人脐动脉平滑肌细胞原代培养方法的比较

目的比较人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）两种原代培养方法的优劣。方法分离脐动脉，剥离中膜，将其剪成小块，贴块法将小块直接接种于培养瓶中；酶解法①单用胶原酶Ⅰ（0．2％）分别消化5小时、8小时、24小时后接种于培养瓶，②分别用胶原酶Ⅰ（0．2％）消化3小时和胰蛋白酶（0．25％）消化2小时，接种于培养瓶。结果贴块法6天可以见到细胞从组织块周围游出，20～30天后可以进行传代；单用胶原酶Ⅰ消化24小时可以见到少量细胞，但由于细胞数少，无法进行传代；单用胶原酶Ⅰ消化5小时和8小时以及用胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶联合消化均未见到贴壁生长的细胞。结论HUASMC原代培养贴块法较酶解法简便经济且成功率较高。     

四种气管上皮细胞分离培养方法的比较研究

目的：比较四种不同的方法在培养气管上皮细胞中的异同，改进其培养技术，为组织工程气管提供种子细胞。方法：用两步酶消化法（使用0.1％ Dispase 4℃消化18h后，用0．25％的胰酶37℃消化5min）、Dispase冷消化法（用0．1％Dispase 4℃消化18h）、胰酶温消化法（0．25％的胰酶37℃消化10min）和机械刮刷法四种方法分离、培养兔气管上皮细胞，测定分离细胞的数量和纯度。结果：两步酶消化法、Dispase冷消化法较其他两种方法得到的气管上皮细胞纯度高，细胞状态好；Dispase冷消化法得到细胞数量较其他方法少，其余三种方法得到的细胞数统计学上不存在差异。结论：两步酶消化法较其他方法所得细胞数量多、纯度高、细胞成活率高，是一种较好的气管上皮细胞体外分离培养方法。     

人离体子宫在位内膜细胞的原代培养方法探讨

目的：比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同，为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法：将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养，用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果：3组的培养成功率分别为53．33％、73．33％、86．67％。联合消化组较胰酶组培养成功高（氏0．05）。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞贴壁、生长状况无明显差异（B〉0．05）。结论：采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养，较单用胰酶法细胞培养的成功率高，比单用胶原酶缩短了消化时间．具有降低培养成本的优点。     

大鼠脂肪组织源性间充质干细胞的分离及向心肌细胞的诱导分化

目的：探讨脂肪组织源性间充质干细胞体外分离培养的方法并将其向心肌细胞方向诱导分化。方法：无菌条件下获取2月龄SD大鼠腹部肠系膜脂肪组织，0．08％胰酶消化分离出单个核细胞，接种7～10d后形成单层贴壁长梭形细胞。0．25％胰酶消化传代，第3代细胞用于鉴定细胞表面分子及诱导分化。浓度为10μmol／L5-氮胞苷与分离细胞共同培养24h，3周后应用抗desmin及抗α-actnin抗体对诱导细胞进行免疫化学鉴定。结果：所分离细胞约90％表达间充质干细胞表面抗原CD13、CD44。5-氮胞苷诱导后3周，所培养的细胞形成desmin及α-actnin染色阳性的心肌细胞团。结论：体外通过消化法可从脂肪组织中分离出大量间充质干细胞，这些细胞经5-氮胞苷诱导后分化为心肌细胞。     

大鼠胚胎干细胞饲养层制作方法的改进

目的 采用两种方法制备饲养层细胞，对比观察培养效果，求得最佳培养方法，以期实现其有效利用。方法 取大鼠胚胎分离成纤维细胞，分别采用细胞悬液法和胰酶消化植块培养法对其进行培养。在生长细胞形态，活细胞百分率等方面对两种方法进行比较。结果 胰酶消化植块培养法在细胞获得量、细胞活力和贴壁细胞的形态上均优于常规的细胞悬液法，且操作简单，速度快。结论 胰酶消化植块培养法是一种能够获得高成活率、高收获量、细胞形态和生长状况良好的体细胞培养方法。     

不同消化方法对心肌成纤维细胞体外培养影响

目的对比不同消化方法对原代乳鼠心肌成纤维细胞体外培养的影响,探求更高效的细胞分离、培养方法。方法改良既往文献报道的心肌成纤维细胞分离方法,选用胶原酶、胰酶、胶原酶加胰酶消化液分别对同等数量随机挑选的同窝出生1～2 d的SD乳鼠进行心肌成纤维细胞分离,从细胞数量及活性、细胞增殖、细胞纯度及对中药、西药反应灵敏度等方面对分离出的第0代(P0)细胞及传代至第2代(P2)的细胞进行比较。结果胶原酶消化法分离所得细胞在数量、成活率、贴壁速度、增殖速度方面,明显优于胰酶消化法或胶原酶加胰酶消化法,P0.05,差异有统计学意义;在形态学上并无明显差异,且细胞纯度均可达到95%;胶原酶消化法所得细胞对中药、西药灵敏度较高,P0.05,差异有统计学意义。结论选用胶原酶作为原代乳鼠心肌成纤维细胞的消化酶,运用时间梯度消化细胞,可以高效得到数量多、活性好、纯度高、对药物反应灵敏的细胞。     

ICR胎鼠成纤维细胞培养方法的优化

目的确定胎鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)最优制备方法,为MEF的制备节省时间与原材料。方法取胎鼠组织,采用组织块培养法、胰酶消化培养法、胰酶消后组织块培养法进行分离培养MEF,比较观察MEF纯度、生长速度、细胞形态等指标,筛选最节省时间与原料的一种培养方法。结果组织块培养法所得MEF生长速度慢,细胞体积小,杂细胞少,纯化所需传代次数少。胰酶消化培养法的MEF生长速度快,体积较大,杂细胞数量多,纯化所需传代次数较多。胰酶消化后组织块培养法的消化后组织块的成纤维细胞生长速度介于前两种方法之间,细胞体积和形态与组织块法培养结果相似,杂细胞数量较少,纯化所需传代次数少。结论胰酶消化结合组织块培养法能最大限度的利用材料,在短时间内可制备大量MEF,满足核移植试验与作为饲养层细胞的需求。因此,胰酶消化结合组织块培养法是MEF最优培养方法。     

人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定

目的 改进静脉内皮细胞原代培养的方法，提高体外培养血管内皮细胞的成功率。方法 采用5号带柄一次性静脉输液针灌注消化液，分别用0．125％、0．25％胰蛋白酶和0．1％胶原酶消化脐静脉内膜，比较三种酶液消化的结果，并在倒置相差显微镜下观察其形态特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。结果 0．125％、0．25％胰蛋白酶和0．1％胶原酶的最佳消化时间分别为15min，10min，12min，倒置相差显微镜下观察内皮细胞为单层生长，鹅卵石样镶嵌排列。免疫组织化学检测表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原。结论 胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，且0．1％胶原酶消化12min获得的细胞数量多，成活率高。     

人牙龈上皮细胞的原代和传代培养

目的：研究人龈上皮细胞体外原代和传代培养，建立能够体外长期培养的人龈上皮细胞系。方法：取健康龈组织块，经0．25％分离酶作用后．将上皮组织与其下的结缔组织分离，0.125％胰酶消化上皮组织形成细胞悬液，接种培养。当细胞汇合达80％时，1：2传代培养。结果：获得的原代培养细胞表达细胞角蛋白，结合细胞形态。可初步认定为龈上皮细胞。原代培养的人龈上皮细胞部分可以传代培养到第3代。结论：建立能够长期体外培养的龈上皮细胞系具一定可行性。     

一种高成活率培养大鼠原代心肌细胞的方法

【目的】探讨原代心肌细胞培养的条件和方法。【方法】取新生1～3d的SD大鼠心室肌,O．25％胰蛋自酶-0．02％EDTA消化后,培养于DMEM—F12培养液中,用差速贴壁法和化学抑制法相结合去除非心肌细胞。倒置显微镜下观察形态学变化,透射电镜观察细胞超微结构。【结果】培养的心肌细胞平均存活率（96．33±6．73）％,培养第4天细胞搏动率达（95．3±9.2）％,并出现单层同步搏动,具有典型的心肌细胞形态特征。【结论】本研究的心肌细胞培养方法操作简便,成活率高,是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。     

三种不同乳鼠原代心肌细胞消化分离方法的对比研究

【摘要】 目的 对比研究三种乳鼠原代心肌细胞消化分离方法,比较不同方法分离获取的心肌细胞在数量、纯度、活力上的差异,为相关实验研究提供选择。方法 按照不同的消化方法进行分组,A组为0.08%胰蛋白酶单纯消化组;B组为0.08%胰蛋白酶+0.08%Ⅱ型胶原酶混合消化组;C组为0.08%胰蛋白酶和0.08%Ⅱ型胶原酶分离消化组。记录差速贴壁后的细胞数和活细胞率,对贴壁24 h后的心肌细胞进行免疫荧光染色,计算心肌细胞纯度,通过激光共聚焦显微镜对JC-1染色的心肌细胞进行线粒体膜电位检测,比较红绿荧光密度的差异,通过能量代谢间接反映细胞活力。结果 三种方法分离获得的心肌细胞数差异无统计学意义（P >0.05）,而活细胞率C组高于A组（P <0.01）;三组分离获得的心肌细胞纯度差异无统计学意义（P >0.05）;线粒体膜电位,A组荧光比值为0.928±0.078,B组荧光比值为0.943±0.099,C组荧光比值为1.160±0.089,三组之间差异有统计学意义（P <0.01）,C组线粒体膜电位高于A组和B组（P <0.01）。结论 三种消化方法在细胞数和细胞纯度上无明显差异,0.08%胰蛋白酶和0.08%Ⅱ型胶原酶分离消化的心肌细胞在活细胞率和细胞活力方面更优,可以作为常规的乳鼠心肌细胞分离方法的选择。     

机械法和胰酶法分离大鼠卵巢颗粒细胞的比较

目的 探讨胰酶法分离大鼠卵巢颗粒细胞的优势。方法 取3～4周龄雌性SD大鼠的卵巢,分别采用机械法和胰酶法分离颗粒细胞并进行培养。机械法：于40倍解剖显微镜下用针头刺破卵巢成熟的卵泡,将含有卵巢剩余组织及卵泡液的培养液用200目滤网过滤;胰酶法：用无菌眼科剪将卵巢剪成小于2 mm³的小碎块,然后加入0.25%胰酶,室温消化1 h后,将含有卵巢碎块的消化液用200目滤网过滤。比较这2种分离方法获得的细胞数量、细胞活力,及雌二醇和孕酮的分泌情况。结果 机械法和胰酶法这2种方法分离的原代大鼠卵巢颗粒细胞存活率均>90%。将细胞培养1～9 d,除24 h外,其余各时间点胰酶法分离的细胞增殖率均高于机械法;胰酶法细胞增殖率峰值出现时间早于机械法24 h,并且胰酶法分离的细胞最大增殖率[72 h：（210.09±0.95）%]高于机械法[96 h：（180.50±0.74）%],差异有统计学意义（P<0.05）。胰酶法分离的细胞激素的最大分泌量、每日平均分泌量及分泌总量均高于机械法,差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 胰酶法分离的大鼠卵巢颗粒细胞在细胞活力和激素分泌功能方面均优于机械法,值得在卵巢早衰的研究中推广使用。     

大鼠胎心细胞的分离培养技术

目的　介绍一套高效率的大鼠胎心细胞的分离培养方法和应注意的事项。方法　无菌条件下取胎心 ,经酶解消化法分离胎心细胞 ,通过差速贴壁和添加Brdu来提高胎心细胞纯度。结果　培养的心肌细胞的纯度可达94% ,活细胞数 >85 % ,形态典型 ,可同步自律搏动达 2～ 3周。结论　该方法可为实验研究提供纯度高、活细胞数较多、状态良好的胎心细胞     

成年小鼠心脏干细胞的体外分离及表型鉴定

目的 建立稳定的小鼠心脏干细胞（cardiac stem cells,CSCs）分离方法,并对体外培养的CSCs进行生物学特性鉴定.方法 选用健康成年CD1小鼠,在无菌条件下取心脏并剪碎,并用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶反复消化,采用差速离心法去除混合细胞悬液中的心肌细胞,结合免疫磁珠分选法纯化c-kit＋ CSCs后,进行流式细胞仪表面标记鉴定.结果 酶消化法和磁珠分选法结合成功分离并纯化了成年小鼠c-kit＋ CSCs.磁珠分选前,流式细胞仪表面标记鉴定c-kit＋ CD34-CSCs为4.62％;经磁珠分选后c-kit＋ CD34-CSCs可达70.23％.结论 酶消化法结合磁珠分选法能成功分离纯化成年小鼠c-kit＋ CSCs,且能用于后续体外培养.体外培养时c-kit＋ CSCs相对于其它表型标记的心脏干细胞更加稳定,具有较强的扩增能力.相对于心脏组织块培养法,酶消化法可在短期内获得高纯度的c-kit＋ CSCs,更有助于心脏干细胞相关信号通道的体外实验研究.     

胶原酶冷消化法分离制备罗非鱼肝细胞

目的研究罗非鱼肝细胞的分离提取的方法、鉴定。方法将鱼肝脏经D-Hank液反复洗涤后剪碎经IV型胶原酶消化后过滤、离心、经DMEM洗涤后用Percoll分离液行肝细胞纯化、细胞计数,光镜下观察其形态结构。结果胶原冷消化法分离后的细胞中仍含有一定量的杂细胞,可采用90g,60g,30g离心进一步分离提纯。结论胶原酶冷消化法获得满意结果,60g离心2min和30g离心3min可达到纯度和产量均较理想的结果。     

鼠胚心肌细胞体外培养模型的建立

目的建立经济适用的小鼠胚胎心肌细胞的分离、培养和鉴定方法。方法取不同胚龄小鼠心脏,采用不同方法进行消化、接种、体外增生、鉴定。结果用0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液,短时间、分步消化孕12 d鼠胚的心脏。将获得的细胞悬液接种于胎牛血清包被的培养皿中,采用pH值为7.2~7.4的HAM’S F12加20%胎牛血清培养液进行培养,所获得的细胞经PAS反应及免疫组化鉴定显示约80%的细胞为心肌细胞。结论建立的鼠胚心肌细胞培养模型可进行胚胎心脏发育毒性的体外研究。     

不同消化法测定头发中6种金属元素含量对比研究

目的探讨头发消化方法对钙、镁、铜、铁、锌、锰元素测定的影响。方法分别使用2种不同湿消化法和微波消解法进行前处理,并采用火焰原子吸收光谱测定头发中的钙、镁、铜、铁、锌、锰含量。结果3种方法处理后所测各元素含量结果差异均无统计学意义（P〉0．05）,且用微波消解法处理后所测含量结果相对偏差较小,3种方法的加标回收率分别在91．7％一104．1％之间,精密度试验的相对标准偏差均〈5％。结论采用3种方法都可取得相对准确的测定结果,但是微波消解法操作简单、省时、试剂用量少、样品污染少,是较理想的消化方法。     

两种分离大鼠心脏微血管内皮细胞方法的比较及改良

目的:比较两种分离成年大鼠心脏微血管内皮细胞的方法并进行改良.方法:分别采用组织块贴壁法和酶消化法分离大鼠心脏微血管内皮细胞,并对其进行表面特异性抗原CD31免疫荧光鉴定.结果:两种方法都获得了心脏微血管内皮细胞,CD31鉴定细胞阳性率在95％以上.两种方法相比,酶消化法具有获得所需的细胞时间相对短,稳定可靠,细胞纯度高等特点.结论:使用酶消化法可获得纯度高、状态良好的心脏微血管内皮细胞.     

急性提取成年小鼠心肌细胞的方法

目的:目前常用离体心脏灌注法提取心肌细胞,但小鼠的心脏体积较小,难度较大,因此作者通过实验获得一种简易提取成年小鼠心肌细胞的方法。方法:脱臼处死小鼠后,通过胰酶、胶原酶消化提取小鼠心肌细胞。结果:用酶解法可获得大量的高质量的心肌细胞且细胞存活率不低于90%。结论:酶解法提取细胞是一种简单、快速获得成年小鼠心肌细胞的可行办法。     

改良酶消化法体外培养人脐静脉内皮细胞

目的观察改良酶消化法分离、培养人脐静脉内皮细胞(human umbilial vein endothelial cells,HUVECs)的效果,探讨获取高纯度、高活性HUVECs的培养方法。方法采集健康新生儿脐带,应用改良的酶消化法(含0.016%EDTA的0.25%胰蛋白酶)进行HUVECs的分离培养;通过细胞形态学观察及免疫荧光化学鉴定HUVECs及其特异性抗原的表达。结果体外培养的HUVECs细胞形态呈铺路石样,Ⅷ因子相关抗原荧光染色阳性,细胞纯度可达99%。结论通过本实验改良的分离培养方法,可以在体外获得较高数量的HUVECs,在细胞形态、表面抗原标志等方面具内皮细胞特征,可以用于血管内皮细胞模型的构建。