细胞外信号调控激酶在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯诱导的尿道下裂大鼠中的表达

目的在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]诱导的先天性尿道下裂大鼠模型上,研究细胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2在DEHP暴露后的胎鼠阴茎中的表达变化,探讨尿道下裂发生机制。方法将SD孕鼠完全随机分为DEHP组[750 mg/(kg·d)DEHP+1.5 mL大豆油]和对照组(1.5 mL大豆油),每组20只,2组分别于母鼠怀孕天数(GD)第12～19天持续经口灌注给药。2组分别取10只孕鼠让其正常分娩,并计数每窝产雄性活仔鼠数量;出生后1、3、7、14、21、30日龄时称取雄性仔鼠体质量并测量肛门生殖器距离(anogenital distance,AGD);30日龄时逐个检查尿道下裂的发生情况。余孕鼠在GD20行剖宫产取雄性胎鼠,应用实时定量聚合酶链反应(qPCR)和免疫组化方法分别检测胎鼠阴茎组织中ERK1/2 mRNA和蛋白表达水平。结果 DEHP组孕期暴露诱导的尿道下裂发生率为28.2%。DEHP组每窝产雄性活仔鼠数量、各日龄雄性仔鼠体质量及AGD较对照组明显减少或缩短(P<0.01)。与对照组比较,DEHP组胎鼠阴茎组织中ERK1和ERK2 mRNA表达水平明显增加(P<0.05);DEHP组ERK1/2磷酸化蛋白表达水平有增加趋势。结论 DEHP诱导先天性尿道下裂发生可能与胎鼠阴茎组织中ERK信号的过度表达有关。     

塑化剂邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯诱导大鼠尿道下裂的研究

目的采用塑化剂邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)宫内暴露诱导建立大鼠尿道下裂模型,观察DEHP的外生殖器毒性作用。方法孕鼠40只,完全随机分成4组:正常对照组和DEHP低中高3个剂量组[分别为500、750、1 000 mg/(kg.d)]。在怀孕天数(GD)第12～19天连续灌胃,出生后(PND)第1天即对新生鼠进行计数,称体质量和测量肛门至生殖器之间的距离(AGD);PND30测量阴茎长度,观察每组雄性仔鼠的尿道开口位置,判断有无尿道下裂及其严重程度并切取整个阴茎进行病理组织HE染色。结果与对照组相比,随着DEHP暴露剂量增大,每窝产活仔数及雄性活仔数均较对照组有显著减少;同时仔鼠的体质量减轻、AGD和阴茎长度缩短明显(P<0.05,P<0.01)。DEHP低、中、高剂量组诱导出雄性仔鼠尿道下裂发生率分别为10.7%、30.6%和37.0%,与正常对照组比较,差异显著(P<0.05,P<0.01);重型尿道下裂发生率分别为0、8.3%和22.2%;阴茎组织横截面石蜡切片HE染色予以验证。结论 DEHP大鼠宫内暴露成功建立尿道下裂模型,且对子代具有一定的发育和外生殖器毒性效应。     

Lamin B1在邻苯二甲酸二丁酯致大鼠尿道下裂发生中的表达变化

目的:利用邻苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate,DBP)胚胎晚期暴露导致SD胎鼠尿道下裂发生的动物模型,验证Lamin B1在尿道下裂与正常胎鼠阴茎中的差异表达,以进一步探讨尿道下裂的发生机制?方法:妊娠14~18天 SD雌鼠20只,随机分为2组,实验组和对照组分别给予DBP 800 mg/(kg·d)和大豆油2 ml/d灌胃,孕期第19天剖宫产后记录雄性胎鼠肛门和生殖器之间的距离(AGD)?出生体重(BW)及尿道下裂发生数,取雄性胎鼠阴茎,运用免疫印迹法和免疫组织化学方法分析Lamin B1的表达情况?结果:实验组AGD/BW与对照组相比有显著性差异(P < 0.05);尿道下裂发生率为40%;Lamin B1在对照组的相对表达量为0.923±0.013(n=10),实验组为0.593±0.014(n=10),差异有统计学意义(P < 0.05);Lamin B1主要定位于尿道上皮细胞,对照组染色强度明显强于实验组?结论:DBP灌胃期间改变了尿道组织中Lamin B1的表达,影响了细胞迁移和尿生殖褶的融合,这可能是尿道下裂发生的原因之一?     

邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯对血睾屏障完整性的损伤及机制

目的 探讨邻苯二甲酸二-(2-乙基己)酯(DEHP)破坏睾丸血睾屏障完整性的机制研究.方法 将出生后60 d的SD雄鼠随机分为两组,即玉米油对照组和DEHP暴露组,DEHP的用药剂量为750 mg/kg,采用灌胃的方式给药,每天1次,连续处理30 d,并于最后1次处理后麻醉处死.HE染色观察睾丸的组织病理学改变情况;Western blot检测睾丸组织中构成血睾屏障的关键连接蛋白N-cadberin、β-catenin、occludin和connexin43 (Cx43)的膜蛋白表达水平;MTT检测睾丸支持细胞(Sertoli cell)的活力,活性氧检测试剂盒检测细胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成水平;Western blot检测抗氧化应激蛋白Nrf2以及p-p38的蛋白表达水平.结果 与对照组相比,DEHP暴露后的睾丸曲细精管结构紊乱,管腔中可见圆形的精子细胞,精子排列失去极性;Western blot结果表明occludin和connexin43的表达明显降低,N-cadherin和β-catenin表达明显升高(P＜0.05);Sertoli细胞随着DEHP暴露浓度的增加,活力显著降低,ROS生成水平明显增加,Nrf2和p-p38的蛋白表达明显增高(P＜0.05).结论 DEHP暴露可通过氧化应激激活p38 MAPK信号通路,破坏血睾屏障完整性,并最终损伤生精功能.     

邻苯二甲酸二乙酯诱导的大鼠尿道下裂与Mafb的表达相关:基于转录组测序结果

目的通过转录组测序筛选大鼠尿道发育过程中相关差异基因,并进行验证;探究邻苯二甲酸二乙酯（DEHP）诱导SD大鼠 尿道下裂的发生机制。方法40只成年SD孕鼠随机分成4组（n=10）,前两组予以空白对照处理,分别于妊娠期16 d（GD16组） 和GD19 d（GD19组）剖宫产取出雄性胎鼠,将收集好的胎鼠阴茎组织进行转录组测序,lllumina HiSeq 2000筛选出差异表达基 因（DEGs）,然后对DEGs进行差异基因功能（GO）和pathway显著富集性分析;选取其中的DEG（Mafb）进行免疫荧光验证。后 两组分别予以玉米油（对照组）和DEHP [750 mg/(kg·d)]（DEHP暴露组）于GD12 d至GD19 d每日灌胃处理,GD19 d剖宫产取 出雄性胎鼠,并判断有无尿道下裂的发生。扫描电镜和HE染色观察阴茎组织形态学改变,免疫荧光和Western blot检验阴茎组 织中Mafb、β-catenin的表达水平。结果GD19组胎鼠阴茎组织与GD16组胎鼠阴茎组织转录组测序结果示1360个DEGs（其中 上调797个,下调563个）,差异基因主要富集于细胞粘着斑信号通路、轴突导向信号通路、细胞外基质受体作用信号通路等,选 取DEG（Mafb）进行免疫荧光验证,发现Mafb的表达随发育显著增加,与测序结果相符。而DEHP暴露组胎鼠阴茎组织与对照 组胎鼠阴茎组织相比,Mafb、β-catenin表达水平显著下调（P<0.01）。结论随着大鼠阴茎组织的正常发育,Mafb的表达逐渐增 加;而DEHP暴露组较对照组Mafb、β-catenin表达显著下调,提示β-catenin信号通路影响Mafb表达可能与DEHP诱导大鼠尿道 下裂发生相关。     

甲基汞影响小鼠胚胎肠上皮凋亡的体外实验

目的:观察低剂量氯化甲基汞(methylmercury chloride,MMC)对胎鼠肠上皮细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响.方法:分别取E13.5d、E14.5d胎鼠的十二指肠及结肠,体外培养,分别加入MMC液(0μg/L,200μg/L,400μg/L,800μg/L),培养24h后取出标本,制成石蜡切片.部分切片经HE染色,体视学法计数肠上皮中的凋亡小体;余切片经免疫组化染色,观察凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,P53及c-Fos的表达.结果:①实验各组肠上皮凋亡小体数均较对照组高,P＜0.05,与MMC剂量呈正相关,P＜0.01.②Bcl-2在各实验组胎鼠肠上皮细胞的表达均低于对照组,P＜0.05,与MMC的剂量呈负相关,P＜0.01;而Bax、P53及c-Fos的表达则高于对照组,P＜0.05,与MMC剂量均呈正相关,P＜0.01.结论:MMC在体外可促进胎鼠肠上皮细胞凋亡,可能是一种通过下调Bcl 2表达,上调Bax及c-Fos表达的机制.     

胰岛素样因子3在邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯诱导隐睾发生过程中的表达分析

目的：研究环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二（2-乙已基）酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）作用于孕鼠后,其胎鼠睾丸组织中胰岛素样因子3（Insulin like factor3,INSL3）mRNA和蛋白质的表达情况;探讨DEHP诱发小鼠隐睾的分子机制.方法：妊娠KM小鼠随机分为3组：正常对照组、玉米油对照组和DEHP实验组.玉米油对照组和DEHP实验组自妊娠12.5d到妊娠18d分别持续经口予以玉米油和DEHP500mg/（kg.d）,正常对照组不予灌药.结果：正常对照组和玉米油对照组睾丸组织中INSL3 mRNA和蛋白质的表达均无差异（P〉0.05）;DEHP实验组INSL3 mRNA的表达量约为对照组的1/3,与对照组相比其差异具有显著性（P〈0.05）;实验组INSL3蛋白质的表达量约为对照组的1/4,与对照组相比其差异具有显著性（P〈0.05）.结论：环境内分泌干扰物DEHP下调睾丸间质细胞INSL3 mRNA和蛋白质的表达,影响睾丸引带发育,可能是DEHP诱发隐睾的分子机制之一.     

Wnt/β-catenin与NF-κB信号通路在邻苯二甲酸二丁酯诱导雄性大鼠发生尿道下裂中的表达

目的: 利用邻苯二甲酸二丁酯(DBP)孕晚期暴露诱导子代SD大鼠发生尿道下裂,验证Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)及核因子κB(NF-κB)信号通路中关键蛋白在胎鼠生殖结节中的差异表达,探讨该通路在DBP致大鼠生殖系统发育异常过程中的作用机制?方法:孕SD大鼠20只,随机分为DBP组和对照组,在妊娠(GD)14~18天,每天分别通过灌胃给予DBP和大豆油800 mg/kg,于GD 19天处死后取胎鼠,鉴别出DBP组中发生尿道下裂的雄性胎鼠及对照组中的雄性胎鼠,分为尿道下裂组与正常对照组,提取生殖结节组织,Western blot检测β-catenin?糖原合成酶-3β(GSK-3β)和NF-κB的表达情况?结果:DBP染毒后子代雄性胎鼠出生体重较对照组明显下降,肛门生殖器距离(AGD)明显缩短,尿道下裂发生率为46.7%,同时尿道下裂组与正常对照组中β-catenin相对表达量的比值为0.505±0.014(P < 0.05),GSK-3β与NF-κB相对表达量的比值分别为1.903±0.018和3.661±0.021(P均< 0.05)?结论:DBP可能通过干预生殖结节中Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路的正常表达导致尿道下裂的发生?     

塑化剂DEHP与植物雌激素GEN孕期暴露对雄性子代大鼠发育影响

目的:探讨DEHP与GEN孕期暴露对雄性子代大鼠发育的影响。方法:30只孕鼠于孕3d(GD3)至孕20d(GD20),每天按分组方案灌胃,观察干预后对子代大鼠及亲代母鼠的影响。结果:孕期单一暴露于DEHP(250mg/kg)及GEN(400mg/kg),平均每窝活产只数、仔鼠只数、出生时性别比、子代雄鼠体重及AGD/体重1/3、母鼠体重变化等较对照组无显著性变化(P<0.05)。孕期同时暴露于DEHP(250mg/kg)与低剂量GEN(50mg/kg),子代雄鼠体重较对照组的显著性下降(P?0.05)。孕期同时暴露于DEHP(250mg/kg)与高剂量GEN(400mg/kg),子代雄鼠体重较其余四组均出现显著性下降(P?0.05)。结论:孕期DEHP与GEN同时暴露对雄性子代大鼠体重造成一定影响。     

邻苯二甲酸二(2⁃乙基己基)酯通过抑制PI3K/AKT信号通路损害人冠状动脉内皮细胞的功能

目的：探究邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]暴露对PI3K/AKT信号通路和人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cell,HCAEC)的影响,探索DEHP暴露致HCAEC损伤的机制。方法：根据相关文献研究,用不同浓度DEHP处理HCAEC,设置对照组(DMSO)和实验组(DEHP 128、256、384、512 μmol/L)。用CCK-8法测定细胞增殖能力;体外成管实验评估细胞成管能力;流式细胞术评估细胞凋亡水平;Western blot 检测细胞中 p-PI3K、 PI3K、p-AKT、AKT和凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2、cleaved Caspase-3、Caspase-3的水平。结果：CCK-8结果显示,DEHP以浓度和时间依赖的方式抑制HCAEC的增殖(P ＜ 0.05)。体外成管实验结果显示,实验组细胞形态多呈孤立的圆形、卵圆形,当DEHP 浓度≥256 μmol/L时,其形成交点数目较对照组减少(P ＜ 0.05)。流式细胞实验结果显示,实验组凋亡比例较对照组上升(P ＜ 0.05)。Western blot结果显示实验组Bcl-2表达水平较对照组降低,同时BAX和cleaved Caspase-3/Caspase-3的水平升高(P ＜ 0.05);当DEHP≥256 μmol/L时,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值较对照组降低(P ＜ 0.05)。结论：DEHP可通过抑制PI3K/AKT/信号通路诱导HCAEC凋亡,抑制其增殖、血管形成能力。     

邻苯二甲酸二丁酯干预Fgfs信号通路致雄性仔鼠尿道下裂发生的分子机制研究

目的:通过验证邻苯二甲酸二丁酯(DBP)孕期染毒所致尿道下裂雄性仔鼠生殖结节内成纤维细胞生长因子(Fgfs)及其受体(Fgfr)信号通路中关键基因的表达异常,探讨其在DBP生殖毒性过程中的作用机制.方法:孕鼠20只,随机分2组,在怀孕(GD)14～18天期间,每天分别灌胃给予大豆油、DBP 750 mg/kg,出生后第1天(PND1),统计仔鼠出生数、尿道下裂发生率,称量雄性仔鼠体重,肛门至生殖器距离(AGD);PND7,取尿道下裂雄性仔鼠生殖结节,用实时定量(real-time quantitative)RT-PCR方法检测生殖结节中Fgf8、Fgf10、Fgfr2的mRNA表达水平.结果:DBP染毒后导致新生仔鼠与正常组相比数量明显减少,雄性仔鼠体重明显下降、AGD明显缩短,雄性仔鼠尿道下裂的发生率为48.83%.同时,与对照组相比,DBP致尿道下裂雄性仔鼠生殖结节中Fgf8、Fgf10、Fgfr2的mRNA的表达水平明显下降.结论:DBP对母体有着明显的毒性作用,DBP干预了Fgfs信号通路中关键基因的表达,这可能是DBP导致生殖结节发育异常,引起尿道下裂的重要原因.     

氟他胺建立SD大鼠尿道下裂模型的实验研究

目的采用抗雄激素类药物氟他胺诱导建立大鼠尿道下裂动物模型,为进一步研究尿道下裂发病的分子作用机制和治疗提供理论和实验依据。方法孕鼠20只,随机分成2组:生理盐水(normal saline,NS)对照组和氟他胺(Flutamide,Flu)组,每组10只。在孕12～17d时连续6d分别经皮下注射等量生理盐水或用生理盐水配制的氟他胺溶液(12.5mg.kg-1.d-1)。于孕18d解剖两只母鼠,提取雄性胎鼠生殖结节做病理切片,同时观察睾丸位置和前列腺发育情况。待孕鼠分娩完毕,即对仔鼠进行记数,并于出生后第2、13、28天测量肛门生殖器距离(anogenital distance,AGD)和称重;观察每组雄性仔鼠的尿道口和睾丸位置、乳晕数量及拍照。结果与对照组相比,氟他胺组雄性子代大鼠尿道下裂畸形发生率为100%,单侧隐睾发生率为31.25%,解剖观察无前列腺,出现乳晕数均为12个,AGD较对照组明显缩短,有显著统计学差异,但体重随着时间的推移无明显变化。结论用氟他胺可以诱导出稳定、直观的雄性大鼠尿道下裂模型,适宜推广。     

DEHP对新生雄性仔鼠毒性作用的实验研究

目的探讨邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)对新生雄性仔鼠毒性作用及机制。方法 DEHP分别以低、中、高3组剂量[10、100、750mg/(kg.d)]灌胃作用于怀孕12天到产后21天(GD12～PND21)的SD母鼠,观察DEHP对产后1天(PND1)及产后21天(PND21)雄性仔鼠体重、睾丸重量、肛生殖器距离(AGD)和其对胚胎Leydig细胞形态结构、促黄体生成素受体(LHR)及类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)的蛋白表达水平的影响。结果 PND1中、高剂量组雄仔鼠的体重下降明显,分别与对照组和低剂量组相比较均有显著性差异(P<0.01);高剂量组睾丸重量下降明显,与对照组相比较有显著性差异(P<0.05);中、高剂量组雄仔鼠的AGD均有不同程度缩短,与对照组和低剂量组相比缩短均有显著性差异(P<0.01)。PND21中、高剂量组雄仔鼠的体重下降明显,分别与对照组和低剂量组相比均有显著性差异(P<0.01);高剂量组睾丸重量下降明显,与对照组相比有显著性差异(P<0.01);中、高剂量组雄仔鼠的AGD缩短明显,分别与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。光镜下低剂量组可见胚胎Leydig细胞(FLC)聚集呈簇分布,中剂量组与高剂量组均可见胚胎Leydig细胞呈瘤样增生。电镜示低剂量组Leydig细胞椭圆形、长梭形,脂质颗粒减少,线粒体、滑面内质网丰富。中、高剂量组Leydig细胞呈梭形或椭圆形,大小不一,核大、圆,胞质丰富,细胞聚集一起,胞质内可见丰富的脂质颗粒,脂质颗粒染色深,滑面内质网及线粒体扩张。中、高剂量组睾丸FLC的LHR蛋白表达明显减弱,与对照组比较有显著性差异(P<0.01);高剂量组睾丸FLC的StAR蛋白表达减弱明显,与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。结论 DEHP对新生雄性仔鼠具有毒性作用,其可能机制是DEHP宫内暴露后,抑制睾丸FLC的LHR蛋白和StAR蛋白的表达从而影响睾丸的发育。     

高浓度富氢生理盐水对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤的作用

［摘要］ 目的探讨高浓度富氢生理盐水对腹腔注射脂多糖诱导急性肺损伤的影响。 方法选取60只清洁级SD雄性大鼠,随机分为空白组、高浓度富氢生理盐水组、脂多糖组、脂多糖+高浓度富氢生理盐水组各15只。脂多糖组、脂多糖+富氢生理盐水组腹腔内注射脂多糖10 mg/kg制备大鼠脓毒症模型。富氢生理盐水组、脂多糖+富氢生理盐水组治疗组在术后即刻、3 h、6 h、12 h、18 h,以5 mL/kg高浓度富氢生理盐水腹腔注射。空白组、脂多糖组给予等量生理盐水腹腔注射。取支气管肺泡灌洗液检测中性粒细胞计数,取肺组织检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活性,Western blot检测肺组织中核因子E-2-相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor-2,Nrf2）和血红素加氧酶1（hemeoxygenase-1,HO-1）的表达,比较组间差异。 结果与脂多糖组比较,脂多糖+富氢生理盐水组大鼠7 d平均生存时间延长（P＜0.05）;与空白组比较,脂多糖组中性粒细胞计数、MDA含量均明显升高,SOD、CAT、GSH-Px活性均下降（P＜0.05）,肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达上升（P＜0.05）;与脂多糖组比较,脂多糖+富氢生理盐水组中性粒细胞计数、MDA含量均减少,SOD、CAT、GSH-Px活性以及Nrf2和HO-1的蛋白表达均明显增加（P＜0.05）。 结论高浓度富氢生理盐水可延长脂多糖所致脓毒症大鼠平均生存时间,减少肺部炎症细胞、氧化应激,可能通过Nrf2/HO-1通路控制急性肺损伤。     

黄芪糖蛋白通过调控Nrf2/NQO1信号通路保护急性脊髓损伤大鼠模型神经功能

目的 探讨黄芪糖蛋白对急性脊髓损伤大鼠模型的神经保护功能及机制。方法 选取30只SD大鼠,随机分为3组:假手术组、模型组及观察组。观察黄芪糖蛋白对大鼠肢体运动功能的影响,检测各组大鼠脊髓组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)、醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase,NQO1)表达水平。结果 观察组、模型组大鼠运动功能评分低于假手术组(P＜0.05);观察组评分高于模型组(P＜0.05)。观察组、模型组大鼠TNF-α、MPO、IL-6水平高于假手术组(P＜0.05);观察组炎性因子水平低于模型组(P＜0.05)。观察组、模型组大鼠脊髓组织Nrf2、NQO1mRNA表达水平低于假手术组(P＜0.05);观察组表达水平高于模型组(P＜0.05)。模型组与观察组Nrf2、NQO1蛋白量降低;观察组高于模型组(P＜0.05)。结论 黄芪糖蛋白可通过上调脊髓组织Nrf2、NQO1表达水平发挥急性脊髓损伤大鼠神经保护功能。     

小剂量氟他胺对大鼠性分化影响的实验研究

目的探讨低剂量抗雄激素药物氟他胺对大鼠性分化的影响，以及氟他胺诱导建立SD大鼠尿道下裂动物模型的可行性。方法60只孕鼠，随机分为5个实验组及1个对照组，从孕12～17d连续6d实验组每天腹部皮下注射用生理盐水配制的氟他胺4882．8、5078．1、5273．4、5468．7、6250．0μg／kg，对照组注射同量生理盐水。于孕18d每组解剖两只孕鼠，提取子代雄性胎鼠尿生殖结节做病理切片，同时观察睾丸位置和前列腺发育情况。并于出生后第2、13、28d观察雄性仔鼠性分化与性发育的指标．结果氟他胺染毒组雄性子一代肛殖距各组均明显小于对照组（P〈0．05）；尿道下裂的发生率依次为29．00％、40．00％、63．68％、78．72％、100％；单侧隐睾发生率分别为4．23％、6．23％、9．23％、11．52％、16．28％；乳晕延迟退化率均为100％；各组前列腺不发育或发育不全。结论小剂量氟他胺能够引起大鼠的性分化与性发育异常；并能诱导出稳定、直观的尿道下裂动物模型。