恙虫病东方体Karp株56kD表膜蛋白基因的表达及免疫诊断应用研究

目的实现恙虫病东方体56kD表膜蛋白的原核表达并评价重组蛋白作为抗原的免疫诊断价值。方法亚克隆技术构建原核表达质粒载体pGEX-Sta56,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-Sta56融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白,应用ELISA以评价其免疫诊断价值。结果pGEX-Sta56经测序鉴定Sta56基因以正确的表达框架连入载体,经过诱导表达得到正确大小的融合蛋白,应用纯化的GST-Sta56的ELISA检测结果与全细胞抗原有很高线性相关性,在小鼠血清检测中敏感性,特异性和准确性分别大于90%,70%和80%。结论成功表达重组的56kD表膜蛋白并可能替代传统的全细胞纯化蛋白,为建立快速、敏感和特异的免疫学诊断奠定了基础。     

代表性差异性分析 一种分析复杂但高度相关基因组间差异性的方法

本文介绍了一种新方法——代表性差异性分析,它是一种有效地发现复杂基因间差异的方法,已被广泛地应用于肿瘤、微生物、寄生虫等领域,如克隆肿瘤的缺失基因,新的致病基因的发现。它不需要基因图谱即可快速分离出相关的多态性标记物。     

刚地弓形虫醛缩酶基因及其内含子的分析

目的刚地弓形虫醛缩酶是其速殖子入侵宿主细胞过程中的一个重要分子，本研究对该酶基因序列及其内含子进行实验和分析。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子基因组DNA和总RNA，采用PCR技术分别从基因组DNA和cDNA中扩增编码果糖1，6-二磷酸醛缩酶的基因，并克隆到T载体上，经测序鉴定后对其基因组序列和eDNA序列进行比较分析。通过NCBI数据库资源对醛缩酶内含子的分布及大小进行比较分析。结果根据醛缩酶基因设计的引物从基因组DNA扩增得到的片段长度为1315bp，从eDNA扩增得到的片段为993bp。比对结果显示来源于基因组DNA的序列在对应于编码序列起始密码子下游109bp后有一个322bp的内含子。通过在线工具收集得到NCBI及EMBL数据库中来源于不同物种的32种醛缩酶数据，分析显示推断氨基酸序列具有保守性。结论编码刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株果糖1，6-二磷酸醛缩酶基因编码区内存在一个322bp的内含子。醛缩酶氨基酸序列保守性较高。内含子在不同进化等级之间插入位置数目及大小两方面均存在明显的增加趋势。     

我国各省、地区卫氏并殖与斯氏狸殖吸虫成虫种群形态分析

本文根据经过成虫形态特征的主成分分析与聚类分析后确认具有种独立地位的7种并殖吸虫的7项成虫形态特征,在电子计算机上,采用关系数据库dBASEⅡ,对我国10省、地区的并殖吸上进行检索,结果表明:广东(梅县)、湖南、河南、四川、陕西的吸虫同为斯氏狸殖,但各居群均有一定的形态差别。远离模式产地广东省的河南、四川与陕西差别似较大。广东(梅县)、江西、浙江、安徽、吉林的并殖吸虫同为卫氏并殖,这5个居群的吸虫也存在差別,其差别主要在于虫体长宽比例。     

Internet在寄生虫学上的应用

本文综述了国内外Internet信息网络在寄生虫学上的应用现状。全文包括四个部分,即概述、数据库、信息交流和专题讨论、重要的寄生虫学WWW站址。     

联合PCR技术克隆白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶基因及其生物信息学分析

目的测定白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶的基因的全长序列并用生物信息学方法分析其结构和功能。方法从白纹伊蚊卵、幼虫、蛹、雌蚊、雄蚊中提取总RNA,逆转录后以总cDNA为模板,设计简并引物进行巢式PCR,扩增部分序列后设计新的特异性引物补全5’端序列,使用3’-RACE法补全3’端序列,拼接全长后进一步进行生物信息学分析。结果通过巢式PCR扩增出1145bp的核苷酸序列,测序后设计5’端序列的下游引物,扩增出约900bp的核苷酸序列,设计3’端的上游引物,配合3’RACE试剂盒扩增出约600bp的核苷酸序列,寻找重复序列将三段序列进行拼接,得到国内外从未获得的长2244bp、编码747个氨基酸序列的白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶基因的全长序列。生物信息学分析其与白纹伊蚊的相似性最高,为含信号肽的跨膜蛋白,含3个Cu氧化酶超家族位点,属于蓝色多铜氧化酶家族。结论联合PCR技术的应用使较长长度的基因序列的扩增更为方便、准确。为进一步对其进行功能的研究奠定了基础。     

刚地弓形虫MIC8 CTD作用蛋白的筛选及鉴定

目的从刚地弓形虫速殖子裂解液中筛选并鉴定微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8CTD)的作用蛋白。方法分别以GST-MIC8CTD蛋白和GST蛋白(对照)作为探针蛋白,采用GST pull-down技术从弓形虫裂解液中筛选目标蛋白并进行SDS-PAGE分析;将目标蛋白转印至PVDF膜,测序,通过BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白;以目标蛋白抗体为一抗进行Western blot,分析GST pull-down产物与目标蛋白抗体的相互作用;分别用GSTMIC8CTD多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀试验,沉淀物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 PAGE显示GST-MIC8CTD蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带(分子质量单位约35~45ku),GST蛋白的pull-down产物中无此蛋白;BLAST2比对目标蛋白的氨基酸序列与弓形虫醛缩酶序列一致;ECM检测GST-MIC8CTD多克隆抗体的免疫共沉淀产物中有蛋白组分可被相应的抗体识别,免疫前血清的免疫共沉淀产物中无可被识别的蛋白。结论经GST pull-down技术和免疫共沉淀试验筛选、鉴定,弓形虫MIC8CTD的作用蛋白为醛缩酶。     

广州管圆线虫γ-丁基甜菜碱羟化酶基因的获得与分析

目的　对广州管圆线虫成虫cDNA文库的插入片段进行研究。方法　铺平板培养广州管圆线虫成虫cDNA文库 ,从中挑选生长、分离良好的噬菌斑进行PCR扩增 ,根据PCR产物电泳结果挑选较大的cDNA插入片段进行克隆、测序和原核诱导表达 ,对表达产物进行免疫学鉴定 ,用生物信息学方法分析其结构和功能。结果　获得了国内外尚未见报道的广州管圆线虫全长基因 ,该基因长 14 16bp ,编码由 4 2 1个氨基酸组成的γ -丁基甜菜碱羟化酶 (gamma -butyrobetaine ,2 -oxoglu taratedioxygenase ,GAMMA -BBH ,EC 1 14 11 1) ;免疫学鉴定结果显示GAMMA -BBH不能与大鼠的抗血清结合。 结论　首次获得广州管圆线虫成虫GAMMA -BBH表达基因 ,为广州管圆线虫的研究提供实验室依据。     

广州管圆线虫病在我国的流行分析

该文按时序综合描述广州管圆线虫病在我国的流行情况以及针对广州管圆线虫的流行病学调查，从中发现我国在应对广州管圆线虫病中存在的问题，为我国广州管圆线虫病的防治提供参考依据。     

粉尘螨第五组主要变应原（Der f5）的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第五组变应原（Dermatophagoides farinae,Derf5）基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法提取活粉尘螨总RNA,扩增Derf5片段,PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化入大肠埃希菌JM109,经酶切及测序鉴定获得pMD18-Der f5阳性菌株,再提取质粒进行双酶切,与表达载体pET-30a（＋）连接,转化入大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果,Ni-IDA亲和层析柱纯化蛋白,利用尘螨病人血清鉴定其免疫原性。结果构建了重组质粒pMD18-Derf5和pET30a-Der f5,SDS-PAGE结果表明Der f5基因在BL21中获得良好的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符,纯化的蛋白与病人血清有良好的IgE结合活性。结论获得广州地区Der f5的原核表达载体,高效表达纯化重组蛋白,初步鉴定了该蛋白的免疫原性。