PCR测肝硬化腹水中细菌DNA的研究

目的探讨用PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性,了解肝硬化患者发生细菌移位的高危因素。方法在细菌16S rRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBV-DNA、37份肝硬化患者腹水进行PCR扩增。腹水中细菌DNA阳性者纯化后经核苷酸测序鉴别细菌种类,同时收集患者临床资料,运用SPSS11.5软件对患者基本临床特征及主要检验结果进行统计分析。结果7种对照菌株均得530bpDNA片段,而与人基因组DNA、HBV-DNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。37份腹水中有9份获得530bp DNA片段(24.3%),而腹水细菌培养阳性率为5.4%(2/37),二者比较有显著性差异(P<0.05)。腹水中细菌DNA阳性和阴性的两组肝硬化患者在上消化道出血的发生率、血清总胆红素水平、凝血酶原活动度、Child-Pugh积分、腹水总蛋白浓度、外周血白细胞总数等比较,有显著性差异(P<0.05)。结论用通用引物通过PCR方法扩增细菌16S rRNA基因具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。肝功能损害、腹水调理活性低下和上消化道出血是肝硬化患者发生细菌移位的高危因素。     

真菌通用引物结合高分辨熔解曲线分析检测鉴定常见曲霉菌

目的探索一种能够快速检测鉴定临床常见侵袭性曲霉菌病原的新型分子生物学方法。方法以真菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2为靶基因,在5.8S、28S rRNA基因上设计泛真菌通用引物,扩增临床常见曲霉菌。同时用新生隐球菌基因组DNA、人基因组DNA及临床常见细菌基因组DNA进行引物特异性检测。将通用真菌引物扩增产物进行高分辨熔解曲线分析。以新鲜提取的烟曲霉基因组DNA为模板按照1∶10的比例梯度稀释,进行敏感性检测。检测7个浓度梯度的烟曲霉基因组DNA。结果设计的真菌通用引物可以扩增临床常见的4种曲霉菌及新生隐球菌,但与人基因组DNA和临床常见细菌基因组DNA无扩增反应,检测限可低至1.5 pg/μl,且4种曲霉菌及新生隐球菌扩增产物的熔解曲线不同。该方法敏感性和特异性均较好。结论利用真菌通用引物的扩增产物结合高分辨熔解曲线分析可以达到检测鉴定临床常见4种曲霉菌的目的,此方法对侵袭性曲霉菌的快速检测鉴定具有重要意义。     

16S-23S rRNA基因区间细菌鉴定实验研究

目的 :探讨 16 S- 2 3S r RNA基因区间对细菌鉴定的应用。方法 :以 16 S- 2 3S r RNA基因区间为靶序列设计引物 ,采用聚合酶链反应检测标准菌株及临床菌株 DNA。结果 :对 2 7株代表 2 7个菌种的标准菌株进行 PCR扩增 ,分别出现不同的 DNA图谱 ,该图谱能直接或经核酸内切酶处理后用于细菌分类 ,敏感性可达 2 .5 CFU/ml的细菌 ,与人外周血白细胞 DNA和真菌及病毒无交叉。 32株临床细菌标本均扩增出与相应标准菌株一致的图谱。结论 :16 S- 2 3S r RNA基因区间 PCR扩增技术检测细菌 ,具有敏感、特异、快速、准确的优点 ,为临床败血症病原的快速诊断提供了新的方法     

流感嗜血杆菌16S rRNA和p6基因PCR检测结果比较

目的 比较流感嗜血杆菌(Hi) 16S rRNA和p6基因的PCR检测结果的差异.方法 以Hi的16S rRNA基因及外膜蛋白p6基因作为靶基因,设计特异性引物分别对临床标本分离的43株Hi进行PCR快速检测. 结果 34株16S rRNA基因扩增出538bp大小DNA片段,检出率为79%;43株p6基因均扩增出296bp大小DNA片段,检出率为100%.同时,其他细菌对照株16S rRNA和p6基因扩增均未出现假阳性结果.结论 相比于16S rRNA基因,p6基因对Hi检测和鉴定更具特异性,可用于临床对Hi感染疾病的快速诊断和流行病学研究.     

16SrRNA基因快速诊断败血症病原菌研究

目的通过合成所有细菌共有的16SrRNA基因高度保守区引物,进行PCR扩增,探讨败血症的快速诊断方法。方法用PCR技术扩增实验室保留株10株的16SrRNA基因,以人类基因组DNA、HBV-DNA和白色念珠菌为对照,检测该方法的特异性;采用倍比稀释法进行该方法的灵敏度检测。结果对所测细菌株均获得920bp扩增产物,而与人基因组DNA、HBV-DNA和白色念珠菌无交叉反应;PCR最低能检测1.5×106/L大肠杆菌DNA。结论PCR检测方法是一种极有应用价值的用于败血症早期诊断方法。     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

16S rRNA在检测肺炎克雷伯菌引起血流感染中的应用

目的初步建立一种对肺炎克雷伯菌引起血流感染的快速检测方法。方法应用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）,从血培养阳性瓶中提取细菌基因组DNA,以特异性引物扩增16S rRNA靶片段,同期进行细菌培养鉴定的对照。结果检测142份已知肺炎克雷伯阳性标本,65份非肺炎克雷伯阴性对照,52份双盲样本显示敏感性为100%（146/146）特异性为100%（113/113）,整个实验可在2h内完成。结论较传统的培养鉴定法而言,以16SrRNA作为实时荧光定量靶基因可快速检测肺炎克雷伯菌,具有很好的研究价值与应用前景。     

细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。     

金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR方法的建立与初步应用

目的建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR检测方法,为实验动物细菌检测提供快速、灵敏、简便的方法。方法根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌Las I基因、肺炎克雷伯杆菌Pho E基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异性引物;经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系对人工感染标本、实验动物粪便样本进行验证检测,与传统检测方法对比。结果多重PCR分别扩增出金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)和通用(520 bp)的目的条带。多重敏感性为10 pg,特异性检测未从其他细菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测出不同组合的人工感染标本,从76只粪便检测出绿脓杆菌阳性1例,与传统检测方法结果一致。结论本文建立的多重PCR方法具有特异、灵敏、简便、快速等优点,为实验动物微生物的快速检测提供了可靠的方法。     

基于16S rRNA序列鉴定临床不常见细菌

目的以16S rRNA基因为靶序列,建立核糖体测序方法鉴定临床不常见细菌。方法利用通用引物聚合酶链反应(PCR)扩增细菌16S rRNA基因,对PCR产物进行测序,在GenBank中对测序结果进行Blastn分析。结果10株临床常见细菌测序结果与表型鉴定符合,检测出4株临床不常见细菌。结论 16S rRNA基因测序可以作为鉴定临床不常见细菌的重要方法之一。     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

16S rRNA基因序列鉴定标本中病原细菌的方法学研究

目的研究16S rRNA基因序列鉴定标本中病原微生物的关键技术,评价序列分析技术作为病原微生物检测方法的可行性和实用件。方法对117份不同来源的临床标本分别采用形态学、细菌培养、16S rRNA基因扩增与测序分析,比较不同方法对病原菌检出的灵敏度与特异性。分子技术通过改良的微量核酸提取方法,扩增16S rRNA基因两个区域（BSF8-BSR534和BAK11 w-BAK2）。结果细菌培养和PCR检测的阳性率分别是49％（57／117）和72％（84／117）,63％（53／84）的PCR产物通过直接测序鉴定到种;60例（52％）培养阴性标本中有7例（12％）经序列分析再次鉴定出病原菌;形态学检查阳性率为64％（75／117）,与PCR结果接近,两者结合可提供推测性报告。第1对引物（扩增区：BSF8-BSR534）较适合革兰阳性细菌分类,第2对引物（扩增区：BAK11w-BAK2）对临床常见病原菌均可获得理想的序列。结论改进核酸提取技术、筛选恰当的引物、优化基因扩增和测序流程,通过16S rRNA基因序列直接鉴定标本中病原微生物有着广阔的应用前景。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应（PCR）合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16S rRNA的通用探针，并用生物素标记DNA探针，分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交，细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA，100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌，其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异，具有较高的应用价值．可应用于临床检测。     

PCR技术检测棘阿米巴26S核糖体DNA

目的:用聚合酶链反应(PCR)方法检测棘阿米巴的26S核糖体DNA(26S rDNA,Rns),为早期诊断棘阿米巴角膜炎提供方法.方法:分离培养三株不同基因型棘阿米巴虫株,提取虫株基因组DNA,合成棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a),通过聚合酶链反应(PCR)扩增部分26S rDNA序列.结果:三株不同基因型棘阿米巴虫株属于两种基因型,其中Acanthamoeba sp.CJY/s2株和Acanthamoeba sp.CJY/s株属于Rns T4基因型,Acastellanii Neff株属于Neff基因型.PCR扩增后,Acanthamoeba sp.CJY/s2和Acastellanii Neff株的26S核糖体DNA基因片段扩增出分子量大小为126 bp的特定扩增带,而Acanthamoeba sp.CJY/s株的26S核糖体DNA基因片段则未得到预期的扩增带.结论:用棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a)可以有效扩增Acanthamoeba sp.CJY/s2和Acastellanii Neff株的26S核糖体DNA基因,可以为部分棘阿米巴性角膜炎的早期检测提供新的检测手段.     

多重半套式PCR检测细菌16srRNA基因方法的建立

（1）目的 设计并建立多重半套式聚合酶链反应（PCR）快速检测临床标本中感染病原菌DNA方法。（2）方法 通过对多数病原菌16srRNA基因保守区和变异区序列分析,设计通用引物和革兰阴性菌及革兰阳性菌的特异性引物分别作为外侧和内侧引物,分两步先后加入同一反应体系中对不同细菌的DNA进行扩增。（3）结果金黄色葡萄球菌和大肠无纪律希菌经扩增后均有长度为1032bp的DNA片段产生;金黄色葡萄球菌另有一长度为336bp的特异性产物,大肠埃希菌另有一长度为127bp的特异性产物。（4）结论 该方法可以特异、敏感、快速检测出临床感染的病原菌。     

Anaerobic bacteria and intrahepatic stones: detections of Clostridium sp. and Bacteroides fragilis

Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃｓｔｏｎｅｓｏｒｈｅｐａｔｏｌｉｔｈｉａｓｉｓａｒｅｓｔｏｎｅｓｏｃｃｕｒｒｉｎｇｗｉｔｈｉｎｔｈｅｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃｂｉｌｅｄｕｃｔｓａｂｏｖｅｔｈｅｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｉｇｈｔａｎｄｌｅｆｔｈｅｐａｔｉｃｄｕｃｔｓ 1,2 　Ｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｂｒｏｗｎｐｉｇｍｅｎｔｓｔｏｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｓｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｂｉｌｉｒｕｂｉｎａｎｄｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｆｒｅｅｂｉｌｉｒｕｂｉｎｗｉｔｈｃａｌｃｉｕ…     

套式PCR检测细菌16SrRNA基因

目的　应用套式PCR建立快速检查方法来检测血液中是否含有细菌。方法　采用细菌 1 6SrRNA基因通用引物 ,通过套式PCR方法对细菌进行扩增 ,并对其灵敏度、特异性作一评价。结果　临床常见细菌扩增反应为阳性 ,其他病原微生物及人类基因组DNA为阴性。结论　本法具有敏感、快速、特异、准确的优点 ,是一种可靠的实验手段     

Frequency of mitochondrial 12S rRNA gene A1555G and 961 insC mutations among children with sensorineural deafness in China

Objective： To investigate the frequency of mitochondrial 12S rRNA gene A1555G and 961 insC mutations among Chinese with sensorineural deafness. Methods： Blood samples from 78 sporadic cases with sensorineural deafness were obtained and DNA was extracted from the leukocytes, then the mitochondrial DNA target fragments were amplified by polymerase chain reaction（PCR）. The 1555G mutations were detected by BsmA 1 restriction endonuclease digestion, every fragment was analyzed by sequencing; All the 961 insC mutation were detected by direct sequencing. Results： The percent age of A1555G mutation and mt961C insertion were 6.4% and 2.6% in the hearing-impaired Chinese subjects respectively. Conclusion： A1555G and 961insC mutations in mitochondrial DNA 12S rRNA gene regions may play a role in the pathogenesis of hearing loss in the sporadic cases.     

实时荧光定量聚合酶链反应在检测大肠埃希菌引起血流感染中的应用

目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在检测大肠埃希菌引起血流感染中的应用.方法 从血培养阳性瓶中提取细菌基因组DNA,以大肠埃希菌特异性引物应用实时荧光定量,扩增16S rRNA靶片段,同期进行细菌培养鉴定,对比实验结果.结果 通过对实时FQ-PCR体系特异性、敏感度、稳定性验证,结果表明具有较好的特异性...