脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

目的 初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法 根据病脊液标本中常见病原菌16SrRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物，制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针，以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针，将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增．扩增过程中用生物素标记；将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交．检测脑脊液中细菌的感染情况。结果 所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。     

环介导等温扩增法直接检测阳性血培养瓶中大肠埃希菌

目的：应用环介导等温扩增技术（LAMP）建立一种快速敏感的直接检测阳性血培养瓶中大肠埃希菌的方法。方法根据美国国立卫生研究院基因序列数据库（GenBank）上大肠埃希菌的lacZ（登录号：M74750）基因序列,设计4条特异引物（2条内引物、2条外引物）,对lacZ基因进行扩增,对扩增反应进行优化。分别验证该方法的特异性及敏感性,并与传统培养法进行比较。结果在300份阳性血培养瓶中,采用LAMP法检测到68株大肠埃希菌,所设计引物对大肠埃希菌扩增的特异性及敏感性均较好,与传统培养法比较,灵敏度和特异性均达100％,但传统培养法的检出时间为3d,而LAMP法的检出时间只需1h。结论LAMP检测大肠埃希菌是快速、低成本、特异性强、灵敏度高的方法,适合临床开展。     

妇科住院患者感染病原菌分布及耐药性分析

目的了解妇科住院患者感染的病原菌分布及药敏特点。方法分析2001-2005年本院妇科住院943例患者临床感染有关的病原学资料。结果全组有79例（8．37％）发生医院内感染；主要为尿路感染47例和肺部感染16例；共检出122株病原菌，革兰阴性菌为95株（77．87％），较常见的为大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌；革兰阳性菌27株（22．13％），较常见的为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌：这些菌株对临床常用抗生素均有不同程度的耐药，且呈多重耐药趋势。结论大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌为妇科临床感染的主要病原菌，其耐药性不断增加，应当引起足够重视，并合理使用抗生素。     

UP-PCR结合RFLP对脑脊液标本中病原菌的检测

①目的　建立通用引物聚合酶链反应 (UP PCR)结合限制性酶切片段长度多态性 (RFLP)酶切图谱分析快速检测脑脊液标本中常见病原菌的方法。②方法　通过对体液标本中常见病原菌 16SrRNA基因保守区的序列分析 ,设计通用引物 ,对不同细菌的DNA进行UP PCP扩增 ,确定标本是否有细菌感染 ,然后对阳性标本的扩增产物分别用不同的限制性内切酶酶切 ,进行RFLP分析 ,进一步鉴定细菌。并与常规细菌培养鉴定法进行比较。③结果　UP PCR结合RFLP法最低可检测出 8cfu·mL-1大肠埃希菌和 2 5 0cfu·mL-1金黄色葡萄球菌 ;该法对10 2份脑脊液标本的检测中 ,其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为 92 .3%、96 .6 %、80 .0 %和 98.0 % ,较培养法好。④结论　该方法可以准确、快速地检测出脑脊液标本中感染的病原菌。     

兔支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种简便、快速、敏感、特异的适用于支气管败血波氏杆菌的PCR检测方法。方法根据兔支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）的fim2基因序列设计了一对特异性引物，进行PCR扩增、特异性和敏感性试验，并将其应用于临床样品的检测。结果利用该PCR方法扩增出425bp的目的基因片段，该产物序列与GeneBank上公布的基因序列同源性为100％。特异性试验表明，该方法对大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌均无交叉性反应；并且最小可检出菌液浓度为3．6CPU。用该PCR方法检测了从江苏、山东等地采集的146份兔鼻拭子，结果检出支气管败血波氏杆菌阳性92例，阳性率为63．01％。结论建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。     

婴幼儿奶粉中病原菌多重PCR检测研究

目的建立婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法。方法根据阪崎肠杆菌外膜蛋白A（ompA）基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列，设计两对特异性引物。对反应条件进行优化，建立针对婴幼儿奶粉中常见病原菌的多重PCR检测方法，并对奶粉进行模拟检测。结果两对引物能特异扩出282bp和482bp的目的条带；在优化条件下，可同时检测模拟样品中两菌DNA，灵敏度达到10^3CFU／ml。结论与传统方法比较，研究建立的多重PCR方法敏感、特异，为快速检测奶粉中病原菌提供了有效手段。     

老年精神科下呼吸道感染病原分布及耐药分析

目的探讨老年精神科患者下呼吸道感染病原菌的分布及耐药性,为临床合理选用抗菌药物提供依据。方法对浙江省湖州市第三人民医院老年精神科送检的1909份痰标本分离的病原菌及药敏结果进行统计分析。结果 1 909份痰标本共有1 201份阳性,阳性率为62.9%,共检出菌株1 452株,其中革兰阴性（G^-）杆菌845株（58.2%）,以肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌以及副流感嗜血杆菌为主。肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌产超广谱-内酰胺酶（ESBLs）分别为30.2%和47.0%。革兰阳性（G^＋）球菌156株（10.7%）,以金黄色葡萄球菌为主,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）占70.4%。真菌451株（31.1%）,以白假丝酵母为主。结论老年精神科患者下呼吸道感染以革兰阴性杆菌为主,真菌感染有逐年增多的趋势,应加强临床病原菌及药敏监测,指导临床合理用药。     

2007年临床科室主要病原菌分布和耐药性分析

目的：分析2007年临床科室医院感染主要病原菌的分布及耐药趋势,为指导临床合理应用抗菌药物及控制医院感染提供依据。方法：对2007年1月至12月临床科室388例送检标本中分离的病原菌的分布和耐药性进行统计和分析。结果：共分离203株病原菌,其中真菌37株（18.23％）;革兰阳性球菌50株（24.63％）,以葡萄球菌为主,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌分别占66.7％和72.4％,未发现耐万古霉素菌株;革兰阴性杆菌116株（57.14％）,以大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、不动杆菌和变形杆菌为主,产ESBLs的大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌为84.0％和80.0％。革兰阴性菌对碳青霉烯类耐药率最低,对部分抗菌药产生多重耐药。结论：医院感染病原菌耐药性严重,定期进行耐药性监测,对指导临床合理应用抗生素和有效控制医院感染有重要意义。     

腹腔镜胆囊切除术后医院感染病原菌及其耐药性分析

目的：分析胆结石患者腹腔镜胆囊切除术后医院感染病原菌及其耐药性。方法选取行腹腔镜胆囊切除术的胆结石合并医院感染的患者147例,对患者切口标本进行细菌培养和菌株鉴定。结果147例医院感染的行腹腔镜胆囊切除术的胆结石患者共分离出病原菌147株,其中革兰阴性杆菌76株（52.05%）,革兰阳性球菌59株（40.41%）,真菌12株（8.22%）,显示大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的构成比最高;大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌对氨苄西林的耐药性都很高,在88.89%以上,3种病原菌对阿米卡星的耐药性都最低,为0%,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对美罗培南和亚胺培南的耐药性都为0%。表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率都达到100%,对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺的耐药性都极低。结论研究胆结石腹腔镜胆囊切除术后医院感染病原菌及其耐药性对患者选取敏感性好的抗菌药有重要意义。     

PCR法检测葡萄球菌肠毒素A基因

目的 建立PCR方法快速检测葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A,SEA)基因.方法 根据SEA基因的序列,设计PCR引物特异性扩增靶基因片段,对1株产SEA金黄色葡萄球菌和9株对照菌株进行PCR检测,评价其特异性和敏感性.另检测30株金黄色葡萄球菌SEA基因的携带情况.结果 建立PCR方法快速检测SEA基因,扩增产物长度为439bp.PCR反应体系中有29cfu的产SEA金黄色葡萄球菌即可检出SEA基因,30株分离的金黄色葡萄球菌中有10株携带有SEA基因.结论 PCR法可以快速、敏感地检测SEA基因,为金黄色葡萄球菌食物中毒诊断提供依据.     

东方田鼠特异DNA片段的克隆及核苷酸序列分析

根据泰泽氏菌rDNA序列设计出二对特异引物，以标准菌RJ株和大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌纯化的DNA为模板，进行套式PCR反应。结果用外引物扩增，泰泽氏菌和大肠杆菌均出现625bp的反应带，其它细菌无反应带；而用内引物第二次扩增，只有泰泽氏菌出现196bp的特异扩增带，将PCR方法应用于人工免疫抑制的SD大鼠，检出率为30％（9／30）。同时将此30份血清用间接免疫荧光法（IFA）进行检测，结果未检出阳性样品。结果提示，套式PCR方法具有特异性强、敏感性高，简便快速的特点。     

PCR测肝硬化腹水中细菌DNA的研究

目的探讨用PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性,了解肝硬化患者发生细菌移位的高危因素。方法在细菌16S rRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBV-DNA、37份肝硬化患者腹水进行PCR扩增。腹水中细菌DNA阳性者纯化后经核苷酸测序鉴别细菌种类,同时收集患者临床资料,运用SPSS11.5软件对患者基本临床特征及主要检验结果进行统计分析。结果7种对照菌株均得530bpDNA片段,而与人基因组DNA、HBV-DNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。37份腹水中有9份获得530bp DNA片段(24.3%),而腹水细菌培养阳性率为5.4%(2/37),二者比较有显著性差异(P<0.05)。腹水中细菌DNA阳性和阴性的两组肝硬化患者在上消化道出血的发生率、血清总胆红素水平、凝血酶原活动度、Child-Pugh积分、腹水总蛋白浓度、外周血白细胞总数等比较,有显著性差异(P<0.05)。结论用通用引物通过PCR方法扩增细菌16S rRNA基因具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。肝功能损害、腹水调理活性低下和上消化道出血是肝硬化患者发生细菌移位的高危因素。     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

半套式PCR和DNA探针技术检测Q热立克次体

目的 建立半套式PCR和DNA探针技术由于检测Q热立克次体。方法 依据已知的Q热立克次体的16S和23S rRNA基因及其间区的序列。设计3条引物,建立了扩增16S－23S mRNA基因间区的半套式PCR方法,并将扩增片段制成探针,建立了斑点杂交技术。结果 10株Q热立克次体分离株均可扩增出572bp的PCR条带,而对照菌都为阴性,此半套式PCR方法的灵敏度高达1pg;用九里株扩增片段标记后制成的探针,与10个Q热立克次体分离株的全DNA呈阳性杂交,对照菌为阴性,此杂交方法的灵敏度为0．5ng。结论 基于Q热立克次体16S－23S rRNA基因间区的半套式PCR和DNA探针技术具有较好的特异性和灵敏度,可联合应用于Q热的病原学诊断。     

空肠弯曲菌套式PCR快速检测方法的建立与初步应用

目的建立套式PCR快速检测实验动物空肠弯曲菌的方法。方法根据GenBank数据库的空肠弯曲菌flaA基因设计2对引物，对空肠弯曲菌抽提DNA作PCR扩增及克隆测序。同时，对其他病原菌抽提核酸扩增，并对120份临床样品进行检测。结果空肠弯曲菌经2对引物分别扩增出1719bp和640bp片段，与预期大小一致。套式PCR检测的最低限度为10CFU。整个检测过程可在8h内完成。而其他病原菌未出现特异性扩增条带。采用套式PCR对121份临床样品进行检测，检出31份阳性，与传统的细菌分离方法完全一致。结论本研究建立的套式PCR方法具有很好的特异性和敏感性，可用于实验动物空肠弯曲菌的快速检测。     

PCR法检测细菌23S rDNA在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的　研究建立快速检测细菌DNA的方法。方法　设计一对共同引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)法 ,扩增细菌核糖体 2 3S亚单位基因 2 3SrDNA。对 2 3种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用该方法进行检测 ,并与常规细菌培养法比较。结果　该方法可检测细菌下限为 2 5CFU ,与真菌、乙肝病毒等无交叉反应。对纯菌及培养物均可检出一条明显DNA条带 ,革兰阴性细菌约 35 0bp ,革兰阳性细菌约 4 0 0bp。临床标本 2 3SrDNA检出率明显高于常规培养方法 (P <0 0 1)。结论　应用所设计的共同引物 ,检测细菌 2 3SrDNA ,敏感性和特异性好 ,比常规培养法快速、准确。     

Establishment of a multiplex PCR system to diagnose tuberculosis and other bacterial infections

BactirialinfectiousdiseasesareverycommoninchildrenofChina.Manysevereinfectionssuchaspu-rulentmeningitis,tuberculousmeningitisandsepsisstillthreatenchildren'shealthandeventheirlives.Bacterialcultureisaclassicmethedtodetectthepathogensofinfectiousdiseases,butithastotakeseveraldaysforgeneralbacteriaandeven4to8weeksfortuberclebacillus(Tb).ltcouldbringsomeperplexitiesfordoctorstodeterminetheeffectivetherapy.So,arapid,specificandsensitivemethodisrequiredfordiagnoslngbacterialinfections,speciallydif…     

青岛地区TTV抗体阳性人群的病毒基因检测及序列分析

（1）目的 了解经血传播病毒（TTV）在青岛地区的基因变异情况。（2）方法 选择TTV抗体阳性的标本,用巢式PCR技术扩增血清中的DNA特定片段,纯化后与载体连接并转入大肠杆菌JM109,提取阳性克隆的重组质粒测序并与TTV的已知序列相比较。（3）结果 在选择的20例标本中,15例扩增出TTV DNA,对其中1株测序后与已知序列AB008394比较,发现碱基变异率为13．3％。（4）结论 青岛地区存在TTV变异株。     

布鲁菌病半套式PCR检测方法的建立

目的 建立布鲁菌属半套式PCR检测方法。方法根据布鲁菌BCSP-31蛋白基因设计三条引物，扩增目的片段长223bP，通过条件优化，建立了布鲁菌属半套式PCR检测方法。利用所建立的PCR方法对六个种布鲁菌和Y．CenterO：9，S．TyPhi，E．Coli O：157进行检测验证其特异性，通过对活菌计数检测验证其敏感性。结果检测结果表明六个种布鲁菌均可扩出223bP的目的片段，而Y．Center O：9，S．TyPhi和E．Coli O：157不能扩出目的片段。通过对活菌计数最低可检测到20个细菌。结论本研究建立了敏感、特异的布鲁菌病半套式PCR快速检测方法，为布鲁菌的检测和试剂盒的研制奠定了基础。