SPAG6基因RNAi慢病毒载体的构建及其对SKM-1细胞凋亡的影响

目的 构建SPAG6-shRNA慢病毒载体靶向沉默SPAG6基因,探讨SPAG6基因沉默对人骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞株SKM-1细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计并构建3条针对SPAG6基因的shRNA质粒表达载体,共转染293T细胞后得到可表达SPAG6基因RNAi的慢病毒载体.转染SKM-1细胞,利用流式细胞术检测转染效率,qRT-PCR及Western blot验证SPAG6基因干扰效果,筛选最佳靶点.CCK-8法检测SPAG6基因沉默对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功构建SPAG6-shRNA慢病毒载体,流式细胞术检测转染效率均在60％以上.qRT-PCR及Western blot检测结果显示SPAG6-shRNA3慢病毒载体敲除效率最高,为最佳靶点.SPAG6基因干扰后,干扰组SKM-1细胞的增殖明显受抑,抑制率为(60.18 ±0.37)％,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P＜0.05).干扰组SKM-1细胞凋亡率为(16.32±5.80)％,显著高于阴性对照组[(4.28±0.88)％,P =0.024]及空白对照组[(3.08±1.50)％,P=0.019].结论 SPAG6-shRNA慢病毒载体能有效降低SPAG6基因表达水平,抑制SKM-1细胞增殖并促进其凋亡.     

RNAi靶向沉默c-FLIP(L)基因对大肠癌细胞凋亡的影响

目的应用RNAi技术将c-FLIP(L)对应的SiRNA片段对大肠癌细胞株SW480凋亡的影响,明确RNAi靶向沉默c-FLIP基因在TRAIL介导的凋亡途径中的作用。方法与c-FLIP(L)对应的SiRNA片段转染入细胞,半定量RT-PCR法判断干扰前后FLIPmRNA水平的变化,Westernblot分析FLIP蛋白水平变化,比较分析干扰前后细胞对介导的凋亡敏感性的改变及转染前后TRAIL诱导的细胞凋亡的情况。结果 c-FLIP(L)可以减低SW480中FLIPmRNA和蛋白水平(P0.01),转染FLIP-siRNA后,TRAIL对大肠癌胞株SW480的遏制作用显著加强(P0.05),TRAIL介导凋亡明显增高(P0.05)。结论 RNAi靶向沉默c-FLIP(L)并能提高SW480对TRAIL灵敏度并诱使SW480凋亡。     

miR-378对骨髓增生异常综合征细胞凋亡及增殖的影响

目的 研究miR-378对骨髓增生异常综合征SKM-1细胞凋亡和增殖的影响.方法 我们分别用miR-378重组慢病毒和阴性对照病毒感染SKM-1细胞.然后采用CCK-8检测miR-378对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞仪检测各实验组细胞凋亡和周期情况,并用Western blot检测凋亡过程中的关键因子cleaved-caspase-3蛋白的表达.用生物信息学方法预测miR-378可能的靶基因,用PCR和Western blot进行初步验证.结果 miR-378慢病毒转染组的细胞增殖活性明显降低,流式细胞术检测miR-378组的细胞凋亡率为(12.90±3.72)％,明显高于阴性对照病毒转染组和空白对照组[(3.21±1.91)％、(2.78±1.04)％,P＜0.01];miR-378组的G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.同时,Western blot结果显示miR-378过表达引起了cleaved-caspase-3的表达升高.用生物信息学方法预测抗凋亡蛋白基因BCL2L2为miR-378潜在的靶基因,并发现miR-378可以抑制BCL2L2蛋白的表达.结论 miR-378可以通过引起细胞凋亡和细胞周期阻滞来抑制SKM-1细胞的增殖,并降低BCL2L2蛋白的表达.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在B淋巴瘤细胞株中的敏感性及诱导细胞凋亡机制

目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)在B淋巴瘤细胞株中的敏感性及TRAIL通过线粒体信号通路诱导人B淋巴瘤细胞株Ramos凋亡的机制.方法 采用CCK-8法检测肿瘤细胞增殖,流式细胞术分析细胞线粒体膜电位、细胞表面受体DR4/DR5表达及细胞凋亡率变化,并用Western Blot测定Ramos细胞经TRAIL作用24 h后相关凋亡蛋白的表达水平.结果 供试的4株B淋巴瘤细胞中,Ramos细胞为TRAIL敏感株,Ramos细胞表面受体DR4/DR5表达水平明显高于TRAIL耐药株;TRAIL抑制Ramos细胞增殖通过诱导细胞凋亡介导;细胞调亡伴随线粒体膜电位明显变化;Western Blot免疫印迹结果显示,药物作用后,细胞内相关凋亡信号分子包括Caspase-9,Caspase-3,PARP蛋白等均明显活化.结论 4株B淋巴瘤细胞株对TRAIL敏感性不同,并与DR4/DR5表达相关;TRAIL抑制Ramos细胞增殖,诱导细胞凋亡,引起线粒体膜电位明显下降,活化Caspase-9及下游凋亡蛋白;线粒体调亡途径是介导TRAIL诱导Ramos细胞凋亡的途径之一.     

TRAIL诱导乙型肝炎病毒转染细胞株凋亡的实验研究

目的探讨人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)对HBV稳定转染的肝癌细胞株HepG2.2.15的凋亡诱导效果。方法应用MTT法了解TRAIL对HepG2.2.15细胞的诱导效果,琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术和Caspase-3酶活性分析TRAIL诱导HepG2.2.15细胞凋亡过程。结果TRAIL(0.1μg/mL)作用于HepG2.2.15细胞株12、24、36h后,细胞抑制率分别为17.91%、41.26%、59.85%;PI单染亚二倍体含量12h后为21.8%,高于对照组的8.7%;24h后DNA电泳200bp处出现特异性条带;6h后Caspase-3酶活性为对照组的4.76倍。结论TRAIL诱导后,HBV稳定转染的肝癌细胞株HepG2.2.15发生凋亡。     

PDTC增强TRAIL对人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞凋亡的影响

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）联合吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对EBV阳性的人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法应用MTT法检测TRAIL（1、10、100ng／mL）及TRAIL（1、10、100ng／mL）＋100μmol／mLPDTC时Raji细胞的生长抑制率;原位末端酶标记技术（TUNEL）检测Raji凋亡细胞。结果①TRAIL 1、10ng／mL组12hRaji细胞生长抑制率分别为-35．52％及-15．07％;TRAIL 100ng／mL组12hRaji细胞生长抑制率为6．68％,并且呈时间依赖性（P〈0．05）。②TRAIL（1、10、100ng／mL）加入PDTC后,12hRaji细胞生长抑制率分别为1．18％、4．96％、14．63％,均显著高于TRAIL单用组（均P〈0．01）。③TRAIL（100ng／mL）联合PDTC时Raji细胞凋亡指数最高为79．49％,较TRAIL 100ng／mL（28．84％）有显著性升高,1、10ng／mL TRAIL联合PDTC后Rail凋亡细胞也均显著高于TRAIL单用组（均P〈0．01）。与MTT法检测结果具有一致性。结论TRAIL能诱导Raji细胞凋亡但作用不敏感。PDTC能显著增强TRAIL对Raji细胞的诱凋亡作用。     

细胞色素P450表氧化酶抑制肿瘤坏死因子诱导内皮细胞凋亡的研究

目的:研究细胞色素P450表氧化酶对肿瘤坏死因子诱导的内皮细胞凋亡可能的机制。方法:原代培养的牛主动脉内皮细胞分为4组,分别转染细胞色素P450表氧化酶基因rAAV-GFP、rAAV-2J2、rAAV-2C11、rAAV-F87V病毒液,2周后用肿瘤坏死因子?α(TNF?α)(10ng/mL)和放线菌素D(ActD)(5ng/mL)诱导凋亡,GFP组不加TNF?α和ActD作为对照,另设空白对照组,用Western blot法检测Bcl-2和Bax的表达,并用酶标法检测Caspase-3的活性。结果:Western blot结果表明转染CYP P450表氧化酶的各组后Bcl-2表达升高,Bax表达下降,Caspase-3的活性下降,较空白对照组及GFP对照组差异有统计学意义(P均<0.01)。结论:细胞色素P450抗内皮细胞凋亡的机制可能与上调Bcl-2表达,下调Bax表达及抑制Caspase-3活性有关。     

IGHG 1 基因对膀胱癌细胞增殖凋亡及迁移的影响

目的 探讨沉默IGHG 1 基因对膀胱癌EJ 细胞增殖、凋亡及迁移的影响。方法 将靶向沉 默IGHG 1 基因的慢病毒载体（LV-IGHG1-RNAi）感染EJ 细胞,构建稳定沉默IGHG 1 基因的EJ 细胞 （shIGHG1-EJ 细胞）作为实验组;将阴性对照序列（NC）慢病毒载体感染EJ 细胞,构建稳定转染NC 序 列的NC-EJ 细胞作为阴性对照组;未转染膀胱癌EJ 细胞作为空白对照组。用实时荧光定量聚合酶链反应 （qRT-PCR）检测细胞IGHG1 mRNA 的相对表达量,Western blot 检测细胞IgG、Caspase-3 和Caspase-3 剪 切片段蛋白的表达,CCK-8 法检测细胞的增殖,流式细胞术（FCM）检测细胞的凋亡,细胞划痕实验检测细 胞的迁移。结果 shIGHG1-EJ 细胞转染率为（76.667±0.042）%,NC-EJ 细胞转染率为（75.333±0.055）%。 qRT-PCR、Western blot 检测结果显示,与空白对照组相比,shIGHG1-EJ 细胞IGHG1 mRNA 和IgG γ 蛋 白表达量降低（P <0.05）,shIGHG1-EJ 细胞IGHG 1 基因被沉默。CCK-8 法结果显示,与空白对照组相比, shIGHG1-EJ 细胞增殖降低（P <0.05）;FCM 和Western blot 检测结果显示,与空白对照组相比,shIGHG1-EJ 细胞凋亡率增加（P <0.05）,且在17 kD 处出现Caspase-3 剪切片段;细胞划痕实验结果显示,shIGHG1-EJ 细胞迁移能力仅为EJ 细胞的36%（P <0.05）;同时NC-EJ 细胞在增殖、凋亡及迁移方面与EJ 细胞比较,差 异无统计学意义（P >0.05）。结论 EJ 细胞经慢病毒载体沉默IGHG 1 基因后,细胞增殖和迁移水平降低,细 胞凋亡率增加。     

腺相关病毒介导的狨猴P53基因沉默研究

目的 在细胞和整体动物水平,利用RNA干扰技术下调绒猴p53基因表达。 方法 对狨猴p53基因做生物信息学分析,针对靶序列设计shRNA干扰序列,构建在腺相关病毒载体上,转染非洲绿猴肾细胞(cos-7),在细胞水平用荧光定量PCR检测p53mRNA抑制效果,以Western blot方法检测p53蛋白水平表达变化;优选shRNA干扰序列,包装含shRNA干扰序列的8型腺相关病毒,静脉注射感染狨猴;手术取少量肝脏组织,用Western blot和免疫组化方法检测p53蛋白水平的变化。结果 细胞水平研究发现2个有效RNA干扰靶点,mRNA干扰效率分别为(82.7?.1)%和(80.7?.5)%(P<0.05);蛋白表达下调(77.3?1.5)%和(73.7?0.7)%（P<0.05）;2只绒猴感染病毒后,经活体荧光成像分析可见病毒在肝脏、睾丸、颈部等位置分布,狨猴肝脏P53蛋白经Western blot、免疫组化分析未见明显变化。结论 本研究在细胞水平实现绒猴P53基因表达下调,但整体动物水平狨猴肝脏P53蛋白表达未发现明显变化;今后需在感染方式等方面做进一步优化。     

纤维粘连蛋白EDA片段抑制P53核转位调控肠癌SW480细胞凋亡

目的 探讨P53在纤维粘连蛋白EDA片段(fibronectin extra domain A,FN-EDA)调控结肠癌细胞凋亡中的作用及机制.方法 基因集富集分析法分析结直肠癌基因芯片EDA高表达组(EDA_high)与EDA低表达组(EDA_low)基因富集情况;干扰结肠癌SW480细胞FN-EDA表达,流式细胞术检测各组凋亡,RT-PCR检测各组凋亡相关基因RNA水平,Western blot检测各组凋亡相关蛋白表达及P53蛋白磷酸化修饰,免疫荧光检测P53亚细胞分布,蛋白质免疫共沉淀检测P53与FN-EDA相互作用.结果 结肠癌FN-EDA低表达组凋亡相关基因(KEGG_APOPTOSIS)富集上调(P＜0.05);与对照组相比,FN-EDA敲低组凋亡率增加(P＜0.05),P53、BAX、P21、Cleaved Caspase-3蛋白表达上调,P53蛋白Ser15、Ser37、Ser392磷酸化水平上调,核内转位增加.FN-EDA敲低组细胞转染FN-EDA过表达慢病毒后,凋亡率降低(P＜0.05),P53蛋白Ser15、Ser37磷酸化水平下调,核内转位减少;蛋白质免疫共沉淀检测发现P53与FN-EDA具有相互作用.结论 纤维粘连蛋白EDA片段通过与P53相互作用抑制P53磷酸化和核转位,调控P53-BAX通路抑制结肠癌SW480细胞凋亡.     

LncRNA RNU12上调热休克蛋白72抑制重组人TRAIL蛋白诱导肝癌细胞凋亡

目的 探讨46 ～ 50℃时抑制重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosisfactor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)蛋白促肝癌细胞凋亡相关分子机制.方法 建立肝癌细胞亚致死性热温度模型,在不同温度(43、46、50℃)条件下分别处理10 min,Annexin-V/PI染色检测重组人TRAIL蛋白对肝癌细胞凋亡率的影响,以常温37℃作为对照组.根据前期肝癌细胞Agilent Human lncRNA+ mRNA Array V4.0芯片表达谱数据,选定50℃时特异性高表达的LncRNA RNU12作为研究对象.构建LncRNA RNU12-shRNA慢病毒干扰载体,转染MHCC97-H细胞.qRT-PCR及Western blot检测感染前后不同温度组中热休克蛋白72(heat shock protein 72,HSP72) mRNA和蛋白的表达变化.利用流式细胞技术检测LncRNA RNU12慢病毒干扰载体对TRAIL蛋白诱导细胞凋亡的影响.采用荧光原位杂交(FISH)技术检测LncRNA RNU12亚细胞定位情况.结果 温度在43℃时促进重组人TRAIL蛋白诱导肝癌细胞凋亡的功能,46～50℃时抑制重组人TRAIL蛋白诱导肝癌细胞凋亡的功能.HSP72 mRNA在4个温度组中的表达均较干扰前明显降低(P＜0.01);在蛋白水平,37、46、50℃组较干扰前显著降低(P＜0.05).转染后,46、50℃条件下TRAIL蛋白诱导MHCC97-H细胞凋亡分别上升7.36％、8.84％(P＜0.01).利用RNA-FISH技术确定50℃时LncRNA RNU12主要在MHCC97-H细胞细胞核中表达.结论 LncRNA RNU12在转录水平上调HSP72表达可能是46 ～ 50℃时抑制重组人TRAIL蛋白促肝癌细胞凋亡分子机制之一.     

长链非编码RNA CCAT2在肝癌中的作用及其机制

目的 探讨长链非编码RNA CCAT2(LncRNA CCAT2)在肝癌中的作用及机制.方法 选取我院2013年1-6月60例肝癌及其癌旁组织,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测其组织中CCAT2的表达,同时培养正常肝细胞L02和人源性肝癌细胞系HepG、H2P、SMMC和HLE细胞,采用qRT-PCR检测细胞中CCAT2的表达,采用siRNA干扰细胞CCAT2表达后,在24、48、72、96 h用CCK-8检测SMMC和HLE细胞增殖;Transwell实验分析细胞迁移和侵袭情况;采用流式细胞仪分析CCAT2对SMMC和HLE细胞周期分布和凋亡的影响;Western blot检测P53、Bcl-2、Caspase-8蛋白的表达.结果 在肝癌组织和肝癌细胞中,CCAT2的表达显著升高(P均＜0.05),CCAT2高表达的患者预后和生存率均较低(P均＜0.05).肝癌细胞中低表达的CCAT2能显著抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭(P均＜0.05).肝癌细胞中低表达的CCAT2也能使肝癌细胞周期停留在Go/G1期并促进细胞凋亡(P均＜0.05).采用siRNA干扰细胞CCAT2表达后,肝癌细胞中P53和Caspase-8蛋白的表达显著升高(P均＜0.05),Bcl-2蛋白的表达显著降低(P＜0.05).结论 CCAT2在肝癌组织和细胞系中高表达,siRNA干扰CCAT2表达后能够抑制细胞增殖、迁移、侵袭以及促进肝癌细胞的凋亡,其机制可能通过升高P53和Caspase-8蛋白的表达和降低Bcl-2蛋白的表达有关.     

下调FoxM1通过激活JNK/线粒体通路增加人鼻咽癌细胞对紫杉醇的敏感性

目的 探讨特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA) 沉默转录因子叉头框M1(FoxM1) 对人鼻咽癌HONE-1细胞增殖、凋亡、紫杉醇敏感性的影响及可能的分子机制.方法 采用siRNA靶向沉默鼻咽癌HONE-1细胞FoxM1表达并通过RT-PCR、实时定量PCR、Western blot检测转染后FoxM1的表达水平.siRNA转染后细胞的增殖和对紫杉醇的敏感性采用MTT法检测,流式细胞仪检测细胞周期分布,Annexin V-FITC /PI双染法检测细胞凋亡率.Western blot检测Ki67、CyclinE1、多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1) 及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK) 、p-JNK、 c-Jun、p-c-Jun、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达水平.结果 转染后FoxM1 mRNA及蛋白的表达均被下调(P＜0. 01) .siRNA转染组细胞增殖速率减缓(P＜0. 05),Ki67表达降低(P＜0. 05) .siRNA转染组G1期细胞比例增加(P＜0. 01),S期比例减低(P＜0. 05),Cyclin E1低表达(P＜0. 01) .同时, siRNA +紫杉醇组凋亡率明显高于阴性及空白对照+ 紫杉醇组(P＜0. 01) .siRNA转染组细胞MDR1水平下降(P＜0. 05),对紫杉醇的敏感性较两对照组明显增强(P＜0. 01) .siRNA + 紫杉醇组与阴性对照+ 紫杉醇组相比p-JNK1、p-c-Jun、Bax表达上调(P＜0. 01),Bcl-2表达下调(P＜0. 01) .结论 特异性siRNA沉默FoxM1表达可以影响JNK/线粒体通路活性,抑制鼻咽癌HONE-1细胞增殖,促进其凋亡,提高其对紫杉醇的敏感性.     

HPK1过表达对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的：构建造血祖细胞激酶1（HPK1）慢病毒载体,探讨HPK1过表达对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的作用,阐明其可能的机制。方法：通过过表达HPK1的慢病毒感染细胞,获得稳定表达HPK1的细胞系（MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1）,将2个细胞系分别分为3组,即空白组、对照组（空载体组）和过表达组;分别采用RT-PCR法和Western blotting法检测乳腺癌细胞中HPK1 mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率,Transwell法分析细胞的迁移能力,Western blotting法检测caspase 3、PTEN、MMP-9、MMP-2、Ki-67和HPK1蛋白表达水平。结果：与空白组和对照组比较,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞过表达组中HPK1 mRNA和蛋白表达水平升高（P < 0.05）,细胞增殖率明显降低（P < 0.05）,细胞凋亡率明显升高（P < 0.05）,穿越Matrigel的细胞数明显减少（P < 0.05）,MCF-7细胞周期阻断在G₁期;过表达组细胞中caspase 3、PTEN蛋白表达水平上调（P < 0.05）,MMP-9、MMP-2、Ki-67蛋白表达水平降低（P < 0.05）。结论：HPK1过表达可抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖及迁移并诱导凋亡,其可能与caspase 3、PTEN蛋白的表达上调及MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白的表达降低有关。     

前列腺癌细胞PC-3M对外源基因pPSA-P21表达的抑制作用

目的:观察外源p21WAF-1/CIP1p21基因在前列腺癌细胞PC-3M中的表达及对细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建前列腺组织特异性表达载体pPSA-p21,用lipofectin转染PC-3M细胞,MTT法检测转染前后的细胞生长情况,转染后72h收集细胞进行Westernblotting检测P21蛋白的瞬时表达,并用流式细胞技术(FCM)分析细胞周期和检测细胞P53蛋白的表达。结果:转染后的细胞生长并未受到明显抑制,转染后72hWesternblotting未检测到P21蛋白,FCM分析显示PC-3M细胞多处于G0～G1期和S期,野生型P53和突变型P53蛋白均未见明显表达。结论:PC-3M细胞对外源p21的表达有抑制作用。     

FoxM1 shRNA慢病毒载体构建及感染人前列腺癌细胞的稳定细胞株筛选

目的构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人FoxM1 shRNA重组慢病毒载体,并构建筛选FoxM1敲低的人前列腺癌稳定细胞
株,检测FoxM1的表达及对细胞增殖能力的影响。方法设计并合成3对特异性针对人FoxM1基因的shRNA靶序列,构建到
pHBLV-U6-ZsGreen-Puro 慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,利用慢病毒三质粒系统转染包装293T细胞,荧光显微镜下观
察转染效率。收集到的病毒上清转染人前列腺癌DU-145细胞,Real-time PCR检测各组细胞FoxM1 mRNA水平,经嘌呤霉素
筛选建立FoxM1敲低稳定细胞株,用Western blotting法检测细胞中FoxM1表达,并用MTT法观察稳转细胞的生长增殖活性,
流式细胞术观察稳转细胞凋亡情况,平板克隆实验观察稳转细胞的克隆形成能力。结果经测序鉴定成功构建了3对FoxM1
shRNA慢病毒载体,并进行包装,感染DU-145细胞后Real-time PCR检测结果表明第1对慢病毒载体干扰效率最佳,嘌呤霉素
抗性筛选建立了FoxM1敲低稳定细胞株,荧光显微镜观察感染效率较高,Western blotting结果显示细胞中FoxM1蛋白表达明
显受到抑制,细胞的生长增殖能力明显受限,流式细胞术结果显示FoxM1敲低组细胞凋亡率高于对照组,平板克隆实验结果表
明FoxM1敲低组细胞克隆形成能力下降。结论本研究成功构建了FoxM1 shRNA慢病毒载体,建立了FoxM1敲低稳定前列腺
癌细胞株,抑制细胞内FoxM1的表达能够抑制前列腺癌细胞DU-145的生长增殖、克隆形成能力,并能诱导细胞凋亡。
     

钙激活核苷酸酶1敲低对肾透明细胞癌769-P细胞增殖和迁移的影响

目的 探究钙激活核苷酸酶1(calcium-activated nucleotidase 1,CANTl)对人肾透明细胞癌769-P细胞系增殖和迁移的影响,并对其作用机制进行初步探讨.方法 免疫组化检测临床肿瘤及癌旁组织CANT1的表达差异.包装携带干扰CANT1的shRNA及空白对照shRNA慢病毒,并转染769-P细胞系,采用RT-PCR和Western blot分别在mRNA及蛋白水平验证shRNA干扰效率.稳定转染后,采用CCK-8和划痕实验分别检测细胞增殖、迁移能力,采用流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡情况.结果 成功建立稳定转染的CANT1干扰细胞系.免疫组化显示CANT1在癌周正常肾组织中仅表达于远曲小管,近曲小管无或者仅有少量表达,而在肾透明细胞癌组织中,CANT1呈弥漫高表达状态.CANT1干扰组细胞较对照组细胞增殖明显减慢(P＜0.01),迁移能力明显减弱(P＜0.05),干扰组细胞周期阻滞于S期,细胞凋亡增多(P＜0.05).结论 CANT1敲低能明显抑制肾透明细胞癌769-P细胞系的增殖和迁移,使细胞周期阻滞于S期,凋亡细胞明显增多.     

Src在胃癌腹腔转移多细胞团簇抗失巢凋亡中的作用

目的 探讨Src蛋白对体外三维培养的胃癌多细胞团簇(multicellular aggregates,MCAs)增殖及凋亡的影响.方法 体外三维培养人胃腺癌细胞BGC823和MKN45成MCAs,Western blot检测MCAs和单层贴壁培养的胃癌细胞中Src蛋白表达情况.siRNA法干扰Src表达,转染胃癌细胞后检测其对胃癌细胞BGC823和MKN45 MCAs形态学的影响.分别采用CCK-8和流式细胞术检测干扰Src表达对胃癌BGC823和MKN45 MCAs细胞活力和细胞凋亡率的影响.结果 利用BGC823和MKN5成功建立胃癌MCAs体外三维培养模型,Westem blot检测结果表明,与对照组比较,MCAs中Src的表达水平明显高于单层贴壁培养的胃癌细胞[BGC823:(0.615 ±0.068)vs(0.219 ±0.017),P＜0.01;MKN45:(0.657 ±0.087) vs (0.420 ±0.015),P＜0.05].干扰胃癌细胞BGC823和MKN45 Src表达,可以显著降低MCAs形成能力,并明显影响MCAs活力.流式细胞术检测结果表明,干扰Src表达可以显著诱导MCAs发生凋亡[BGC823:(9.456±0.209)vs(3.026±0.201),P＜0.01;MKN45:(9.356 ±0.416) vs(2.541 ±0.251),P＜0.05].结论 Src是胃癌MCAs抗失巢凋亡的关键分子,抑制Src表达可以显著抑制胃癌BGC823 MCAs和MKN45 MCAs形成,影响胃癌MCAs增殖,并诱导胃癌MCAs凋亡.     

FoxM1通过Wnt/β-catenin信号通路对鼻咽癌细胞5-8F增殖、迁移的影响

目的 探讨FoxM1对鼻咽癌细胞5-8F恶性生物学行为的影响及其可能机制.方法 将化学合成的靶向FoxM1的siRNA转染鼻咽癌细胞5-8F(FoxM1-siRNA组),并设立空白对照组、阴性对照组,采用RT-PCR及Western blot检测FoxM1表达变化.采用MTT法、FCM法、Transwell法分别检测下调FoxM1表达对细胞增殖、周期、凋亡、迁移的影响.Western blot检测下调FoxM1表达后β-catenin、C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达变化.结果 转染FoxM1-siRNA的5-8F细胞FoxM1 mRNA和蛋白表达水平降低(P＜0.05).下调FoxM1表达可抑制5-8F细胞增殖(P＜0.05),FoxM1-siRNA组的凋亡率为(22.68±0.67)％,较阴性对照组[(1 1.74±1.36)％]和空白对照组[(10.94±1.52)％]显著增加(P＜0.05),细胞周期阻滞于G0/G1期.FoxM1-siRNA组细胞穿膜数(100.00±10.97)明显低于阴性对照组(246.00±6.66)和空白对照组(233.70±12.41),细胞迁移能力降低(P＜0.05).下调FoxM1的表达可抑制β-catenin细胞核表达,抑制C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9总蛋白表达(P＜0.001).结论 FoxM1表达下调抑制鼻咽癌细胞5-8F的增殖,诱导细胞凋亡,降低细胞迁移能力,使细胞周期阻滞于G0/G1期.其机制可能是通过抑制Wnt通路关键蛋白β-catenin细胞核表达从而抑制Wnt 通路活性实现的.