不定型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的表达纯化及其在儿童血清中的抗体水平检测

目的建立不定型流感嗜血杆菌(NTHi)外膜蛋白P6原核表达系统并表达纯化P6,探索其在不同年龄儿童血清中的抗体水平。方法采用PCR扩增NTHi ATCC49247的P6基因pal,构建NTHi P6原核表达系统,采用亲和层析法纯化NTHi P6。血清P6抗体检测采用ELISA法,检测对象为2013年10~12月到杭州师范大学附属医院体检的儿童228例。组间抗体水平比较采用非参数检验。结果本研究所构建的原核表达系统能有效表达重组P6蛋白,该重组蛋白有可溶性形式存在,但包涵体较多。ELISA结果显示,1岁组P6抗体水平较低,中位数为9 904ELISA单位,1~3岁组则最高,中位数12 731ELISA单位,两者差异有统计学意义(Z=2.111,P=0.035);1~3岁组血清P6抗体水平显著高于4~6岁组(中位数10 237ELISA单位,Z=2.015,P=0.044),后者又显著高于7~14岁组(中位数7 207ELISA单位,Z=3.546,P0.01)。结论本研究构建的原核表达系统能表达可溶性重组P6,1~3岁儿童血清中P6抗体水平最高,可能与该年龄段NTHi感染率高有一定关系。     

套式聚合酶链反应检测巨细胞病毒的初步研究

目的建立套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）加限制性酶切分析方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）。方法在ＨＣＭＶ直接早期蛋白ＥｃｏＲＩＪＤＮＡ片段内，自行设计两对引物，建立套式ＰＣＲ检测ＨＣＭＶＤＮＡ，同时结合病毒分离检测临床标本。结果２３例新生儿肝炎综合征患儿中，１０例病毒分离及套式ＰＣＲ均阳性；１例病毒分离阴性，但套式ＰＣＲ阳性。对５８例妊娠早期孕妇血标本进行检测，套式ＰＣＲ阳性率为９％，病毒分离阳性率则为７％。结论套式ＰＣＲ加限制性酶切分析是一种临床检测ＨＣＭＶ的快速有效手段，值得临床推广。     

MassARRAY基因分型技术在新生儿遗传代谢病诊断中的应用

目的探讨MassARRAY基因分型技术应用于新生儿遗传代谢病诊断的准确性、时效性及可行性。方法回顾性研究。收集2016年12月至2020年1月在浙江省新生儿筛查中心应用串联质谱筛查的疑似阳性患儿7 922例, 采用MassARRAY技术进行27种遗传代谢病的常见变异位点检测, 通过Sanger或二代测序验证并进一步寻找潜在变异。结果共1 408份样本送检MassARRAY, 307例确诊为遗传代谢病患儿, 其中高苯丙氨酸血症检出率最高, 其次为原发性肉碱缺乏症、短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症和甲基丙二酸血症。经Sanger测序验证100%(307/307)符合。287例检测为携带者, 49.1%(141/287)经Sanger测序确认为携带者, 以SLC22A5、MCCC1基因为主。50.8%(146/287)还检测到另一个等位基因变异, 以PAH、PTS和ACADS基因为主。814例未发现变异, 对其中158例复查后串联质谱特征性指标持续阳性、尿有机酸及其他生化检测等异常的样本进行二代测序, 38%(60/158)检测到2个等位基因变异。最终确诊513例遗传代谢病患者, MassARRA...     

2019冠状病毒病(COVID-19)疫情期生物样本保藏生物安全防护原则及建议

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染引起的2019冠状病毒病（COVID-19）是乙类传染病。随着COVID-19疫情蔓延,生物样本库样本保藏的生物安全风险增加,其生物安全防护显得越来越重要。根据国家有关规定和中华医学会相关指南,本文基于SARS-CoV-2病原学和COVID-19流行病学资料,提出了生物样本采集、转运、处理、保藏、检测、检测后处置、突发事件等过程中个人和生物样本保藏场所的生物安全防护原则及若干建议。强调依据有无病毒载量信息、传染力大小、标本类型（可能接触传播、气溶胶传播、粪口途径传播）对样本进行严格的生物安全风险评估,以指导疫情期间生物样本保藏、确保生物样本库生物安全。     

地塞米松治疗与细菌性脑膜炎脑源性神经营养因子及其受体基因表达的关系

目的 探讨地塞米松(DEX)治疗与细菌性脑膜炎脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体TrkB基因表达的关系。方法 建立细菌性脑膜炎模型，分别用抗菌药物及抗菌药物加DEX治疗，用原位杂交检测脑组织BDNF mRNA和TrkB mRNA的表达。结果 单独使用抗菌药物治疗后BDNF mRNA和TrkB mRNA表达均低于感染后5d组的水平(P＜0．05)，并以BDNF mRNA下降更明显(P＜0．01)，而使用DEX与抗菌药物联合治疗后，BDNF mRNA和TrkB mRNA表达回到较高水平(P＜0．01)，BDNFmRNA达到感染后5d组水平(P＞0．05)，TrkB mRNA则超过感染后5d组水平(P＜0．05)。结论 DEX则可能通过上调内源性BDNF mRNA和TrkB mRNA表达，有利于抵御细菌性脑膜炎脑损伤。     

应用16S-23S rRNA基因区间对败血症常见菌的鉴定

目的：建立检测不同菌种细菌的16S－23S rNA基因区间的特异图谱。方法：应用聚合酶链反应（PCR），限制性内切酶片段长度多态性分析（RFLP），分子克隆及测序技术，对临床常见的代表20个属26个种的标准菌株及相应的临床分离菌株共61株进行PCR扩增，同时对临床标本进行培养并与PCR－RFLP比较，探讨其在临床应用中的价值。结果：26株不同的标准菌株行PCR扩增后，分别出现1条带，2条带，3条带及多条带的不同DNA图谱，其敏感性为2．5CFU，与人类基因组DNA，真菌及病毒无交叉反应，其中14种菌经PCR扩增即可区分，另10种经Hinf I或AluI酶切后才能区分，肺炎克雷伯菌与坚韧肠球菌间的差异在第779位碱基上不同，Xma Ⅲ酶能进行区别，临床42例血培养15例阳性，阳性率35．7％；而PCR阳性27例，阳性率达64．3％，其阳性率明显高于血培养（P＜0．01），6例脑脊液标本中1例培养为表皮葡萄球菌，其PCR也阳性，2例培养阴性标本，其PCR也阳性，经图谱分析为葡萄球菌，1例培养为新型隐球菌的脑脊液标本PCR检测为阴性，另2例PCR及培养均阴性。结论：建立了PCR加RFLP技术快速检测细菌16S－23S rRNA基因区间的方法，进一步为临床细菌感染的病原诊断提供了新的科学依据。     

汉族和回族儿童甘露糖结合凝集素基因多态性分析

目的 分析浙江省汉族和宁夏回族自治区回族儿童甘露糖结合凝集素(MBL)基因外显子1区 223、 230和 239位点、5'端非翻译区 4位点和启动子区-221位点的单核苷酸多态性,并分析其单体基因型.方法 研究对象为参加体检的105例汉族和69例回族儿童.体检时抽取静脉血1.5ml,以EDTA抗凝.MBL基因多态性分析采用序列分析法,遗传学分析采用SHEsis软件.结果 汉族和回族儿童MBL基因启动子区-221位点的变异频率分别为0.095和0.123,两组人群该位点的变异频率无显著性差异(x2=0.684,P=0.408);所有个体外显子1区 223和 239位点均无突变发现;汉族儿童外显子1区 230位点( 54密码子)的变异频率为0.167,低于回族儿童(0.268,x2=5.223,P=0.022);基因单倍型以YA最为多见,回族儿童中其频率(0.669)低于汉族儿童(0.770,x2=4.312,P=0.038).结论 汉族、回族儿童MBL基因-221位点的变异频率无明显差异,回族儿童 230位点的变异频率高于汉族儿童,两组人群最常见基因单倍型为YA,但在汉族人群YA频率高于回族人群.     

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因、空泡毒素基因及其表达产物与儿童胃十二指肠疾病的关系

目的　研究幽门螺杆菌 (Hp)的细胞毒素相关基因 (cagA基因 )、空泡毒素基因 (vacA基因 )及其表达产物cagA蛋白、vacA抗体与儿童消化性溃疡 (PU)、慢性胃炎 (CG)之间的关系。 方法　对 15 2例Hp感染患儿 (PU 31例 ,CG 12 1例 )的胃黏膜应用 4对不同引物 ,通过聚合酶链反应 (PCR)技术检测cagA、vacA基因 ;用免疫印迹法测定 139例血清cagA、vacA抗体。结果　 15 2例胃黏膜 10 0 %具有vacA基因 ( 15 2 /15 2 ) ,cagA基因经用 3对不同引物检测 ,其总阳性率为 78% ( 118/15 2 ) ,其中PU 71% ( 2 2 /31) ,CG 79% ( 96 /12 1) ,两组间差异无显著性 ( χ2 =0 .996　P >0 .0 5 )。 139例血清vacA抗体阳性率 92 .1% ( 12 8/139) ,PU 86 .7% ( 2 6 /30 ) ,CG 94 .5% ( 10 3/10 9) ( χ2 =1.14 6　P >0 .5 ) ;cagA抗体阳性率 91.4 % ( 12 7/139) ,PU 83.3% ( 2 5 /30 ) ,CG93.6 % ( 10 2 /10 9) ( χ2 =3.130　P >0 .5 ) ,以上两组间差异均无显著性。结论　 1.浙江地区儿童感染的Hp绝大多数为具有cagA基因的毒力菌株。 2 .亚洲地区与西方人群中感染的Hp菌株可能存在等位基因的多态性、变异性     

流感嗜血杆菌患儿分离株的耐药性分析

流感嗜血杆菌在儿童中常引起呼吸道感染 ,也可侵入血液继发脑膜炎等多种感染性疾病。 70年代中、后期 ,流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率逐渐上升 ,如今耐氨苄西林流感嗜血杆菌已遍及全球 ,但不同地区的耐药率存在较大差异。为了解本地区流感嗜血杆菌的抗生素耐药情况 ,对我院细菌室鉴定的139株流感嗜血杆菌临床株进行体外抗生素敏感性分析。材料和方法菌株来源 :2 0 0 1年 8月至 2 0 0 2年 3月本院临床标本中分离的 139株流感嗜血杆菌。试剂 :嗜血杆菌专用巧克力培养基、ａｐｉ ＮＨ鉴定卡、Ｃｅｆｉｎａｓｅ纸片均为法国ｂｉｏＭ啨ｒｉｅｘ…     

16S-23S rRNA基因区间细菌鉴定实验研究

目的 :探讨 16 S- 2 3S r RNA基因区间对细菌鉴定的应用。方法 :以 16 S- 2 3S r RNA基因区间为靶序列设计引物 ,采用聚合酶链反应检测标准菌株及临床菌株 DNA。结果 :对 2 7株代表 2 7个菌种的标准菌株进行 PCR扩增 ,分别出现不同的 DNA图谱 ,该图谱能直接或经核酸内切酶处理后用于细菌分类 ,敏感性可达 2 .5 CFU/ml的细菌 ,与人外周血白细胞 DNA和真菌及病毒无交叉。 32株临床细菌标本均扩增出与相应标准菌株一致的图谱。结论 :16 S- 2 3S r RNA基因区间 PCR扩增技术检测细菌 ,具有敏感、特异、快速、准确的优点 ,为临床败血症病原的快速诊断提供了新的方法