MicroRNA-34a调控细胞衰老的研究

目的 探讨微RNA-34a(miRNA-34a)对细胞通过调控沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)的表达,从而引起细胞衰老的作用。 方法 构建pre-miRNA-34a表达载体,并将其和一个不针对任何基因的微小RNA-1792(miRNA-1792)表达载体(其他实验室赠送)分别转染至HEK293和HUVEC细胞内,用RT-PCR、Western blot检测各细胞组SIRT1 mRNA与蛋白表达水平,以未转染的细胞为对照;将HUVEC细胞分为转染不同质粒、未转染质粒和用SIRT1激活剂白藜芦醇(终浓度1 μmol/L,作用2 h)处理HUVEC细胞(HUVEC-Res)组,中性彗星电泳分析H₂O₂作用2 h 后4组HUVEC细胞的双链损伤情况;用阿霉素处理上述4组HUVEC细胞2 h,β-半乳糖甘酶(SA-β-gal)染色检测各细胞不同时间点的衰老情况。 结果 测序结果表明pre-miRNA-34a表达载体构建成功;RT-PCR、Western blot显示HEK293-pre-miRNA-34a和HUVEC-pre-miRNA-34a中SIRT1 mRNA和蛋白质表达的水平明显下降(P<0.001);中性彗星电泳检测发现经H₂O₂处理后,HUVEC-Res组DNA损伤最轻,而HUVEC-miRNA-34a组DNA损伤程度最为严重;SA-β-gal染色显示DNA损伤后HUVEC-miRNA-34a衰老程度较其它3组严重,而HUVEC-Res组的衰老程度最为轻微。 结论 miRNA-34a 通过抑制SIRT1表达调控细胞衰老。     

DNA双链损伤修复机制在糖尿病致动脉粥样硬化中的作用研究

【摘要】 目的 探讨DNA双链损伤修复机制在糖尿病致动脉粥样硬化中的作用。方法 将Wistar雄性大鼠随机分为3组,即正常对照组（A组）,主动脉内膜球囊损伤组（B组）,糖尿病模型+主动脉内膜球囊损伤组（C组）。C组采用链脲霉素（STZ）一次性腹腔注射建立糖尿病模型,注射STZ 72 h后,B组与C组大鼠均被施行主动脉球囊损伤术,术后分别予以高脂饲料饲养;A组予以基础饲养,每周监测血糖水平及体质量变化。分别于术后2周、4周、6周、8周,取大鼠主动脉进行老化β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、HE染色,并计算主动脉内膜面积、中膜面积、内中膜面积比,免疫组织化学染色检测磷酸化共济失调毛细血管扩张突变基因（ATM）、磷酸化细胞周期检测点激酶2（CHK2）、磷酸化P53、磷酸化组蛋白2A变异体（γ-H2AX）的表达。结果 术后2周,A组大鼠主动脉内膜老化SA-β-gal染色呈阴性,B组和C组大鼠老化SA-β-gal染色阳性区域较少且散在分布;HE染色示B组和C组大鼠主动脉内膜开始出现少量增生。术后4周,B组和C组大鼠主动脉内膜老化SA-β-gal染色呈阳性;HE染色示C组大鼠主动脉内膜增厚明显,主动脉内膜面积较A组和B组增加（P <0.05）。术后6周,C组大鼠主动脉内膜老化SA-β-gal染色呈阳性且面积较B组增加;HE染色示C组大鼠主动脉壁形成典型动脉粥样硬化斑块,斑块内平滑肌细胞排列紊乱,泡沫细胞聚集,管腔狭窄,与A组、B组相比,主动脉内中膜面积比增加（P <0.05）。术后8周,C组大鼠主动脉内膜老化染色阳性面积较B组增加;HE染色示C组大鼠主动脉腔明显狭窄,增生部分突入管腔,内膜面积、内中膜面积比较A组和B组增加（P <0.05）;免疫组化染色示C组大鼠主动脉内膜中γ-H2AX、磷酸化ATM、磷酸化CHK2、磷酸化P53表达均呈阳性,上述蛋白在B组大鼠主动脉内膜中表达均呈弱阳性。结论 糖尿病状态下,血管内皮细胞衰老激活,DNA双链损伤加剧,双链损伤修复机制参与了糖尿病致动脉粥样硬化的发生发展。     

HES1在小梁网细胞中作用的初步研究

目的 : 利用慢病毒包装系统使人眼小梁网细胞（HTMCs）稳定表达HES1 shRNA并初步探索HES1在HTMCs的作用。 方法: 体外培养HTMCs和HEK293FT细胞并进行传代,同时应用pLKO.1-puro shRNA慢病毒载体构建HES1 shRNA质粒。Lipofectamine 2000慢病毒包装法感染原代HTMCs,使其稳定表达HES1shRNA/Scramble质粒。采用q-PCR 和western blot方法检测HES1shRNA的敲低效果及促纤维化细胞外基质蛋白（ECM）的表达变化;HTMCs增殖和迁移能力分别通过CCK-8细胞活性分析和transwell计数实验进行分析。 结果: 原代细胞经过培养后贴壁生长,呈长梭形,生长状态良好,形态符合HTMCs形态学特征。HES1 shRNA有效下调HES1 的mRNA和蛋白水平表达,P<0.05。同时,HES1 shRNA组促纤维化ECM（FN; COL1; α-SMA）的mRNA和蛋白表达水平较Scramble组显著降低,P<0.05。而Transwell计数实验显示HES1 shRNA组HTMCs的迁移数量较Scramble组增加,P<0.05;CCK-8细胞活性分析实验表明抑制HES1表达对HTMCs的增殖活性影响不大,差异不具有统计学意义,P>0.05。 结论: 成功建立了稳定表达HES1 shRNA的HTMCs细胞株。HES1可以影响HTMCs中促纤维ECM的生成,及HTMCs的增殖和迁移能力。     

正常人及闭角型青光眼患者小梁细胞凋亡流式细胞学研究

目的 :研究正常人及闭角型青光眼患者小梁细胞凋亡发生率及与眼压升高的关系。方法 :采用Apo 2 .7分子探针 ,使用流式细胞仪检测 2 2例正常人及 2 7例闭角型青光眼小梁细胞凋亡发生率。结果 :正常人小梁细胞Apo2 .7分子检出率为 (2 .0 1± 0 .68) %。闭角型青光眼发作期检出率为 (5 .2 5± 0 .89) % ,两者差异有高度显著性 (P <0 .0 1) ,正常人小梁细胞Apo2 .7因子检出率与年龄增长无相关性 (r =0 .2 9) .闭角型青光眼小梁细胞Apo2 .7因子检出率与眼压升高呈显著性正相关 (r=0 .77) .结论 :正常人小梁细胞存在细胞凋亡发生 ,与年龄增长无相关 ,闭角型青光眼小梁细胞凋亡明显增加 ,与眼压升高呈正相关。     

人眼组织小梁网细胞的体外培养及鉴定的新方法

目的探讨人原代小梁网细胞的体外培养,以及利用其特性建立一种鉴定小梁网细胞的新方法。方法从眼球破裂伤病人的眼球以及角膜移植后剩余的角膜环分离出小梁网组织,利用组织块贴壁法以及消化法对人原代小梁网细胞进行体外培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态并利用CCK8法检测其生长速率。利用细胞免疫荧光技术对所培养的细胞进行纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白、水通道蛋白-1等蛋白的染色鉴定。并利用100 nmol/L地塞米松对所培养的细胞诱导10 d,通过荧光定量PCR和western blotting方法检测myocilin的表达水平以确定所培养的细胞是否为小梁网细胞。结果小梁网组织块贴壁培养1~2周后,开始有细胞从组织块旁向外长出,并逐渐增多。传代后小梁网细胞在第1~4天生长较快,第5~7天生长速度有所减慢,但依然显著高于第4天（P < 0.01）。所培养的细胞纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、层黏连蛋白、水通道蛋白-1的免疫荧光染色均呈阳性。地塞米松诱导后,与对照组相比,小梁网细胞中myocilin mRNA和蛋白表达水平均明显上升（P < 0.01）。结论本实验中所培养的细胞通过对其特点进行检测,确定所培养的细胞为人原代小梁网细胞。     

原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡的探讨

目的对比观察原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡数目与正常尸眼小梁网内皮细胞凋亡数目的变化,并探讨其可能的发病机制。方法对16例20眼原发性开角型青光眼（观察组）手术中所切取的小梁组织与17例30眼正常尸眼（对照组）所切除的小梁组织,分别采用流式细胞术进行小梁网内皮细胞凋亡数目的测定,比较原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡情况。结果通过实验发现原发性开角型青光眼小梁网内皮细胞凋亡比例（16％）明显高于正常尸眼小梁网内皮细胞凋亡（5％）。二者相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论原发性开角型青光眼小梁网对房水的滤过率下降,可能与小梁网内皮细胞凋亡数目的增多导致小梁网组织滤过功能的下降有一定的关系．     

DNA双链损伤修复机制在高糖诱导的内皮细胞衰老中的作用研究

目的 用高糖诱导人脐静脉内皮细胞衰老,检测衰老内皮细胞DNA双链损伤及修复机制相关蛋白的变化,从而探讨DNA双链损伤修复机制在高糖诱导的内皮细胞衰老中的作用.方法 在不同糖浓度5.5mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L、33 mmol/L条件下培养人脐静脉内皮细胞72 h,进行老化β-半乳糖苷酶染色鉴定...     

原发性开角型青光眼小梁网组织早衰的初步研究

摘 要: 【目的】 观察正常小梁网组织和POAG小梁网组织在超微结构和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)表达方面是否存在差异?【方法】 正常人小梁网组织取自广东省眼库的正常人眼球(10例),平均年龄(36.90 ± 10.10)岁;POAG小梁网组织来自中山眼科中心青光眼科行小梁切除术者(10例),平均年龄(39.80 ± 11.64)岁?用透射电镜观察两组小梁网组织超微结构;用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法对两组小梁网组织进行染色,并分析两者之间衰老染色的差异?【结果】 透射电镜发现正常人小梁网组织细胞膜完整,核染色均匀居中, 胞浆中可见形态正常的中心体, 周围散落分布着的线粒体?溶酶体等细胞器;基底膜完整连续;弹性纤维周围绕有薄鞘,胶原纤维呈束状排列?整齐;Schlemm管管腔通畅?而POAG患者的小梁网组织中可见细胞脱落溶解,细胞膜不完整,细胞核固缩或肿胀,线粒体水肿,线粒体嵴扩张;Schlemm管管腔变狭窄;弹性纤维增多且排列紊乱;基底膜增厚?SA-β-Gal染色发现POAG小梁网中的衰老细胞阳性率较正常人小梁网组织高(P < 0.001)?【结论】 POAG小梁网超微结构破坏明显,SA-β-Gal染色增强,在POAG小梁网中可能存在早衰?     

青光眼患者小梁网中一氧化氮合酶的表达

目的 检测正常人和急性闭角型青光眼(acute angle-closure glaucoma,AACG)患者小梁网中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endothelia nitric oxide synthase,eNOS)的表达,探讨小梁网中的一氧化氮合酶的变化及与青光眼的关系.方法 取5例正常人及15例AACG患者小梁网组织标本,应用免疫组织化学方法检测小梁细胞eNOS和iNOS的表达,并采用计算机图像分析系统对检测结果进行分析.结果 正常人的小梁网组织标本有eNOS的表达,阳性细胞分布均匀,iNOS呈弱阳性或不表达.AACG患者小梁网组织标本中,eNOS和iNOS均呈阳性表达,iNOS主要分布在邻管组织和Schlemm管.iNOS阳性表达比正常对照组增强(P＜0.05),而eNOS阳性表达比正常对照组减弱(P＜0.01).结论 AACG患者小梁网细胞eNOS表达减少而iNOS表达增多且主要分布在邻管组织、Schlemm管,提示一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)在青光眼发病中起重要作用,是导致或加重青光眼的因素之一.     

叔丁基过氧化氢诱导小梁网细胞氧化应激模型的建立

目的体外建立叔丁基过氧化氢小梁网细胞氧化应激模型。方法应用t BHP刺激体外培养的小梁网细胞(i HTM)后,观察小梁网细胞形态学的改变,分别用MTT法检测氧化损伤后小梁细胞的活性,流式细胞术检测活性氧水平,SucLLVY-荧光底物检测糜蛋白酶样蛋白酶体的活性,流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测小梁细胞的凋亡。结果正常培养的小梁细胞呈梭形,折光性好,贴壁较牢;应用t BHP刺激后,部分细胞变圆、脱落、皱缩,小梁细胞的细胞活性明显下降,活性氧水平升高,糜蛋白酶样蛋白酶体活性降低,细胞凋亡水平明显增加。随着刺激时间的延长,上述改变更为明显。结论 t BHP刺激后,小梁网细胞出现典型的氧化应激改变,t BHP刺激小梁网模型的建立可应用于青光眼氧化应激的研究。     

当归多糖对造血干细胞SIRT1、p53和p21表达的影响

目的 研究当归多糖（ASP）基于辐射所致小鼠衰老造血干细胞（HSCs） SIRT1、p53和p21蛋白表达的影响,探讨ASP基于调控HSCs衰老的可能机制。方法72只SPF级C57BL/6J小鼠随机纳入对照组、模型组和ASP组。模型组通过X线3.0G y/8F全身照射建立小鼠HSCs衰老模型;ASP组在照射期间给予ASP灌胃;对照组与模型组予生理盐水。经免疫磁珠法分选小鼠HSCs,采用流式细胞术检测细胞周期,通过β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色观察衰老细胞;经混合集落培养（CFU-Mix）观察HSCs自我更新及定向分化潜能;Western blot检测SIRT1、p53、p21蛋白表达。结果与对照组比较,X线照射可能显著增加模型组HSCs G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性细胞率、p53及p21蛋白表达（P<0.05）,降低SIRT1表达和CFU-Mix形成能力（P<0.05）。与模型组比较,ASP会抑制衰老HSCs G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性细胞率、p53及p21蛋白表达增加（P<0.05）,同时SIRT1表达增加、CFU-Mix能力增强（P<0.05）。结论ASP可能上调SIRT1表达、下调p53及p21表达,从而可能延缓小鼠HSCs衰老。