PCR快速检测细菌16S rRNA基因的初步研究

目的：建立检测细菌16SrRNA基因的PCR方法。方法:以细菌16S rRNA基因为靶序列。利用计算机软件primer5．0，Bioedit设计2条引物-pml.,pm2并建立相应的PCR方法。采用该PCR方法扩增实验室保留菌株的16srRNA基因,以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV—DNA阳性血清以及白色念珠菌为对照。检测该实验方法的特异性;采用倍比稀释的方法进行该实验方法的敏感性实验。结果：用引物pml，pm2对17个不同菌株进行PCR扩增。均得到371bp左右长度的DNA片段。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明。用pml，pm2引物进行的PCR扩增可检测出20CFU／ml,结论：16S rRNA基因PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点。     

真菌通用引物结合高分辨熔解曲线分析检测鉴定常见曲霉菌

目的探索一种能够快速检测鉴定临床常见侵袭性曲霉菌病原的新型分子生物学方法。方法以真菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2为靶基因,在5.8S、28S rRNA基因上设计泛真菌通用引物,扩增临床常见曲霉菌。同时用新生隐球菌基因组DNA、人基因组DNA及临床常见细菌基因组DNA进行引物特异性检测。将通用真菌引物扩增产物进行高分辨熔解曲线分析。以新鲜提取的烟曲霉基因组DNA为模板按照1∶10的比例梯度稀释,进行敏感性检测。检测7个浓度梯度的烟曲霉基因组DNA。结果设计的真菌通用引物可以扩增临床常见的4种曲霉菌及新生隐球菌,但与人基因组DNA和临床常见细菌基因组DNA无扩增反应,检测限可低至1.5 pg/μl,且4种曲霉菌及新生隐球菌扩增产物的熔解曲线不同。该方法敏感性和特异性均较好。结论利用真菌通用引物的扩增产物结合高分辨熔解曲线分析可以达到检测鉴定临床常见4种曲霉菌的目的,此方法对侵袭性曲霉菌的快速检测鉴定具有重要意义。     

16SrRNA基因快速诊断败血症病原菌研究

目的通过合成所有细菌共有的16SrRNA基因高度保守区引物,进行PCR扩增,探讨败血症的快速诊断方法。方法用PCR技术扩增实验室保留株10株的16SrRNA基因,以人类基因组DNA、HBV-DNA和白色念珠菌为对照,检测该方法的特异性;采用倍比稀释法进行该方法的灵敏度检测。结果对所测细菌株均获得920bp扩增产物,而与人基因组DNA、HBV-DNA和白色念珠菌无交叉反应;PCR最低能检测1.5×106/L大肠杆菌DNA。结论PCR检测方法是一种极有应用价值的用于败血症早期诊断方法。     

16S rRNA在检测肺炎克雷伯菌引起血流感染中的应用

目的初步建立一种对肺炎克雷伯菌引起血流感染的快速检测方法。方法应用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）,从血培养阳性瓶中提取细菌基因组DNA,以特异性引物扩增16S rRNA靶片段,同期进行细菌培养鉴定的对照。结果检测142份已知肺炎克雷伯阳性标本,65份非肺炎克雷伯阴性对照,52份双盲样本显示敏感性为100%（146/146）特异性为100%（113/113）,整个实验可在2h内完成。结论较传统的培养鉴定法而言,以16SrRNA作为实时荧光定量靶基因可快速检测肺炎克雷伯菌,具有很好的研究价值与应用前景。     

16S rRNA基因检测在自发性细菌性腹膜炎快速诊断中的应用

目的 评估16S rRNA基因检测在自发性细菌性腹膜炎(SBP)快速诊断中的应用价值.方法 采用16S rRNA基因荧光定量多聚酶链反应检测76例疑似SBP及6例非感染性腹腔积液患者腹水细菌DNA,并与腹水细菌培养结果进行比较.结果 16S rRNA检测疑似SBP患者腹水标本的阳性率为22.4%,明显高于腹水细菌培养的7.9%(P<0.01) .6例非感染性腹腔积液患者的腹水16S rRNA基因荧光定量PCR检测结果和细菌培养结果均为阴性.结论 16S rRNA检测可做为SBP的快速诊断方法,其敏感性优于腹水细菌培养.     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

rpoB作为蜡样芽胞杆菌群快速检测的标志基因的实验研究

目的探讨常规PCR和实时荧光定量PCR(Q-PCR)方法检测蜡样芽胞杆菌群rpoB基因的特异性和敏感性。方法提取蜡样芽胞杆菌群和其他各种对照细菌的基因组DNA,合成蜡样芽胞杆菌群rpoB基因扩增引物,采用常规PCR和SYBRgreen实时定量PCR两种方法扩增rpoB基因片段,并将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行DNA测序。结果常规PCR和Q-PCR均能扩增出蜡样芽胞杆菌群rpoB基因的174bpDNA片段,而各种对照菌株均未见扩增。序列比对发现蜡样芽胞杆菌群细菌在该片段中存在5处核苷酸的不同,差异率为2.88%。以炭疽芽胞杆菌基因组DNA系列稀释作为扩增模板显示常规PCR最小检出量为3.42pg,Q-PCR的敏感性达到171fg,3次重复实验显示Q-PCR检测rpoB基因的灵敏度为(3.32×101±7.45×100)拷贝。结论以rpoB基因为检测靶基因的Q-PCR方法具有高度的特异性和良好的敏感性,能实现对蜡样芽胞杆菌群快速而准确的检测。     

病原性真菌PCR检测方法的建立

目的：建立一种快速、灵敏和特异的病原性真菌的检测方法。方法：选取真菌18S rRNA保守区的一对寡核苷酸序列作为通用引物,对10种真菌、3种常见细菌及80例临床标本进行PCR扩增。结果：所试10种真菌均能扩增出一条约400bp的DNA片段,而3种细菌则无此扩增条带。通过对80例临床标本的检测,证实PCR法和常规培养法结果基本一致。此外,对白色念珠菌检测的最低限为10pg的DNA。结论：PCR方法检测临床常见真菌有较高的灵敏性与特异性,有助于临床真菌感染性疾病的诊断与治疗。     

多重PCR系统快速诊断结核和其它细菌感染

目的：建立一种可用于诊断细菌感染,并能鉴别结核和其它细菌感染的快速诊断方法。方法：根据细菌16SrDNA保守区和多变区设计两条通用引物和一条结核菌特异引物,建立多重PCR系统。进行一次扩增后,普通细菌均可得到相应360bpDNA片断,结核杆菌可得到360bp和210bp两个DNA片断。检测82份临床样本包括：全血42份、脑脊液22份、胸水9份、腹水9份,与培养结果相比较,分别评估该系统检测普通细菌和结核菌的敏感性和特异性。结果：以细菌培养为金标准,本系统检测临床样本中普通细菌和结核菌的敏感性均达100％,特异性分别为76％和94％。结论：所建立的多重PCR系统具有特异性强、敏感性高的优点,是一种快速可靠的诊断细菌感染的新方法,并能有效区分结核感染和其它细菌感染。     

基于常规引物靶向结核分枝杆菌Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位的恒温扩增

目的 探讨基于特异常规引物（即引物不需折叠成特定二级结构）靶向恒温扩增重复DNA序列的方法，并测试其检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的可能性。方法 以合成的重复DNA或以抽提的细菌基因组DNA为模板，用Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶进行恒温扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果 合成的重复DNA可用其特异常规引物进行恒温扩增。进一步，Mtb H37Rv Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位（mycobacterial interspersed repetitive units，MIRUs）可用其特异常规引物对（即Ⅱ_MIRU-F和Ⅱ_MIRU-R）或单引物（即Ⅱ_MIRU-F）进行恒温扩增。相比于非分枝杆菌菌株、非结核分枝杆菌菌株、Mtb复合物菌株和临床分离株，Ⅱ_MIRU-F能够高特异地扩增Mtb菌株。Ⅱ_MIRU-F针对Mtb H37Rv基因组DNA的检测下限较高，且不能特异地区分Mtb阴性痰液样本和Mtb阳性痰液样本。结论 常规引物可恒温扩增重复DNA序列（包括Mtb Ⅱ型MIRUs）；Mtb Ⅱ型MIRUs特异引物Ⅱ_MIRU-F不适合用于痰液样本的检测。     

多重半套式PCR检测细菌16srRNA基因方法的建立

（1）目的 设计并建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测临床标本中感染病原菌DNA方法。（2）方法 通过对多数病原菌16srRNA基因保守区和变异区序列分析,设计通用引物和革兰阴性菌及革兰阳性菌的特异性引物分别作为外侧和内侧引物,分两步先后加入同一反应体系中对不同细菌的DNA进行扩增。（3）结果金黄色葡萄球菌和大肠无纪律希菌经扩增后均有长度为1032bp的DNA片段产生;金黄色葡萄球菌另有一长度为336bp的特异性产物,大肠埃希菌另有一长度为127bp的特异性产物。（4）结论 该方法可以特异、敏感、快速检测出临床感染的病原菌。     

PCR法检测细菌23S rDNA在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的　研究建立快速检测细菌DNA的方法。方法　设计一对共同引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)法 ,扩增细菌核糖体 2 3S亚单位基因 2 3SrDNA。对 2 3种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用该方法进行检测 ,并与常规细菌培养法比较。结果　该方法可检测细菌下限为 2 5CFU ,与真菌、乙肝病毒等无交叉反应。对纯菌及培养物均可检出一条明显DNA条带 ,革兰阴性细菌约 35 0bp ,革兰阳性细菌约 4 0 0bp。临床标本 2 3SrDNA检出率明显高于常规培养方法 (P <0 0 1)。结论　应用所设计的共同引物 ,检测细菌 2 3SrDNA ,敏感性和特异性好 ,比常规培养法快速、准确。     

Establishment of a multiplex PCR system to diagnose tuberculosis and other bacterial infections

BactirialinfectiousdiseasesareverycommoninchildrenofChina.Manysevereinfectionssuchaspu-rulentmeningitis,tuberculousmeningitisandsepsisstillthreatenchildren'shealthandeventheirlives.Bacterialcultureisaclassicmethedtodetectthepathogensofinfectiousdiseases,butithastotakeseveraldaysforgeneralbacteriaandeven4to8weeksfortuberclebacillus(Tb).ltcouldbringsomeperplexitiesfordoctorstodeterminetheeffectivetherapy.So,arapid,specificandsensitivemethodisrequiredfordiagnoslngbacterialinfections,speciallydif…     

肝硬化腹水患者治疗前后血浆神经肽Y的变化及意义

目的研究肝硬化(LC)失代偿期伴腹水患者,以及患者经治疗腹水消退后血浆神经肽Y(NPY)水平的变化,了解NPY与肝功能及腹水的关系。方法放射免疫法检测LC失代偿期伴腹水患者20例的血浆NPY水平,以及腹水消退后血浆NPY水平。结果LC腹水患者血浆NPY水平明显低于正常人(P<0.01);腹水消退后血浆NPY水平较前明显升高(P<0.01),但仍明显低于正常人(P<0.01)。结论LC患者血浆NPY水平的下降与肝功能损害的程度有关,血中NPY的减少可能参与了LC血流动力学的改变及腹水的形成。     

腹水-血清CA125梯度在腹水性质分析中的意义

目的探讨腹水-血清CA125梯度在腹水性质分析中的意义。方法对37例肝硬化腹水、19例自发性腹膜炎、16例结核性腹膜炎及28例腹膜转移癌患者的血清、腹水CA125水平以及腹水-血清CA125梯度进行检测,并以20例健康人血清CA125为对照组比较分析。结果不同性质腹水患者的血清CA125明显高于正常对照组（P〈0.01）,但彼此之间差异无统计学意义（P〉0.05）;自发性腹膜炎、结核性腹膜炎及腹膜转移癌患者腹水CA125明显高于肝硬化腹水组（P〈0.05）,但彼此之间差异无统计学意义（P〉0.05）;不同性质腹水患者的腹水、血清CA125水平之间显著相关（P〈0.01或P〈0.05）;自发性腹膜炎、结核性腹膜炎及腹膜转移癌患者腹水-血清CA125梯度明显高于肝硬化腹水组,腹膜转移癌患者更为明显（P〈0.01）,与自发性腹膜炎、结核性腹膜炎组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论血清、腹水CA125均为非特异性腹水标志物之一,对鉴别腹水性质的意义不大,但腹水CA125可能在渗出液和漏出液的鉴别中具有重要意义,而腹水-血清CA125梯度更有助于腹水性质的分析。     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应（PCR）合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16S rRNA的通用探针，并用生物素标记DNA探针，分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交，细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA，100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌，其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异，具有较高的应用价值．可应用于临床检测。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应(PCR)合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16SrRNA的通用探针,并用生物素标记DNA探针,分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交,细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA,100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌,其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异,具有较高的应用价值,可应用于临床检测。     

80例肝硬化腹水并发自发性细菌性腹膜炎高危因素分析

目的探讨肝硬化腹水并发自发性细菌性腹膜炎（SBP）的高危因素,为临床早期预防提供依据。方法回顾分析我院2010年1月-2013年4月住院治疗140例肝硬化腹水患者,住院期间并发SBP80例为研究组,未发生SBP60例为对照组,比较两组患者的年龄、性别、既往SBP史、肝炎后肝硬化、上呼吸道感染、电解质紊乱、顽固性腹水、上消化道出血、肝性脑病、血清白蛋白、血清总胆红素、凝血酶原时间、C-反应蛋白、肝功能分级（Child-pugh）。并对这些因素进行统计学对比分析。结果两组患者的年龄、性别、上呼吸道感染、电解质紊乱、顽固性腹水、肝性脑病相比较差异无统计学意义（P〉0．05）,研究组患者的既往SBP史、肝炎后肝硬化、上消化道出血、血清总胆红素、血清白蛋白、C-反应蛋白、凝血酶原时间及肝功能分级（Child-pugh）与对照组相比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论既往SBP史、肝炎后肝硬化、上消化道出血、血清总胆红素、血清白蛋白、C-反应蛋白、凝血酶原时间、肝功能分级（Child-pugh）是肝硬化腹水患者并发SBP的独立高危因素,在临床诊疗过程中应高度重视。