ICR胎鼠成纤维细胞培养方法的优化

目的确定胎鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)最优制备方法,为MEF的制备节省时间与原材料。方法取胎鼠组织,采用组织块培养法、胰酶消化培养法、胰酶消后组织块培养法进行分离培养MEF,比较观察MEF纯度、生长速度、细胞形态等指标,筛选最节省时间与原料的一种培养方法。结果组织块培养法所得MEF生长速度慢,细胞体积小,杂细胞少,纯化所需传代次数少。胰酶消化培养法的MEF生长速度快,体积较大,杂细胞数量多,纯化所需传代次数较多。胰酶消化后组织块培养法的消化后组织块的成纤维细胞生长速度介于前两种方法之间,细胞体积和形态与组织块法培养结果相似,杂细胞数量较少,纯化所需传代次数少。结论胰酶消化结合组织块培养法能最大限度的利用材料,在短时间内可制备大量MEF,满足核移植试验与作为饲养层细胞的需求。因此,胰酶消化结合组织块培养法是MEF最优培养方法。     

雪旺氏细胞体外培养方法研究

为在短时期内培养大量的雪旺氏细胞，本文对目前常用的两种培养方法进行了比较。方法：采用植块反复种植法和酶消化法分别进行雪旺氏细胞的体外培养。结果表明两种方法都能得到雪旺氏细胞。但酶消化法所培养的雪旺氏细胞生长一致，相同条件下达到一定细胞数量所需时间短于植块反复种植法。酶消化法比植块反复种植法更适用于大量雪旺氏细胞的培养。     

不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的比较研究

目的比较不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的效率，确定体外培养兔结膜上皮细胞的最佳方法，建立兔结膜上皮细胞系，为进一步研究结膜上皮干细胞的鉴别、定位及其增殖分化提供基础。方法分别采用DispaseⅡ消化法、组织块培养法、胰酶／EDTA混合消化法获得兔结膜上皮细胞后进行体外培养，在不同时间观察细胞的形态，并应用免疫组化的方法进行细胞鉴定。结果组织块培养法细胞生长较慢，胰酶／EDTA混合消化法容易有成纤维细胞等污染，DispaseⅡ化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞，细胞生长增殖快，免疫荧光pan-cytoeratin染色阳性．部分细胞MUC5AC染色阳性。结论DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的最佳方法。     

昆明种乳鼠肝细胞原代培养方法的比较研究

目的 通过比较3种昆明鼠乳鼠肝细胞原代培养的方法,探索一种更有效、快捷的原代培养方法。方法 取30只1~3日龄昆明种乳鼠,随机分为3组,分别采用组织块培养法、胰酶消化法、组织块联合胰酶消化法进行肝细胞原代培养,用倒置显微镜观察实验过程中肝细胞的形态及生长情况。结果 3种方法均能进行乳鼠肝细胞的原代培养,其中组织块联合胰酶消化法培养的肝细胞形态学和生物学特性优于其他两种方法培养的细胞。结论 组织块联合胰酶消化法是3种方法中最快速和高效的一种方法,获得的乳鼠肝细胞形态及生物学特性好,为体外建立乳鼠肝细胞实验模型奠定了实验基础。     

新生大鼠成纤维细胞原代培养

目的探讨新生sD大鼠成纤维细胞的培养方法。方法采用胰酶消化法和组织块贴壁法原代培养成纤堆细胞。采用HE染色及波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定。结果两种方法均能培养出成纤维细胞,其中酶消化法一次性可获得较多细胞,但细胞状态较差,贴壁慢,生长慢;组织块贴壁法短时间内可长出大量成纤维细胞,一周即可传代。HE染色后倒置相差显微镜下观察细胞形态典型,免疫细胞化学染色结果显示Vimentin呈阳性反应。结论组织块贴壁培养法是获取成纤维细胞简单,可行,快速的方法。     

乳鼠心肌细胞酶消化培养和贴块培养法的比较

目的探索经济、简单易行的心肌细胞培养方法。方法选用新生乳大鼠心肌细胞进行0．25％胰酶分离培养和贴块培养两种培养方法。结果用0．25％胰酶消化培养可获得大量的单细胞，但是酶对细胞的损伤比较大，酶消化所受的影响因素比较多，此过程获取单细胞所需的时间比较长；贴块培养法简便易行，得到的细胞结构完整、存活率高，且经济实惠、适合长期研究且需细胞量不多的实验。结论酶分离培养和贴块培养各有优劣势，应根据不同的实验目的选用不同的培养方法。     

胎脑细胞悬液的制备及活力测定

水囊引产胎儿７例，取其大脑皮层和中脑腹侧组织分别应用胰酶消化法和研磨过滤法制备胎脑细胞悬液，应用吖啶橙－溴化乙锭荧光染色来判定悬液中细胞活力。结果表明：应用胰酶消化法制备的大脑皮层和中脑腹侧胎脑细胞悬液中的细胞活力分别显著地高于应用研磨过滤法制备的大脑皮层和中脑腹侧胎脑细胞悬液；应用两种方法制备的大脑皮层胎脑细胞悬液的活力分别显著地高于两种方法制备的中脑腹侧胎脑细胞悬液（Ｐ＜０．００１）。本文讨论     

改良消化复合植块法培养新生大鼠雪旺细胞

目的探讨改良的单酶消化法与组织贴块法相结合的培养雪旺细胞(SCs)的方法,并与经典植块法和普通消化复合植块法进行比较。方法取新生3~5 d的SD大鼠双侧坐骨神经和臂丛神经,分别采用经典植块法、普通消化复合植块法、改良消化复合植块法培养SCs。培养7 d后进行细胞消化和传代,在显微镜下计数并计算细胞总量。用S-100免疫荧光染色法检测所获细胞的纯度。结果改良消化复合植块法培养的SCs生长增殖速度最快,可获取(1.85±0.13)×106个细胞;普通消化复合植块法次之,可获取(1.10±0.10)×106个细胞;经典植块法所获SCs的生长增殖速度最慢,可获取(0.77±0.03)×106个细胞,3种方法比较差异均有统计学意义(P<0.01)。S-100免疫荧光染色结果显示,改良消化复合植块法细胞纯度为(95.73±1.51)%,普通消化复合植块法为(84.66±2.68)%,经典植块法为(74.50±4.23)%,3种方法比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论改良消化复合植块法可以在短时间内获得大量高纯度的SCs,为研究周围神经修复再生奠定良好的基础。     

人肝癌组织伴生成纤维细胞的体外培养及其生物学性状的初步探讨

目的:体外培养人肝癌组织伴生成纤维细胞,观察其生长状态,为进一步研究其功能奠定基础。方法:应用组织块培养法进行人肝癌伴生成纤维细胞的原代培养,细胞铺满培养瓶底后首次传代,通过胰酶消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;通过倒置显微镜观察细胞形态、免疫组织化学方法检测细胞膜波形蛋白(v im entin)、角蛋白(keratin)表达情况,对细胞进行鉴定。结果:组织块法原代培养约1周可见纤维样细胞从组织块周围游出,5周左右细胞基本长满培养瓶底。首次传代时应用胰酶消化法进行成纤维细胞的初次纯化,第2次转种时先后应用酶消化法和反复贴壁法再次进行细胞纯化,第3代以后基本可获得呈典型克隆性生长、长梭形纤维样细胞,生长周期短。免疫组化染色结果为v im entin染色阳性,keratin染色阴性。结论:在体外成功培养了人肝癌组织伴生成纤维细胞,并对其生物学性状进行了初步探讨,为进一步研究其与肝癌细胞生长、浸润及转移的关系等机制奠定了基础。     

胚胎神经干细胞的分离和培养

目的：分离培养胚胎神经干细胞，探讨神经干细胞的取材方法。方珐：在解剖显微镜下，从孕11d(E11d)大鼠胚胎剥离神经管，剪成组织块进行培养，同时取部分神经管经胰酶消化后，获取细胞悬液进行单细胞培养；于培养后不同时间观察细胞的生长状况。结果：在组织块培养和单细胞培养中，接种细胞均生长良好；体外培养5d时，从组织块边缘放射状生长、迁移出细胞，并伸出突起；单细胞培养中，细胞增殖成团并长出突起连成网状。结论：组织块和单细胞培养法均可以从胚胎神经管分离、培养神经干细胞。     

人大肠癌细胞原代培养方法的改进

目的:建立一种简单方便但高效的人大肠癌细胞原代培养方法。方法:无菌条件下切取肿瘤组织,比较不同培养基、细胞培养方法和细胞纯化方法对大肠癌细胞原代培养过程的影响,通过免疫细胞化学方法检测表面标记物的表达情况,观察原代的生物学特性。结果:采用改良的DMEM培养基,用组织块培养法和胰酶消化法纯化培养的细胞,大肠癌细胞原代培养的成功率较高。免疫细胞化学检测培养细胞来源于上皮组织。结论:应用改进的人大肠癌细胞原代培养方法,操作简便,重复性好,可满足实验要求。     

人胚胎生殖系细胞分离与体外培养的初步研究

目的:初步探讨人胚胎生殖系细胞的分离与体外培养.方法:体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织,按单纯机械分离、酶消化分离、二者结合法及是否有饲养层将组织分为5种不同的方式培养后,用碱性磷酸酶标记,计数阳性克隆并进行比较.结果:酶消化法培养所获得的克隆较单纯机械分离方法多,原代培养时种植到饲养层上效果较好.将分离到的组织用0.25％胰酶消化3 min,种植到丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上培养3 d,挑取克隆传代,在第10天形成30.7 个阳性克隆,显著高于其他方法获得的阳性克隆数.用碱性磷酸酶标记的细胞(克隆)具有多样性,细胞胞体为圆形,分为有突起和无突起两种;阳性细胞克隆呈圆球形、条带形和块形,与周围细胞分界清楚.结论:人胚胎体内的微环境限制生殖系细胞的体外扩增培养,原代培养需要在饲养层上进行且宜用酶消化法尽早传代.     

家蝇细胞培养方法的探讨

目的探讨家蝇细胞培养的方法。方法分别取家蝇初孵幼虫、无菌家蝇卵初孵幼虫以及家蝇卵(胚胎)进行细胞培养,采用不同方法传代,观察细胞生长。结果取家蝇初孵幼虫进行培养,易出现霉菌污染,培养不能成功;用无菌的家蝇卵初孵幼虫进行培养,细胞生长较慢;用家蝇卵(胚胎)进行细胞培养,细胞生长快。直接吹打法传代,细胞不能生长;机械刮取法细胞能生长,但细胞容易丢失;胰酶消化法传代,细胞能迅速生长。结论取家蝇卵(胚胎)进行细胞培养,并用胰酶消化法传代是最佳的方法。     

原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究

目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Ｗｉｓｔａｒ大鼠做为肝细胞供体,分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并原代培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在位相关倒置显微镜下观察细胞形态变化,ＭＴＴ法测培养细胞活性,并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳,而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整,贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分     

原代小胶质细胞及神经元细胞培养不同纯化方法的比较

目的探讨建立简便高效的原代小胶质细胞及神经元培养和纯化方法。方法神经元与胶质细胞混合培养后,采用温和胰酶消化法、恒温振荡法、利多卡因分离法及手摇法分离纯化小胶质细胞,无血清培养法及阿糖胞苷法分离纯化神经元,细胞计数、流式细胞术及细胞化学染色鉴定小胶质细胞及神经元。结果手摇法分离纯化小胶质细胞与温和胰酶消化法、恒温振荡法、利多卡因分离法比较,细胞产量更高、活性更好;无血清培养法培养神经元比阿糖胞苷法细胞纯度更高、活性更好,形成神经网络结构的时间也更早。结论手摇法分离纯化小胶质细胞是产量最高、简便、经济的方法,而无血清培养法更能提高神经元的纯度及活性。     

BXSB狼疮小鼠胸腺上皮细胞培养方法的建立

目的：比较不同培养条件下原代狼疮小鼠胸腺上皮细胞生长情况。 方法：分别采用剪切法、剪切加胶原酶消化法、剪切加胰蛋白酶消化法建立培养体系获取自发性系统性红斑狼疮小鼠（BXSB小鼠）胸腺上皮细胞;用光镜、免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定。 结果：含血清的培养基与含生长因子的培养基均能培养出较纯的胸腺上皮细胞;剪切法成纤维细胞污染较多,剪切加胰蛋白酶消化法细胞生长状态较差,经剪切加胶原酶消化的BXSB胸腺植块,生长状态好,成纤维细胞污染少;当原代培养的细胞长满瓶壁的90％左右时可传代,角蛋白染色阳性细胞纯度达95％以上。 结论：剪切加胶原酶消化法仅用含血清的培养基即可培养出符合实验要求的BXSB小鼠胸腺上皮细胞,是低成本、简便易行的系统性红斑狼疮模型鼠胸腺上皮细胞培养体系。     

一种新的小胶质细胞分离纯化方法

目的 建立一种高效率的原代小胶质细胞体外分离纯化方法.方法 以McCarthy等经典的小胶质细胞原代培养培养方法为基础,并进行改进,使用低浓度胰酶消化法帮助小胶质细胞从混合培养的胶质细胞分离下来,用OX42抗体免疫组化染色鉴定.结果 获得了高纯度的小胶质细胞.结论 低浓度胰酶消化法分离小胶质细胞与经典的振摇分离法所获得的纯度相当,但提高了细胞的分离效率.     

神经细胞的原代培养及缺血再灌注模型的建立

目的:建立良好的SD乳鼠神经细胞原代培养及缺血再灌注模型。方法:选用SD乳鼠大脑皮质进行细胞培养,采用机械研磨、过滤、胰酶消化、percoll(硅石胶态悬浮液)、密度梯度离心法分离纯化大脑皮质细胞后,选择含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养。利用分离纯化的幼鼠大脑皮质,制作细胞爬片,利用免疫组化进行鉴定。结果:大脑皮质细胞贴壁生长,4～7d基本达到融合,结合形态学及免疫细胞化学鉴定,原代细胞培养97%为神经细胞。而后采用国际上公认的氧糖剥夺发制作缺血再灌注模型。结论:采用机械研磨、过滤、胰酶消化结合percoll:密度梯度离心法分离培养的大脑皮层神经细胞数量多,均一性生长佳,采用国际上公认的氧糖剥夺发制作缺血再灌注模型。为以后实验打下基础。     

三种人脐静脉内皮细胞分离方法的比较

目的 建立人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分离和培养的方法.方法 分别采取“灌注消化法”、“机械刮取法”和“灌注搓揉法”来分离HUVECs.通过苔盼蓝排斥法检测细胞活力并计数,进行免疫荧光法鉴定,比较这3种方法在获取的细胞数目、细胞活力和纯度方面的差异.常规进行细胞的原代培养和传代培养.取第3代培养细胞绘制细胞生长曲线,根据细胞生长特点,形态及表型特征对培养细胞进行鉴定.结果 “灌注搓揉法”所分离的细胞无论从细胞数目、细胞活力和纯度方面均优于传统的“灌注消化法”和“机械刮取法”.培养的细胞从形态、生长特点和表型鉴定证实为血管内皮细胞（ECs）.结论 “灌注搓揉法”是一种获取血管ECs成功率高,可靠的方法.