微量肿瘤源性未知突变基因的检测方法及进展

恶性肿瘤已跃居中国农村与城市居民死因第一位。从分子水平上看,肿瘤是由于细胞在致癌因素的影响下发生基因突变,失去对生长的正常调控而导致的单克隆性异常增生所致。随着分子生物学技术的迅猛发展,不仅肿瘤组织,其他临床标本如血浆[1]、穿刺液[2]、尿液[3]、粪便[4]等均能检测出肿瘤源性     

儿童甲型H1N1病毒感染早期血常规特点及C反应蛋白水平分析

目的分析甲型H1N1流感(甲流)患儿血常规特点及C反应蛋白水平特点,为初步诊断儿童甲流提供帮助。方法选择205例甲流患儿、135例普通流感患儿和60名健康对照儿童,统计分析白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比和全血CRP水平。三组间计量资料比较采用ANOVA单因素方差分析,两两组间计量资料比较采用SNK-q检验。结果甲流组、普通流感组和健康对照组WBC均值分别为(6.83±2.80)×109、(8.61±4.07)×109、(8.13±1.99)×109,PLT总数均值分别为(242.44±85.70)×109、(326.74±116.03)×109、(248.67±42.16)×109,MPV均值分别为(8.62±0.95)fl、(8.40±0.78)fl、(9.41±0.61)fl。三组间WBC差异无统计学意义(F=2.6,P0.05),PLT总数差异有统计学意义(F=7.150,P0.05),MPV差异有统计学意义(F=5.981,P0.05)。甲流组患者淋巴细胞和中性粒细胞百分比与健康对照组比较差异无统计学意义(q值分别为0.57、2.06,P值均0.05),但单核细胞百分比明显高于健康对照组和普通流感组,差异有统计学意义(q值分别为8.17、5.39,P值均0.05)。结论甲型H1N1流感感染早期儿童血常规WBC无显著变化,单核细胞比例和CRP水平增高,而PLT总数低于普通流感患儿,可为鉴别普通流感和甲流提供参考。     

利用等位基因特异性扩增检测人结直肠癌BRAF基因V600E突变

目的建立一种基于等位基因特异性扩增技术检测人BRAF基因V600E突变的技术,用于检测低水平肿瘤点突变。方法设计选择性扩增人BRAF基因V600E的引物,利用BRAF V600E突变型大肠癌细胞系HT29核酸混合于BRAF野生型大肠癌细胞系SW480中进行灵敏度检测,通过与Sanger测序法比较,利用其检测40例结直肠癌石蜡标本的BRAF V600E突变情况。结果模拟细胞系混合检测显示该方法可检测出6.2%混杂于野生型基因里的BRAF V600E突变,利用该方法在40例大肠癌标本中成功检测出3例BRAF V600E突变,与测序法检出结果一致。结论成功建立了利用等位基因特异性扩增技术检测人BRAF基因V600E突变的实验技术并用于检测实体肿瘤标本,与测序法相比该方法具有灵敏、简便、快速的特点,可用于人肿瘤BRAF V600E突变的筛查应用。     

K562细胞分泌exosomes的观察及膜表面标志分子CD63的克隆

目的观察K562细胞分泌的外泌体exosomes.构建CD63与绿色荧光蛋白融合蛋白载体,并在K562细胞中表达。方法采用梯度离心的方法分离K562细胞培养上清中的exosomes,并用扫描电镜观察。构建pEGFP-N1-CD63重组质粒,以不同方式转染至K562细胞,观察表达效率的差异。结果质粒pEGFP-N1-CD63经测序鉴定,通过激光共聚焦显微镜观察,能够在K562细胞中表达。Amaxa核转染的效率高于脂质体转染的方式。结论成功构建pEGFP—N1-CD63质粒并在K562细胞中表达,可对exosomes进行示踪,为后续实验奠定基础。     

循环肿瘤细胞检测与临床应用进展

循环肿瘤细胞是指自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞,其已被研究证实是包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌等在内的多种癌症的诊断和预后标志物,有助于肿瘤的体外早期诊断、耐药性监测,判断预后及生存分析,检测肿瘤复发、评价药物疗效以辅助治疗决策及调整治疗方案.但目前循环肿瘤细胞的检测方法仍存在一定的局限性,研究出具有更高灵敏度和特异性的检测新方法将有助于循环肿瘤细胞在临床上的应用.本文将从循环肿瘤细胞的检测技术、临床应用以及临床应用展望等方面对循环肿瘤细胞检测的研究进展和临床应用作一简述.     

HIV-1电化学活性-非活性开关分子信标的构建及验证

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)电化学活性-非活性开关分子信标(CAs-MB)并验证其结构及功能。方法合成并纯化针对HIV-1 gag基因保守区序列的CAs-MB,用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和循环伏安法(CV)验证其结构,用差分脉冲伏安法(DPV)信号强度评价CAs-MB的识别功能。结果胭脂红酸(CA)单体与CAs-MB FT-IR图的变化证明CA已标记于MB末端,CV图证明CAs-MB电化学活性ON和OFF状态的存在。DPV结果证实其能够在电化学平台上实现对目标序列的特异性识别,且能够区分一个碱基的差异。结论 CAs-MB作为HIV-1 gag基因的特异性识别元件有望用于构建新型HIV-1电化学基因传感器。     

真菌通用引物结合高分辨熔解曲线分析检测鉴定常见曲霉菌

目的探索一种能够快速检测鉴定临床常见侵袭性曲霉菌病原的新型分子生物学方法。方法以真菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2为靶基因,在5.8S、28S rRNA基因上设计泛真菌通用引物,扩增临床常见曲霉菌。同时用新生隐球菌基因组DNA、人基因组DNA及临床常见细菌基因组DNA进行引物特异性检测。将通用真菌引物扩增产物进行高分辨熔解曲线分析。以新鲜提取的烟曲霉基因组DNA为模板按照1∶10的比例梯度稀释,进行敏感性检测。检测7个浓度梯度的烟曲霉基因组DNA。结果设计的真菌通用引物可以扩增临床常见的4种曲霉菌及新生隐球菌,但与人基因组DNA和临床常见细菌基因组DNA无扩增反应,检测限可低至1.5 pg/μl,且4种曲霉菌及新生隐球菌扩增产物的熔解曲线不同。该方法敏感性和特异性均较好。结论利用真菌通用引物的扩增产物结合高分辨熔解曲线分析可以达到检测鉴定临床常见4种曲霉菌的目的,此方法对侵袭性曲霉菌的快速检测鉴定具有重要意义。     

真菌通用引物结合高分辨熔解曲线分析检测鉴定常见曲霉菌

目的探索一种能够快速检测鉴定临床常见侵袭性曲霉菌病原的新型分子生物学方法。方法以真菌核糖体RNA基因的内转录间隔区2为靶基因,在5.8S、28S rRNA基因上设计泛真菌通用引物,扩增临床常见曲霉菌。同时用新生隐球菌基因组DNA、人基因组DNA及临床常见细菌基因组DNA进行引物特异性检测。将通用真菌引物扩增产物进行高分辨熔解曲线分析。以新鲜提取的烟曲霉基因组DNA为模板按照1∶10的比例梯度稀释,进行敏感性检测。检测7个浓度梯度的烟曲霉基因组DNA。结果设计的真菌通用引物可以扩增临床常见的4种曲霉菌及新生隐球菌,但与人基因组DNA和临床常见细菌基因组DNA无扩增反应,检测限可低至1.5 pg/μl,且4种曲霉菌及新生隐球菌扩增产物的熔解曲线不同。该方法敏感性和特异性均较好。结论利用真菌通用引物的扩增产物结合高分辨熔解曲线分析可以达到检测鉴定临床常见4种曲霉菌的目的,此方法对侵袭性曲霉菌的快速检测鉴定具有重要意义。     

不同方法鉴定临床常见念珠菌性能评价

目的 评估表型鉴定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析、真菌核糖体内转录间隔区序列测序三种方法鉴定念珠菌株的性能。方法收集分离自临床标本的63株念珠菌,采用表型鉴定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析、真菌核糖体内转录间隔区序列分析三种方法进行念珠菌鉴定,以序列分析作为参考方法,比较表型鉴定与质谱分析对于念珠菌的鉴定性能。结果（1）真菌表型鉴定与测序鉴定结果一致率93.44%（57/61）。（2）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与测序鉴定结果一致率96.7%（59/61）。（3）表型鉴定与质谱分析鉴定结果差异无统计学意义。结论念珠菌生化表型鉴定可作为临床念珠菌株的常规鉴定方法,满足临床需要。当临床念珠菌株生化表型鉴定结果不确定时,应直接进行真菌rDNA ITS测序,不应加做质谱鉴定。有条件的实验室应首选MALDI-TOF MS质谱分析方法鉴定念珠菌以获得最大的鉴定效率,并可作为疑难菌种鉴定确诊方法。当质谱鉴定的结果不确定时,应直接进行真菌rDNA ITS测序,不应再用表型鉴定的方法确认鉴定结果。     

个体化用药的基因诊断-检验医师培养新方向

人类基因组计划（humangenomeproject．HGP）确定、阐明和记录了组成人类基因组的全部DNA序列信息。基因组序列的公布,为传统医学向个体化医疗的转化开启了大门。