strand break,DSB)的修复。方法针对人类Ku70构建编码shRNA序列的重组表达载体并转染细胞,建立Ku70蛋白表达沉默的细胞株。以高效的DNA双链断裂诱导剂刺孢霉素calicheamycin诱导DSB形成,在Ku70沉默或联合PARP1抑制剂条件下,通过结晶紫染色法检测DSB对细胞存活率的影响,以及Western blot检测H2AX的磷酸化状态。根据与染色质相互作用的差别,分段提取细胞蛋白组分,Western blot检测PARP1在各组分的分布变化。结果细胞Ku70蛋白水平在Ku70 shRNA干扰后显著下调。Ku70沉默和PARP1抑制剂明显降低细胞在calicheamycin处理后的存活率(P<0.01),两者有明显协同效应。在Ku70沉默的细胞诱导DSB后,PARP1主要分布在与染色质紧密结合的组分。结论在Ku70缺陷时,PARP1可与染色质结合,且抑制其功能影响细胞生存,说明PARP1可能参与了不依赖于Ku的DNA双链断裂修复的替代途径。     

H2AX参与白血病细胞诱导NK细胞凋亡的研究

目的 初步探讨H2AX磷酸化水平是否参与白血病细胞系诱导自然杀伤(NK)细胞凋亡.方法 体外培养 NK92细胞,利用Fas激活性抗体CH11作用于NK92细胞,用流式细胞术检测NK92细胞的凋亡情况;检测NK92细胞凋亡的同时用流式细胞学技术检测H2AX磷酸化的水平.结果 随着CH11浓度(0、2.5、5、10、20 μg/ml)的升高, NK92细胞凋亡现象明显增加,并呈剂量依赖性,表明NK细胞凋亡随着CH11浓度的升高而增加;同时H2AX的磷酸化水平也随CH11浓度(0、5、10、40、80 μg/ml)逐步增高,并呈剂量依赖性,提示H2AX的磷酸化作用参与细胞凋亡过程,并且随浓度的增加而增加.结论 H2AX的磷酸化作用参与白血病细胞诱导NK细胞的凋亡过程.     

一氧化氮对辐射诱导的肿瘤细胞凋亡和DNA双链断裂的双向性影响

目的观察不同浓度的一氧化氮在不同p53基因状态的肿瘤细胞中对射线导致的细胞凋亡和DNA双链断裂的双向性影响。方法 2009年6月—2010年6月于第四军医大学放射医学实验室进行实验。选用p53缺如人非小细胞肺癌H1299细胞,稳定转染野生型p53(wtp53)或突变型p53(mp53)基因,得到H1299/wtp53或H1299/mp53细胞。细胞内质粒载体的稳定表达由RT-PCR和限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)法检测。细胞先于含不同浓度硝酸异山梨酯(ISDN)的培养基中培养,然后接受X线照射。照射后细胞凋亡和γH2AX分别由Hoechst33342染色法和流式细胞术测定。Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果在H1299/wtp53和H1299/mp553细胞中,在p53基因7号外显子RT-PCR的产物中可观察到清晰的110 bp条带。p53基因7号外显子用MspI或Bsr1限制性内切酶特异性消化后,相应地在H1299/wtp53或H1299/mp53细胞中,可以观察到清晰的70 bp条带。在H1299/wtp53细胞中,低浓度的ISDN(5μmol/L)可显著降低X线辐射诱导的凋亡和DNA双链断裂,而高浓度的ISDN(500μmol/L)却显著升高X线辐射诱导的凋亡和DNA双链断裂。而且,一氧化氮对辐射导致的Caspase-3和Bax介导的凋亡有双向性的影响。但是,对于上述浓度的ISDN,并没有在H1299/mp53细胞中观察到这些现象。结论在肿瘤细胞中,不同浓度的一氧化氮可双向性影响辐射导致的Bax和Caspase-3介导的凋亡以及DNA双链断裂的变化,并且一氧化氮可通过p53基因表达调控来影响细胞的命运。     

苦参碱通过P38通路调节H2AX磷酸化抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移

目的 探讨苦参碱对宫颈癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响及其可能的分子机制。方法 不同浓度苦参碱作用于宫颈癌细胞,通过CCK8法,EdU法、流式细胞术、Transwell实验、划痕实验检测细胞的增殖、凋亡、迁移能力。利用Western印迹法检测苦参碱对H2AX磷酸化蛋白（即γH2AX）、P38磷酸化蛋白（即pP38）水平的影响。通过干扰H2AX（Ser139）位点的磷酸化,检测苦参碱对宫颈癌细胞增殖、迁移的影响。通过干扰P38磷酸化,检测苦参碱对H2AX磷酸化的影响。结果 苦参碱对宫颈癌细胞体外增殖具有显著抑制作用（P<0.05）,且呈药物浓度依赖性;苦参碱显著提高细胞凋亡率,而对迁移能力具有显著抑制作用（P<0.05）;苦参碱能够显著促进γH2AX及pP38蛋白的表达（P<0.05）,且呈浓度依赖性。H2AX（Ser139）位点的磷酸化是苦参碱发挥抑增殖和迁移的作用位点。苦参碱通过P38通路调控H2AX（Ser139）位点的磷酸化。结论 苦参碱抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移,诱导细胞凋亡,可能是通过调控P38通路使H2AX（Ser139）位点磷酸化发挥对宫颈癌的抑癌作用。     

DNA双链断裂与同源重组修复的研究进展

DNA双链断裂（DSB）是细胞受到电离辐射后最严重的DNA损伤,导致细胞凋亡、细胞周期阻滞以及DNA损伤修复。DNA损伤发生后,激活细胞内DNA损伤应答,启动DSB修复通路同源重组（HR）和非同源重组末端连接（NHEJ）。HR修复分为联会前期、联会期和联会后期,以姐妹染色单体为模板,进行无错误修复,是保护基因组完整性的主要机制。对IR导致的DSB HR和NHEJ具有互补关系,G2和S期HR是主要修复方式。HR是肿瘤发病风险、预后指标和治疗靶点,合成致死是HR用于肿瘤靶向治疗的重要机制。本文主要对DSB修复过程中所涉及HR修复通路中的分子机制、合成致死概念及其与NHEJ修复的关系作一综述,并探讨其成为转化医学研究和潜在临床应用的可能性。     

γ-H2AX的表达对初诊多发性骨髓瘤患者的预后影响

目的 探讨初诊多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓中γ-H2AX的表达水平及其与患者预后的关系.方法 选择该院初诊的MM患者为病例组,非造血系统肿瘤并经骨髓涂片和活检检查未见明显形态异常者为对照组.采用免疫组织化学染色检测病例组和对照组骨髓中γ-H2AX的表达水平,IPP半定量分析并比较其表达差异,并根据病例组γ-H2AX的表达量将其分为强表达和弱表达两组,探究γ-H2AX表达量与MM患者预后的关系.结果 病例组患者骨髓中γ-H2AX表达显著高于对照组(P＜0.05);且强表达组MM患者γ-H2AX的表达水平明显强于弱表达组(P＜0.05).结论 γ-H2AX在MM患者的骨髓组织中表达水平增多,其强表达预示MM患者较短的生存时间.     

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白不同片段对胃癌细胞γH2AX表达的影响

目的 探讨幽门螺杆菌(H.pylori)细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白不同片段对胃癌细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)表达的影响.方法 取前期分离的H.pylori东亚株GZ7及其CagA敲除株H.pylori GZ7ΔCagA感染的癌细胞株AGS,采用免疫荧光方法检测DNA双链断裂标志物γH2AX的表达;构建...     

沉默Ku70促进PARP1、ligase3和XRCC1在DNA双链断裂染色质聚集

目的 研究碱基切除修复途径(base excision repair,BER)关键因子PARP1、ligase3和XRCC1在Ku70缺失的条件下与DNA双链断裂(double-strand break,DSB)所在染色质的结合及抑制PARP1所产生的影响.方法 采用可经药物诱导Ku70 shRNA的细胞株,以高效的D...     

甲基硝基亚硝基胍诱导的一种全核γH2AX染色的特性研究

目的：明确甲基硝基亚硝基胍（MNNG）诱导的全核γH2AX所代表的DNA损伤的性质。方法：利用免疫荧光方法观察人羊膜FL细胞中MNNG诱导的γH2AX焦点的形成，中性彗星实验检测DNA双链断裂的形成，碱性彗星实验检测DNA单链、双链及其他类型损伤。结果：MNNG在10mg／L时能诱导一种特殊的全核染色，1mg／L时能在一部分细胞中诱导这种全核染色，但作用比较微弱。在这类细胞中中性彗星实验不能检测到明显的DNA双链断裂的形成，而碱性彗星实验能显示有DNA损伤的存在。结论：尽管γH2AX焦点被认为是DNA双链断裂的特异性标志，这种全核染色可能代表着另外类型的DNA损伤。     

Expression of histone H2AX phosphorylation and its potential to modulate adriamycin resistance in K562/A02 cell line

DNA repair processes play a role in the development of drug resistance which represents a huge obstacle to leukemia chemotherapy. Histone H2AX phosphorylation (ser139) (γH2AX) occurs rapidly at the onset of DNA double strand break (DSB) and is critical to the regulation of DSB repair. If DNA repair is successful, cells exposed to anti-neoplastic drugs will keep entering the cycle and develop resistance to the drugs. In this study, we investigated whether γH2AX can be used as an indicator of tumor chemosensitivity and a potential target for enhancing chemotherapy. K562 and multi-drug resistant cell line K562/A02 were exposed to adriamycin (ADR) and γH2AX formed. Flow cytometry revealed that percentage of cells expressing γH2AX was increased in a dose-dependent manner and the percentage of K562/A02 cells was lower than that of K562 cells when treated with the same concentration of ADR. In order to test the potential of γH2AX to reverse drug resistance, K562/A02 cells were treated with PI3K inhibitor LY294002. It was found that LY249002 decreased ADR-induced γH2AX expression and increased the sensitivity of K562/A02 cells to ADR. Additionally, the single-cell gel electrophoresis assay and the Western blotting showed that LY249002 enhanced DSBs and decreased the expression of repair factor BRCA1. These results illustrate chemosensitivity can partly be measured by detecting γH2AX and drug resistance can be reversed by inhibiting γH2AX.     

DNA damage response in resting and proliferating peripheral blood lymphocytes treated by camptothecin or X-ray

DNA damage response (DDR) in different cell cycle status of human peripheral blood lymphocytes (PBLs) and the role of H2AX in DDR were investigated. The PBLs were stimulated into cell cycle with phytohemagglutinin (PHA). The apoptotic ratio and the phosphorylation H2AX (S139) were flow cytometrically measured in resting and proliferating PBLs after treatment with camptothecin (CPT) or X-ray. The expressions of γH2AX, Bcl-2, caspase-3 and caspase-9 were detected by Western blotting. DDR in 293T cells was detected after H2AX was silenced by RNAi method. Our results showed that DNA double strand breaks (DSBs) were both induced in quiescent and proliferating PBLs after CPT or X-ray treatment. The phosphorylation of H2AX and apoptosis were more sensitive in proliferating PBLs compared with quiescent lymphocytes (P<0.05). The expression levels of anti-apoptotic proteins Bcl-2 were reduced and cleaved caspase-3 and caspase-9 were increased. No significant changes were observed in CPT-induced apoptosis in 293T cells between H2AX knocking down group and controls. It was concluded that proliferating PBLs were more vulnerable to DNA damage compared to non-stimulated lymphocytes and had higher apoptosis rates. γH2AX may only serve as a marker of DNA damage but exert no effect on apoptosis regulation.     

Prognostic significance of γ-H2AX in laryngeal squamous cell carcinoma after surgery

Background The clinical significance of Y-H2AX in laryngeal squamous cell carcinoma （LSCC） has not yet been established. This study was performed to assess the expression of nuclear y-H2AX in benign and malignant laryngeal lesions and to assess its clinicopathological significance. Methods A total of 70 LSCC tumor-normal tissue paired samples were evaluated for y-H2AX expression using immunohistochemical staining. Their expression was correlated with different clinicopathological parameters. Results Nuclear Y-H2AX expression was frequently detected in LSCC tissues （P 〈0.001）. High nuclear Y-H2AX levels were not associated with any clinicopathological characteristics of LSCC （P 〉0.05）. Univariate Kaplan-Meier analysis showed that positive nuclear Y-H2AX expression was associated with a decreased overall survival （P=0.017）. Multivariate Cox regression analysis showed that nuclear Y-H2AX expression was an independent risk factor for overall survival. Conclusion The expression of nuclear Y-H2AX might be closely related to the prognosis of LSCC. Chin Med J 2014;127 （14）： 2664-2667     

辐射增敏剂AK2123和辐射防护剂WR2721对受照人肝癌细胞DNA双链断裂与修复的影响

目的：探讨辐射增敏剂ＡＫ２１２３和辐射防护剂ＷＲ２７２１对肝癌细胞ＤＮＡ损伤与修复的影响．方法：用脉冲交变电泳法（ＰＦＧＥ）和￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入法，测定上述两药物对受照人肝癌细胞ＤＮＡ双链断裂（ｄｓｂ）与修复及ＤＮＡ合成的影响．结果：在０～８０Ｇｙ剂量范围内，随着照射剂量增加，肝癌细胞ＤＮＡ残留率逐渐降低（１００％～５７．０％），ＤＮＡｄｓｂ量亦逐渐增多，照前给ＡＫ２１２３或ＷＲ２７２１，均能显著地降低ＤＮＡ残留率，使ＤＮＡｄｓｂ量增多，加重ＤＮＡ损伤（Ｐ＜０．０５）；２０Ｇｙ受照细胞保温０～１２０ｍｉｎ，在６０ｍｉｎ时ＤＮＡｄｓｂ开始被修复（Ｐ＜０．０５），而ＡＫ２１２３组为１２０ｍｉｎ（Ｐ＜０．０５），ＷＲ２７２１在３０ｍｉｎ后有修复的趋势；ＡＫ２１２３在６２．５～５００μｇ／ｍｌ内其参入率显著升高（Ｐ＜０．０５），呈促进ＤＮＡ合成作用，ＷＲ２７２１则随药物浓度增加其参入率降低（Ｐ＜０．０５），抑制ＤＮＡ合成．结论：ＡＫ２１２３和ＷＲ２７２１显著加重受照肝癌细胞的辐射损伤，促进ＤＮＡｄｓｂ量增加，抑制其修复过程．     

卵巢透明细胞腺癌的DNA损伤应答反应

目的研究卵巢透明细胞腺癌的发生与DNA损伤应答之间的关系。方法对14例新鲜卵巢组织标本(正常卵巢组织3例,低分化卵巢肿瘤6例,透明细胞腺癌5例),采用X射线(2Gy)照射制备组织DNA损伤模型,分别对其进行组织冷冻切片,采用免疫荧光和Western免疫印迹方法检测DNA损伤应答反应。结果在X射线照射前,与正常卵巢组织细胞相比,透明细胞腺癌中存在大量内源性DNA损伤,X射线照射后组蛋白2A变体(H2AX)表现过度磷酸化,而损伤修复能力正常。p53结合蛋白1(53BP1)的激活与磷酸化的H2AX(γH2AX)不能共定位。结论卵巢透明细胞腺癌中DNA损伤异常激活,提示DNA损伤应答信号转导网络存在缺陷。     

DNA依赖性蛋白激酶在妇科肿瘤中的研究进展

DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)是哺乳动物细胞DNA损伤修复的关键酶。研究表明,妇科肿瘤,如宫颈癌、卵巢癌中普遍存在DNA-PK表达的变化,提示该酶在妇科肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用,并与肿瘤的临床分期、放射敏感性和预后有重要关系。近年来,关于DNA-PK的结构与功能、在肿瘤细胞株中的活性、在肿瘤组织中表达的研究日益深入,以DNA-PK为靶点的DNA修复抑制剂作为肿瘤放化疗增敏药已陆续研发并进入临床前试验,有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。