Expression and significance of cdc2 gene in cancer cells.

目的 通过检测人表皮细胞Hacat和不同组织来源的6种肿瘤细胞的增殖能力以及cdc2基因在这些细胞中的表达情况,探讨cdc2基因与肿瘤发生、发展、增殖能力之间的关系.方法 体外培养人表皮细胞Hacat和不同组织来源的6种肿瘤细胞(宫颈癌细胞Caski、神经胶质瘤细胞U87、肝癌细胞Hepg2、膀胱癌细胞T24、骨肉瘤细胞MG63、肺癌细胞A549).采用逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)法和免疫印迹(Western blot)法测定细胞中cdc2在mRNA和蛋白质水平的表达情况;采用四甲基偶氮唑(MTT)法检测细胞增殖速度.结果 cdc2基因在Hacat中表达较低,在Caski、U87、Hepg2、T24、MG63和A549中表达较高.MTT法显示:Hepg2、U87、T24、A549、MG63增殖能力较强,Caski次之,Hacat最差.结论 cdc2基因可能参与了肿瘤的发生过程,并与肿瘤的增殖有关.     

siRNA靶向抑制PDGFRB对人恶性脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的应用微小RNA干涉从mRNA靶向抑制PDGFRB基因/产物对人恶性神经胶质瘤细胞T98G、U87MG增殖作用的影响。方法脂质体转染法转染PDGFRB特异性siRNA;以传统半定量RT-PCR法及实时定量PCR观察应用特异性siRNA阻断PDGFRB的表达变化;采用MTT法检测恶性脑胶质瘤细胞的体外增殖。结果siRNA(PDGFRB-HSS107758和PDGFRB-B12)可明显抑制PDGFRB的表达(抑制率70%);PDGFRB特异性siRNA可抑制恶性胶质瘤细胞的体外增殖,对U87MG细胞增殖抑制作用显著(P<0.05)。结论PDGFRB特异性siRNA可以抑制恶性脑胶质瘤细胞的体外增殖。     

外泌体对A549细胞增殖、凋亡及迁移功能的影响

目的 观察肺癌细胞来源的外泌体对肿瘤细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响.方法 采用多步超速离心法从肺癌A549细胞的培养液上清中分离出肺癌细胞来源的外泌体,并通过透射电子显微镜观察外泌体形态,利用Western blot 检测其表面跨膜蛋白的表达.采用 MTT 法、ELISA法分别检测外泌体对A549细胞增殖和凋亡的影响;采用Transwell法了解外泌体对A549细胞迁移能力的影响.结果 观察所提取的外泌体大小均匀,形态规则,多为圆形及椭圆形膜性囊泡盘状结构,直径30~100 nm,其外周包被被膜,表面具有丰富的四次跨膜蛋白CD9、CD63等.MTT法提示外泌体对A549细胞具有促增殖作用,且其影响具有时间和剂量依赖特征(P<0.05),ELISA法检测用外泌体共培育后的A549细胞的凋亡情况,结果显示外泌体在一定程度上抑制肿瘤细胞凋亡(F=365.496,P=0.000).Transwell法观察显示,外泌体具有促进A549细胞迁移运动的作用(F=252.005,P=0.000).结论 肺癌细胞来源的外泌体能促进A549细胞增殖、减少其凋亡、增强其迁移运动的能力.     

新城疫病毒联合替莫唑胺对胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的 探讨新城疫病毒（NDV）联合替莫唑胺（TMZ）对脑胶质瘤U87MG细胞增殖、迁移、侵袭的影响。方法 将脑胶质瘤U87MG细胞随机分为对照组、药物组、病毒组和联合组。采用MTT法、划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测NDV、TMZ和二者联合使用对U87MG细胞增殖、迁移和侵袭的影响。采用qRT-PCR法检测不同组U87MG细胞中MMP-2、caspase-3和caspase-9的表达,使用Western blot法检测不同组U87MG细胞中MMP-2的表达。结果 ①MTT法结果显示,与对照组相比,其余3组细胞增殖率显著降低,且呈剂量依赖,联合组细胞增殖抑制率高于二者单用,差异有统计学意义（P<0.05）。②划痕实验结果显示,24 h后病毒组和联合组细胞迁移率低于对照组及药物组,差异有统计学意义（P<0.05）。③侵袭实验结果显示,联合组侵袭细胞数低于其余3组,差异有统计学意义（P<0.05）。④qRT-PCR结果显示,处理24 h后病毒组及联合组细胞caspase-3表达高于对照组及药物组,处理48 h后联合组细胞MMP-2表达量低于对照组及药物组,差异有统计学意义（P<0.05）。⑤Western blot结果显示,与对照组相比,病毒组及联合组MMP-2蛋白表达下调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 NDV联合TMZ可显著抑制U87MG细胞增殖、迁移、侵袭,并在一定程度上促进细胞凋亡。     

SRC激酶抑制剂PP2 通过上调Cx43蛋白表达降低肺癌A549 细胞的侵袭和转移

目的观察SRC激酶抑制剂PP2对肺癌细胞A549侵袭转移能力的影响,并探讨相关机制。方法采用MTT法检测PP2对 A549细胞的增殖抑制作用;利用细胞划痕实验和Transwell 实验分别测定不同浓度PP2处理A549细胞24 h后的侵袭和转移能 力;采用Western blot法检测SiRNA沉默Cx43基因、mRNA过表达Cx43基因和PP2处理后细胞内Cx43、MMP-2的表达。结果 MTT法显示2、4、8、16、32 μmol/L PP2显著抑制A549细胞的增殖,且在该范围内有浓度依赖性。采用1、2、4、8、16 μmol/L PP2分 别作用于A549细胞24 h,细胞的侵袭、转移能力也逐渐降低（P<0.05）。4 μmol/L 和8 μmol/L PP2可以显著增加细胞Cx43蛋白 水平,降低MMP-2蛋白水平。过表达Cx43蛋白后,PP2抑制细胞侵袭转移能力增强;沉默Cx43蛋白后,PP2抑制细胞侵袭转移 能力降低（P<0.05）。结论SRC激酶抑制剂PP2可以降低肺癌细胞A549的侵袭转移能力,该作用与细胞Cx43蛋白的表达有关。     

CD44在不同肿瘤细胞表面阳性表达率的实验研究

目的 检测CD44在肿瘤细胞表面的阳性表达率,为以CD44为靶点的肿瘤靶向治疗提供新的理论依据.方法 采用流式细胞术检测HCT116人结肠癌细胞,SGC-7901、MGC-803胃癌细胞,A549人肺腺癌细胞,HepG2人肝癌细胞,CNE-2人鼻咽癌细胞,U87MG恶性胶质瘤等肿瘤细胞表面CD44表达情况.结果 各肿瘤细胞表面均表达CD44.其中胃癌SGC-7901、MGC-803、肝癌HepG2、鼻咽癌CNE-2细胞表面CD44细胞的阳性率分别为17.90％±1.67％、18.36％±9.27％、24.61％±4.0％和19.03％ ±1.52％,呈高表达状态.结论 SGC-7901、MGC-803、HepG2、CNE-2细胞与HCT116、A549和U87MG细胞表面CD44阳性表达率相比有显著性差异（P＜0.05）.     

太白银莲花皂甙-1诱导胶质瘤U87MG细胞凋亡及机制研究

目的 研究太白银莲花皂甙-1对人脑胶质母细胞瘤U87MG凋亡的影响,并探讨其可能的分子机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度不同时间(6、24、48、72 h)太白银莲花皂甙-1对U87MG细胞生长增殖的抑制作用;应用倒置显微镜和Hoehst荧光染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)检测太白银莲花皂甙-1作用U87MG细胞后形态的变化和凋亡情况;通过免疫印迹法法检测太白银莲花皂甙-1处理后细胞凋亡相关蛋白Survivin及活化的Caspase-3的表达.结果 太白银莲花皂甙-1可明显抑制U87MG细胞的增殖,诱导其凋亡;同时下调Survivin表达,激活了凋亡蛋白Activated Caspase-3的表达.结论 体外实验显示,太白银莲花皂甙-1对U87MG细胞具有显著的增殖抑制作用,并能成功诱导人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞发生凋亡,其机制可能与抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡有关.     

外源性人分化抑制因子3在A549／DDP细胞中的表达及意义

目的:Id 蛋白即分化抑制因子(Id),在人类多种肿瘤中异常表达,并参与肿瘤细胞的增生、分化和凋亡等.文中旨在探讨人分化抑制因子3(Id3)基因体外转染在人肺腺癌细胞顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达及意义. 方法:构建人Id3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体Id3/pEGFP,采用脂质体介导的转染技术将Id3融合基因(Id3-EGFP)导入A549/DDP细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内EGFP的表达情况;半定量RT-PCR检测Id3表达的改变;MTT法观察Id3对细胞的增殖抑制情况. 结果:成功构建人Id3/pEGFP真核表达载体并转染A549/DDP细胞,倒置荧光显微镜下转染的A549/DDP细胞发出强绿色荧光,转Id3/pEGFP质粒的细胞其荧光主要表达于细胞核;RT-PCR结果显示Id3 mRNA在转染后的A549/DDP细胞能有效表达;MTT法结果表明,与对照组相比,转染Id3重组质粒的细胞增殖被抑制. 结论:转染的Id3/pEGFP融合基因在A549/DDP细胞能有效表达,外源性Id3基因能抑制该细胞的增殖.     

Rel A在喉癌Hep-2细胞系中的表达和意义

目的:研究Rel A基因在人喉癌Hep-2细胞中的表达及意义。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法和免疫细胞组织化学技术分别检测Rel A基因的mRNA和蛋白在人喉癌细胞系Hep-2和人正常永生化表皮细胞系Hacat中的表达。结果:Rel A基因的mRNA在Hep-2细胞中高表达,在Hacat细胞中低表达(P<0.05)。Rel A基因的蛋白在Hep-2细胞中高表达且主要表达于细胞浆,在Hacat细胞中低表达(P<0.05)。结论:Rel A基因的高表达可能与喉癌发生、发展有关。     

GPRC5A抑制肺癌细胞A549增殖和迁移及与EGFR的相关性研究

目的探讨G蛋白偶联受体C家族5A（GPRC5A）基因对肺癌细胞A549增殖和迁移能力的影响及其与表皮生长因子受体（EGFR）的相关性。方法构建GPRC5A基因真核表达质粒pLenti6.3-MCS-GPRC5A,通过脂质体法转染A549细胞,经过新霉素筛选获得阳性单克隆细胞。用qRT-PCR和Westernblot检测转染前后GPRC5A、EGFR基因的mRNA和蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖能力的变化,Transwell法检测细胞迁移能力的变化。结果真核表达质粒转染A549细胞后,GPRC5AmRNA表达上调,蛋白表达水平升高,EGFRmRNA表达下降,蛋白表达水平降低。高表达GPRC5A后,细胞增殖和迁移能力显著减弱。结论GPRC5A可能与EGFR结合,抑制EGFR通路的过度激活,从而影响了A549细胞的增殖和迁移能力。     

肾上腺素促进胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁徙和侵袭及其潜在机制

目的 探讨肾上腺素对胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251增殖、迁徙和侵袭的影响。方法用 不同浓度的肾上腺素(0.1、1、10、50、100 μmol/L)处理U87MG和U251胶质母细胞瘤细胞株,分别采用MTT实验、细胞划痕实验和transwell侵袭实验观察细胞的增殖、迁徙和侵袭情况。所有实验均以不加肾上腺素处理的细胞为对照组。qRT-PCR、Western blot和明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达和活性。结果 与空白对照相比,肾上腺素能促进U251的增殖,促进U87MG和U251的迁徙和侵袭能力,且具有剂量依赖性;β肾上腺素能受体(β adrenoreceptor,β-AR)阻滞剂普萘洛尔能抑制肾上腺素促进胶质母细胞瘤细胞迁徙和侵袭的作用;MMP-9表达和活性随着肾上腺素浓度升高而增加。结论 肾上腺素能促进胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁徙和侵袭,这种效应可能和MMP-9的表达增加相关,且能被β-AR阻滞剂抑制。     

STR分型技术鉴定后两株U87胶质瘤细胞系生物学特性评价

目的 对经过短串联重复序列（short tandem repeats,STR）分型检测技术鉴定后的两株U87胶质瘤细胞系[（美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection,ATCC）数据库中U-87 MG Glioblastoma-Astrocytoma Human和德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ）数据库中U-87 MG]进行细胞生物学特性测定,对两株细胞用于后续研究工作的可能性进行评价。方法 分别采用CCK-8法、划痕实验、Transwell实验等方法,并结合显微镜下细胞形态学特征,比较两株肿瘤细胞系的增生、迁移及侵袭能力等生物学特性。结果（1）CCK-8法：细胞生长曲线提示细胞增生能力差异无统计学意义（P>0.05）。（2）划痕实验：两细胞系迁移能力差异无统计学意义（P>0.05）。（3）Transwell实验：两细胞系迁移能力差异无统计学意义（P>0.05）,DSMZ数据库中U-87 MG细胞侵袭能力高于ATCC数据库中U-87 MG Glioblastoma-AstrocytomaHuman细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 两株U87细胞系均可反映脑胶质瘤的生物学特性,可用于后续科研实验。两细胞系的增生、迁移能力差异无统计学意义,侵袭能力差异具有统计学意义,可根据实验目的选择合适的细胞系。     

格尔德霉素对胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响

目的：研究格尔德霉素（GDM）对肝细胞生长因子（HGF）引起的胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响。方法：选用人恶性胶质瘤细胞系U251 MG和U87 MG,应用HGF作用24 h后,分别加入不同浓度的GDM再处理48 h。MTT法检测细胞增殖及抑制,分组为：正常细胞组、HGF组、GDM组、HGF+GDM组和紫杉醇组,其中HGF为终浓度30 μg•L^-1,GDM为50、250、500与1 000 nmol•L^-1,紫杉醇为60 μg•L^-1;RT-PCR法检测HGF及c-Met基因的表达,分组如上,GDM为1　000 nmol•L^-1。结果：HGF作用U251 MG与U87 MG细胞24 h后,细胞增殖率分别为0.139±0.070与0.242±0.167,而50、250、500与1 000 nmol•L^-1 GDM对U251 MG和U87 MG生长具有抑制作用,抑制率分别为0.029±0.028、0.027±0.017、0.312 ±0.084和0.339±0.047与0.116±0.069、0.222±0.191、0.269±0.056和0.276±0.031;而紫杉醇对U251 MG和U87 MG细胞的抑制率分别为0.075±0.062与0.071±0.044;RT-PCR结果显示,HGF组HGF与c-Met表达较正常组增加（P<0.05）,而HGF+GDM组则较HGF组明显降低（P<0.05）。结论：GDM能抑制HGF诱导的胶质瘤细胞增殖,并且能从基因水平抑制其表达。     

人成骨肉瘤顺铂耐药细胞系的建立

目的建立顺铂诱导的人成骨肉瘤多药耐药细胞系(MG63/R)并观察其生物学特性。方法以顺铂为诱导剂,采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法诱导人成骨肉瘤MG63细胞,建立多药耐药系MG63/R。MTT法检测药物敏感性;光镜、透射电镜观察MG63、MG63/R细胞形态及超微结构变化;生长曲线、克隆形成试验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数、P-pg、bcl-2、P53蛋白表达。结果经顺铂186d的诱导,建立了MG63/R,其对顺铂的耐药指数为83.557±4.841,对阿霉素、长春新碱、氨甲基蝶呤、环磷酰氨亦产生不同程度的交叉耐药;光镜观察可见MG63/R细胞排列不规则,形态呈三角形、多角形及多核现象;透射电镜显示MG63/R细胞表面突起增加,粗面内质网丰富;细胞周期分析显示细胞增殖能力明显增加而细胞凋亡明显降低;MG63/R细胞P-pg、bcl-2阳性表达较MG63细胞明显增加,P53表达则明显降低。结论本研究建立了稳定的人成骨肉瘤多药耐药细胞系MG63/R,为进一步研究顺铂的多药耐药机制和耐药治疗提供了一种新的实验模型。     

DOT1L对骨肉瘤MG63细胞生物学行为的影响及其作用机制

目的 探讨抑制组蛋白H3赖氨酸79（H3K79）甲基转移酶DOT1L基因对骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移、DNA损伤的影响及可能的作用机制。方法将hDOT1L-shRNA质粒转染至骨肉瘤MG63细胞（hDOT1L-shRNA组）,同时设置shRNA阴性对照组（Scramble组）。采用实时荧光定量PCR检测DOT1L mRNA的表达水平,MTT法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,TUNEL法和彗星实验检测细胞DNA损伤。Western blot检测MG63细胞中DOT1L、H3K79me2、Histone H3、Sirt1、XPA蛋白的表达水平。结果转染后,与Scramble组相比,hDOT1L-shRNA组MG63细胞中DOT1L mRNA及蛋白表达水平下调（P<0.05）,细胞增殖能力降低（P<0.05）,细胞迁移率降低（P<0.05）,DNA损伤程度加剧（P<0.05）。Western blot检测结果显示,与Scramble组相比,hDOT1L-shRNA组MG63细胞中细胞Histone H3总量差异无统计学意义(P>0.05),其他DOT1L、H3K79me2、Sirt1、XPA蛋白表达水平均降低。结论DOT1L可能通过DOT1L/H3K79me2-SIRT1-XPA信号通路抑制骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移并诱导其DNA损伤。     

敲减长链非编码RNA ATB抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭

目的 采用shRNA ATB敲减胶质瘤U87细胞中ATB后,研究其对人胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响.方法 本研究采用实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测ATB在人胶质瘤细胞系U87与正常人脑胶质细胞HEB中的表达情况.并在此基础上构建了ATB表达载体shRNA ATB 质粒,利用其转染人胶质瘤U87细胞株,获取低表达ATB的U87细胞.应用MTT法检测敲减ATB后对U87细胞增殖的影响;应用细胞克隆实验检测敲减ATB后对U87细胞克隆增殖能力的影响;应用Transwell实验检测敲减ATB后对U87细胞迁移和侵袭能力的影响.结果 qRT-PCR结果显示,与正常人脑胶质细胞HEB相比,人脑胶质瘤细胞系U87中ATB 表达明显上调(P<0.01);与shRNA对照组相比,转染了shRNA-ATB实验组能显著减少ATB 水平(P<0.01);细胞克隆实验显示shRNA-ATB实验组细胞克隆形成能力较shRNA对照组明显降低(P<0.01);MTT结果表明敲减细胞内ATB后细胞增殖的速率明显低于shRNA对照组(P<0.01).此外,Transwell实验进一步验证了敲减胶质瘤U87细胞中的ATB后,细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制(P<0.01).结论 靶向敲减U87细胞中的ATB后能够抑制其增殖、迁移和侵袭,表明ATB基因可能是胶质瘤患者的潜在治疗靶点.     

RNA干扰bcl-2基因对人骨肉瘤细胞株MG63增殖影响的实验研究

目的 探讨RNA干扰bcl-2基因对人骨肉瘤细胞体外增殖及凋亡的调控作用.方法 选用人骨肉瘤细胞进行体外培养,以siRNA分别处理MG63细胞24～72h后,MTT法检测细胞增殖,SABC免疫组织化学法检测细胞内bcl-2、bcl-xl、bax、caspase-3和C-myc蛋白表达水平.结果 RNA干扰bcl-2基因对MG63细胞增殖有抑制作用.下调bcl-2的表达的同时,上调了caspase-3蛋白表达水平,并使C-myc蛋白表达水平下调.对bcl-xl、bax的蛋白表达无明显影响.结论 RNA干扰显著降低bcl-2蛋白的表达,对人骨肉瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用.     

不同侵袭潜能的骨肉瘤细胞中抑癌基因IDH1的表达

目的 观察抑癌基因IDH1在不同侵袭能力的人骨肉瘤MG-63、U20S细胞株中的差异表达。方法培养人骨肉瘤细胞MG-63、U20S,以实时定量PCR、免疫细胞化学染色法检测MG-63、U20S细胞中IDH1基因mRNA及蛋白的表达情况;体外侵袭实验测定两骨肉瘤细胞株的侵袭能力。结果IDH1基因mRNA及蛋白在不同侵袭能力的骨肉瘤细胞株中存在差异表达,其在低侵袭力细胞株U20S中的表达量明显高于高侵袭力细胞株MG-63中的表达量（P〈0．01）。结论IDH1的表达与骨肉瘤细胞的侵袭能力呈负相关,其可作为判断骨肉瘤侵袭能力有价值的指标。     

MiR-650通过靶向ING4促进骨肉瘤细胞增殖的研究

目的 探讨骨肉瘤组织和细胞系中miR-650的表达及其在肿瘤形成中的作用机制.方法 用实时荧光定量 PCR的方法,检测并比较肿瘤组织及癌旁正常组织、骨肉瘤细胞系(M G63)及健康人成骨细胞(hFOB1.19)之间的miR-650表达情况;用M T T实验检测不同组细胞的增殖情况;用Western blot的方法检测调节生长抑制因子4(ING4)蛋白的表达情况.结果miR-650在骨肉瘤组织及细胞系中的表达显著高于癌旁正常组织及健康人成骨细胞;抑制miR-650的表达后,M G63细胞的增殖能力显著减弱.此外,miR-650表达减低后,ING4的表达显著升高,其中阴性对照组、乱序组、miR-650抑制剂组的ING4 mRNA分别为1.00 ± 0.16、1.08 ± 0.14、5.35 ± 0.32;蛋白表达分别为:0.62 ± 0.06、0.59 ± 0.12、2.45 ± 0.20;miR-650抑制组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);而抑制ING4升高后,M G63细胞的增殖能力有一定的恢复.结论 miR-650可以通过降低ING4的表达促进M G63细胞的增殖,提示miR-650可能成为骨肉瘤治疗的新靶点.     

RNA干扰A549细胞核干细胞因子基因表达

目的探讨A549细胞株NS基因的表达干扰后,A549细胞株的mRNA表达水平及细胞增殖变化。方法构建NSshRNA真核表达载体,转染A549细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,RT-PCR检测NS基因沉默,MTT检测细胞增殖情况。结果构建的NSshRNA真核表达载体经菌落PCR和测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR检测显示构建的shRNA表达载体转染A549细胞后可显著降低NSmRNA的表达;M1vr结果显示干扰后细胞增殖速率明显减低。结论成功构建了一组针对NS基因的shRNA真核表达载体,转染A549细胞后NS基因表达被特异性沉默,且细胞增殖受到明显抑制,通过RNAi技术实现NS基因沉默可能是一种较有前景的肿瘤治疗方法。