幽门螺杆菌vacA—ctxB融合基因原核表达载体的构建

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)致细胞空泡毒素抗原(Vauolating cytotoxin antigen A,vaeA)毒性片段与霍乱毒素(Cholerae toxin,Ctx)B亚单位(ctxB)基因的原核表达载体,为进一步表达VCTB重组蛋白,制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础.方法:通过比较国内H.pylori代表株的vacA基因毒性亚单位,找出高度同源性片段,按基因文库中提供的vacA基因和ctxB基因序列设计引物.以H.pylori基因组DNA为模板,PCR扩增vaeA毒性片段基因,克隆至质粒pQE30中,获得重组质粒pQE30-vacA.以pET32(α)+-ctxB质粒为模板PCR扩增ctxB目的基因.再将纯化的ctxB基因片段插入pQE30-vacA中,构建含双基因的表达质粒pQE-vctB,构建的表达质粒pQE-vctB转化大肠杆菌Top10,培养后,提取纯化重组质粒pQE-vctB,内切酶双酶切鉴定.结果:扩增的vacA DNA片段约为723 bp,ctxB基因的DNA片段约为372bp,与预计长度相符合.构建的表达质粒pQE-vctB酶切鉴定,与插入pQE30的目的基因片段相符.测序结果vctB融合基因由1092bp组成,编码364个氨基酸残基的多肽,与基因文库相符.结论:含vacA和ctxB融合基因的原核表达载体构建成功,为进一步表达VCTB重组蛋白奠定了基础.     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

小鼠CD160胞外段真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染CHO细胞,并用RT-PCR和Western blot检测CD160胞外段的表达,流式细胞术检测重组psCD160与其配体的结合能力.结果 获得长度约为520 bp的小鼠CD160胞外段基因,经测序证实其序列正确.用脂质体将含有CD160胞外段基因的重组质粒载体转染CHO细胞后.RT-PCR和Western blot分析证实转染的CHO细胞可表达重组的psCD160基因,并且表达的可溶性CD160可与其配体结合.结论 成功构建小鼠CD160胞外段基因的真核表达载体,并转染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究CD160胞外段的功能效应奠定实验基础.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段，克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1，构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP，并在真核细胞内获得表达。     

真核表达载体pVAX1-mSLC的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子（mSLC）高效真核细胞表达载体pVAX1-mSLC。方法：用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切重组克隆pMD-mSLC，胶回收约410bp的SLC基因片段，以亚克隆法构建于真核表达载体pVAX1的相应酶切位点。转化后进行菌落PCR分析和HinDⅢ酶切鉴定。阳性克隆提取质粒，体外电穿孔法转染COS-7细胞，用Western blot检测转染细胞中mSLC的瞬时表达。结果：菌落PCR和HindⅢ酶切鉴定证实，mSLC基因片段正确插入到真核表达载体pVAX1中。Western blot检测表明，以重组质粒pVAX1-mSLC转染的COS-7细胞能表达mSLC，表达产物的相对分子量同预期的结果相一致。结论：成功地构建小鼠SLC基因的真核表达质粒pVAX1-mSLC，用它转染COS-7细胞后，能瞬时表达mSLC，为下一步mSLC的肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。     

重组乙肝表面抗原真核表达质粒的构建及表达

采用限制性内切酶从重组的真核表达质粒pcDNA-S2S中分离出经过测序鉴定的乙肝表面抗原中蛋白（preS2 S)基因片段,将其亚克隆于pVAX1真核表达载体,构建编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒pVAX-S2S,酶切鉴定后将重组质粒体外转染COS7细胞,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性,说明重组质粒pVAX-S2S在体外能够有效表达HBsAg,为进一步的体内免疫反应打下基础。     

骨形态发生蛋白基因真核表达质粒的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

【目的】克隆人骨形态发生蛋白(BMP4)基因,构建真核表达质粒,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达,为进一步研究以BMP4进行骨修复的基因治疗奠定基础。【方法】采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,从人的松质骨中扩增BMP4的环形脱氧核糖核酸(cDNA),插入pGEM-Teasy载体,测序证实后,将其亚克隆至质粒PCDNA3.1B(-)中构建BMP4真核表达载体;采用脂质体将重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,以RT-PCR和免疫组织化学方法鉴定转染细胞中BMP4基因的表达。【结果】经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒,RT-PCR和免疫组化方法证明转基因CHO细胞克隆中存在人BMP4基因。【结论】成功获得了人BMP4的全长基因,且序列与已知序列高度一致。     

人可溶性转化生长因子βⅡ型受体真核表达载体的构建及表达

目的:构建人转化生长因子βⅡ型受体胞外区(sTGFβRⅡ)基因的真核表达载体,转染真核细胞CHO以表达sTGFβRⅡ蛋白,并检测其生物学活性.方法:以TGFβRⅡ的重组质粒为模板,用PCR方法扩增得到人TGFβRⅡ胞外区(1-159位氨基酸)的cDNA,将该cDNA重组到真核表达载体pCDNA3.1/myc-his(-)B(pCDNA)的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点上,构建成pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染CHO细胞,用Western blotting法检测sTGFβRⅡ的表达,并测定其生物学活性.结果:CHO细胞转染pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒后,其培养上清经 Western blotting分析,显示有特异性的蛋白条带,所表达的蛋白能明显抑制TGFβ1对貂肺上皮细胞的增殖抑制作用.结论:成功克隆了sTGFβRⅡ基因,并获得有生物学活性的sTGFβRⅡ蛋白.     

足月新生儿缺氧缺血性脑损伤大鼠模型的制作与鉴定

目的检测狂犬病毒NP蛋白的免疫原性。方法利用RT-PCR扩增狂犬病毒核蛋白（NP）基因,测序后将其克隆到PVAXl真核表达载体上：将PVAX1-NP转染Vero细胞,进行SDS．PAGE,TLWestern—blot分析;以重组质粒PVAX1-NP对小鼠进行免疫试验。结果经酶切分析、鉴定和测序验证,得到重组表达质粒PVAX1-NP,NP蛋白在Vero细胞中获得了表达,且表达产物具有免疫学活性：免疫小鼠抗体水平显著升高。结论狂犬病毒NP蛋白具有免疫原性。     

恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究

目的构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能。方法从连有恙虫病东方体Karp株编码56000u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,WesternBlot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象。结果pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因。转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带。转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P<0.01)。结论成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能。     

婴儿利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧基酶优势表位基因的分子克隆与表达

目的 基于前期分析并选取的婴儿利什曼原虫PEPCK的优势表位基因,构建相应重组原核表达载体以获得重组蛋白,构建相应重组真核表达载体并验证真核载体在NIH3T3细胞中的表达,为后续动物的免疫和感染实验备下基础。方法 根据PEPCK优势表位基因序列,经PCR反应及酶切连接构建重组原核与真核表达质粒pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK并分别转染至E. coli和NIH3T3细胞中进行表达。采用SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定原核重组质粒在大肠杆菌中的表达和原核表达蛋白被镍柱纯化后的情况,采用免疫荧光实验验证真核重组质粒在细胞中的表达。结果 重组原核与真核载体的正确测序结果表明重组载体构建成功。SDS-PAGE电泳和Western Blot的结果显示,大肠杆菌中表达的原核重组蛋白以及纯化后的蛋白在48.08 kD处存在条带,转染了真核重组载体的NIH3T3细胞的免疫荧光结果呈阳性。结论 成功构建了PEPCK优势表位基因的重组原核和真核表达载体:pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK,成功表达相应的重组蛋白并纯化并验证了pVAX1-EPEPCK在NIH3T3细胞中的表达,为后续DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强免疫的动物实验备下基础。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核重组表达质粒的体外表达分析

目的:分析弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核表达质粒的体外表达。方法:大量提取纯化重组真核表达质粒pVAX1-GRA8,瞬时转染培养的vero E-6细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测GRA8在细胞中的表达。结果:从转染pVAX1-GRA8后的vero E-6细胞的RNA中扩增出GRA8的特异条带,转染细胞存在弓形虫感染血清识别的特异蛋白质条带。结论:真核表达质粒pVAX1-GRA8在vero E6细胞中获得表达。     

重组可溶性人CD137在CHO细胞中的表达

目的：获得表达人可溶性CDl37抗原的dhfr-CHO细胞抹。方法：将CDl37-hIgGlFc-pCD-NA3重组质粒及pSV2-dhfr质粒，运用脂质体介导法共转染CHO细胞。用G418筛选出阳性克隆，MTX递增浓度诱导人可溶性CDl37在dhfr-CHO细胞的表达。运用RT-PCR检测CDl37 mRNA转录水平，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测人CDl37可溶性蛋白在CHO细胞中的表达。结果：重组质粒转化细胞进行RT-PCR后，得到一大小为558bp的特异性条带，与人CDl37胞膜外区一致；重组质粒转化细胞进行SDS-PAGE得到一大小约为37KDa的奈带，与人CDl37-hIgGlFc融合蛋白大小基本一致。结论：获得了表达人可溶性CDl37的dhfr-CHO细胞株，为获得纯化的CDl37抗原、制备CDl37单抗奠定了基础。     

真核表达质粒pVAX1-Der p 1的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1，检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达，为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA，根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物，PCR扩增Der p 1编码基因，以其全长为目的基因，定向克隆至真核表达载体pVAX1，将其转化大肠杆菌DH...     

SARS冠状病毒核蛋白与mGM-CSF融合质粒的构建及表达

目的构建SARS冠状病毒(SARS—COV)核蛋白(N)与mGM—CSF的融合真核表达质粒，借助mGM—CSF的免疫佐剂作用，提高SARSDNA疫苗的免疫效果。方法采用PCR方法扩增N和mGM—CSF基因片段，用分子克隆和基因融合的方法将目的片段定向插入真核表达载体中，构建融合表达质粒pVAX 1／N—mGM—CSF，并以融合质粒转染细胞，用免疫细胞化学和Western Blot的方法鉴定融合质粒在体外的表达。结果经酶切鉴定及DNA序列测定证实融合质粒构建正确，细胞转染实验表明，融合质粒能在COS-7细胞中表达。结论成功构建SARS—COV核蛋白与mGM—CSF的融合表达质粒，重组质粒能在真核细胞内表达。     

人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体,并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段,将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr,得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr;经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系;用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白,为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白F与HSV-1VP22融合DNA疫苗的构建与表达

目的:构建铜绿假单胞菌外膜蛋白F与Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1) VP22融合表达的DNA疫苗,并研究其在真核细胞中的表达情况.方法: 构建重组质粒 pVAX1-OprF、 pVAX1-VP22、 pVAX1-VP22-OprF、 pVAX1-OprF-VP22.原核表达VP22 的碳端蛋白,以电洗脱的方法得到纯化蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备VP22蛋白的抗血清,West-ern blot鉴定抗体特异性.最后,以脂质体法将重组质粒转染真核细胞,利用Western blot检测其在真核细胞中的表达情况.结果: 成功制备了抗VP22的抗血清,重组质粒在真核细胞中得到了表达.结论: 铜绿假单胞菌OprF与 HSV-1VP22融合表达的重组质粒能够在真核细胞中表达,这为进一步的动物实验打下了基础.