邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯通过氧化应激、凋亡诱导大鼠尿道下裂

目的 探讨邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]诱导大鼠发生尿道下裂的发生机制.方法 20只成年孕SD大鼠[10 ～ 12周龄,体质量(240 ±20)g]按完全随机分为:玉米油对照组[750 mg/(kg·d),n=10]和DEHP暴露组[750 mg/(kg·d),n=10],于妊娠期(gestation day,GD)第8.5 ～18.5日每日灌胃,于GD19.5时剖宫取出胎鼠,以有无睾丸分辨雌雄,并在解剖显微镜下观察有无尿道下裂的发生,将DEHP暴露组有尿道下裂的列入尿道下裂组,以玉米油对照组雄性无尿道下裂的胎鼠作为正常对照组.测量雄鼠胎鼠的肛门生殖器距离(anogenital distance,AGD)和肛门生殖指数(anogenital index,AGI),扫描电镜和HE染色观察阴茎组织形态改变情况,高效液相色谱法检测胎鼠肝脏中的维生素A、E水平,Westem blot检测阴茎组织中氧化应激相关蛋白Nrf2、HO-1、SOD1、Gpx和凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax、Bcl2的表达水平,TUNEL法检测阴茎组织中的细胞凋亡.结果玉米油对照组胎鼠无尿道下裂发生,DEHP暴露组胎鼠出现尿道下裂,发生率为27.59％.与正常对照组相比,尿道下裂组AGD、AGI均明显降低(P＜0.05);尿道下裂胎鼠阴茎出现腹侧尿道皱褶融合障碍及尿道口开口异常;此外,尿道下裂胎鼠体内维生素A、E的水平明显降低(P＜0.05);阴茎组织中Nrf2、HO-1、Gpx、SOD1和Bcl2蛋白表达水平明显下降(P＜0.05),cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平则明显增高(P＜0.05),细胞凋亡显著增加(P＜0.05).结论DEHP诱导SD大鼠发生尿道下裂,可能与机体氧化应激失衡、Nrf2-HO-1信号通路被抑制后阴茎组织中细胞凋亡异常增加有关.     

邻苯二甲酸二(2-乙己基)酯导致隐睾症发生跨代遗传的机制研究

目的 探讨增塑剂邻苯二甲酸二(2-乙己基)酯(DEHP)于性腺发育的关键时期作用于孕鼠(0),研究F1-F3代隐睾跨代遗传的演变情况及各代睾丸基因组DNA甲基化转移酶水平的改变情况.方法 妊娠SD大鼠随机分为两组:正常对照组和DEHP实验组,实验组自妊娠第七天(GD7)到第十九天(GD19)持续经口予以DEHP 750 mg·kg-1 ·d-1灌胃,观察子代隐睾发生情况,雌鼠受孕率;记录大鼠体重和睾丸、附睾重量以及AGD值,观察精子数量和质量;观察连续三代大鼠睾丸组织形态的演变情况,检测DNA甲基化转移酶变化情况.结果 孕鼠在孕期(GD7-GD19)暴露于DEHP,第一代(F1)隐睾发生率为30％,第二代(F2)隐睾发生率为12.5％,第三代(F3)未见隐睾发生;交配实验F1代受孕率50％,F2代75％,F3代100％;HE染色发现F1代睾丸生精上皮明显萎缩,生精细胞少,F2代有所改善,F3代形态趋于正常.Real Time-PCR、免疫组化和Western Blot表明DNA甲基化转移酶的表达随着遗传代数的增加而上调,差异有统计学意义.结论 DEHP损伤大鼠雄性生殖功能,通过改变DNA甲基化转移酶的表达,继而导致基因组印记甲基化修饰模式改变并遗传给下一代,从而使子代雄性生殖系统发育的关键性印记基因作用失衡,并最终导致子代产生隐睾,可能是导致生殖系统损害的重要毒理机制之一.     

MiR-155-5p:在肾母细胞瘤中表达下调并抑制肾母细胞瘤细胞的增殖、迁移及促进细胞凋亡

目的 探讨miR-155-5p在肾母细胞瘤中的表达及其对肾母细胞瘤细胞增殖、迁移及凋亡能力的影响。方法 收集40例肾母细胞瘤患者的肿瘤组织及其相对应的瘤旁组织,瘤旁组织作为正常对照组,应用RTqPCR检测肾母细胞瘤组织和正常瘤旁肾脏组织中miR-155-5p的表达水平;在肾母细胞瘤细胞株G401中,运用脂质体转染技术过表达及抑制miR-155-5p;采用CCK-8实验检测肾母细胞瘤细胞增殖能力的变化;划痕实验检测肾母细胞瘤细胞迁移能力的变化;流式细胞术检测肾母细胞瘤细胞凋亡能力的变化。结果 RTqPCR结果显示肾母细胞瘤肿瘤组织中miR-155-5p的表达水平显著低于正常肾脏组织,且miR-155- 5p的表达与肾母细胞瘤的临床分期呈负相关,差异有统计学意义（P<0.05）;在人肾母细胞瘤细胞G401中上调miR-155-5p表达能够显著抑制肿瘤细胞的增殖和迁移,促进凋亡（P<0.05）;下调miR-155-5p表达能够显著促进肿瘤细胞的增殖和迁移,抑制凋亡（P<0.05）。结论 miR-155-5p在肾母细胞瘤患者肿瘤组织中表达显著下调,且其表达量与临床分期呈负相关;miR-155-5p可抑制肾母细胞瘤细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡;miR-155-5p有望成为肾母细胞瘤诊断、治疗和预后评估的一个新的潜在标志物。     

SV40T抗原基因介导尿源性干细胞永生化

目的 建立猿肾病毒40大T抗原(SV40Tag)永生化尿源性干细胞,为组织工程学及再生医学提供稳定的细胞来源.方法 利用脂质体(Lipofectamine2000)介导将含SV40Tag基因质粒pMPH-FRT-SV40T及转座酶质粒(transposase)共转染至临床分离的尿源性干细胞中.潮霉素(Hy-gromycin)筛选后阳性细胞克隆并连续传代,观察细胞形态学以及增殖情况,RT-PCR,免疫荧光等检测转染细胞的生物学特性,细胞裸鼠皮下注射检测其安全性.结果 筛选获得的阳性克隆扩大培养,即永生化尿源性干细胞(imrnorterlized urine derived stem cell,iUSC),增殖能力强,能连续传代培养.RT-PCR证实iUSC表达SV40Tag基因,而用翻转重组酶(Flippers recombination enzyme Flp)处理iUSC可敲除RFT-SV40Tag基因而逆转永生化.应用免疫荧光细胞化学技术检测该细胞株表达干细胞表面标志物CD73,CD44,CD90 (Thy-1),CD29 (Integrin),CD105 (Endoglin),CD166 (ALCAM),BMPR Ⅱ,SSEA4,CD117,CD133;BMP9可诱导其分化为成骨细胞,脂肪细胞,具备干细胞多向分化能力;转染细胞2×106个/点接种裸鼠,连续观察4周无肿瘤形成.结论 脂质体转染技术成功构建SV40Tag永生化尿源性干细胞,该细胞株仍具有干细胞增殖及多向分化潜能,为组织工程学及再生医学的体外研究和发展应用提供了安全稳定的细胞来源.     

Piwi互作RNA的筛选及其在儿童肾母细胞瘤组织中的表达

目的 探讨Piwi互作RNA（piRNA）在儿童肾母细胞瘤中的表达及临床意义。方法 对Piwi样蛋白2（Piwil2）基因重编程人成纤维细胞所形成的肿瘤样干细胞进行高通量测序,筛选出差异表达piRNA,并利用miRanda软件预测其靶基因,对靶基因进行基因本体（GO）功能分析。采用qRT-PCR检测差异表达piRNA及其靶基因在34例肾母细胞瘤患儿肿瘤组织及癌旁正常肾组织标本中的表达,并分析差异表达piRNA及其靶基因与肾母细胞瘤临床病理特征的关系。结果 通过高通量测序筛选出230个差异表达piRNA,利用miRanda软件预测出43个靶基因,经GO分析发现其参与的生物学过程主要为调节细胞钙离子浓度,分子功能主要为参与ATP酶的活动及多聚A尾RNA结合。选取5个未知的差异表达piRNA及其靶基因检测其在肾母细胞瘤肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达情况,结果显示第13位未知上调piRNA（NU13）表达量在肿瘤组织中下调（P<0.01）,其靶基因NOP56核糖核蛋白（NOP56）表达在肿瘤组织和癌旁正常组织中差异表达无统计学意义（P=0.58）;第9位未知上调piRNA（NU9）表达量在肿瘤组织中下调（P<0.01）,其靶基因40S核糖体蛋白S8（RPS8）基因在肿瘤组织和癌旁正常组织中差异表达无统计学意义（P=0.29）;第5、7、9位未知下调piRNA（ND5、ND7、ND9）及其共同靶基因MT-RNR2样蛋白1（MTRNR2L1）基因的表达量在肿瘤组织中均下调（P均<0.01）。以上在儿童肾母细胞瘤组织中出现差异表达的piRNA及其靶基因与患儿年龄、性别、肿瘤临床分期、病理分型无明显相关性（P均>0.05）。结论 piRNA NU9、NU13、ND5、ND7、ND9及靶基因MTRNR2L1在儿童肾母细胞瘤组织中出现差异表达,有望成为鉴别肾母细胞瘤与正常肾组织的标志物。     

肿瘤样干细胞来源的外泌体促进人脐带间充质干细胞的增殖和侵袭

目的探讨Piwil2诱导肿瘤干细胞（Piwil2-iCSC）来源的外泌体对人脐带间充质干细胞（hucMSCs）肿瘤样生物学行为的影 响。方法超速离心法提取Piwil2-iCSCs外泌体,透射电镜、粒径分析、Western blot及外泌体摄入实验检测外泌体形态、直径、标 志蛋白表达及作用途径。将hucMSCs 分为对照组、PBS干预组和外泌体干预组（Exo）,CCK-8、细胞划痕实验、Transwell 和 Western blot检测各组hucMSCs的增殖、迁移、侵袭能力以及基质金属蛋白酶（MMPs）MMP2和MMP9蛋白的表达水平。细胞 染色体核型分析检测经Piwil2-iCSCs外泌体长期干预的hucMSCs的染色体结构。结果透射电镜可见Piwil2-iCSCs外泌体大 小均匀,直径在50~100 nm,呈形态较规则的圆形或椭圆形囊泡状小体,粒径分析显示外泌体直径分布集中在在100~200 nm; Western blot显示外泌体标志性蛋白CD9、CD63和piwil2蛋白阳性表达;外泌体摄入实验表明外泌体进入细胞发挥作用。与对 照组和PBS干预组相比,Exo组细胞增殖数量明显增多（P<0.05）,划痕愈合速度加快（24 h,P<0.05;48 h,P<0.01）,侵袭细胞数目 显著增加（P<0.01）。经Piwil2-iCSCs外泌体干预后的hucMSCs细胞MMP2（P<0.05 vs PBS干预组,P<0.01 vs 对照组）、MMP9 蛋白水平表达增高（P<0.05）,但染色体核型仍是46XY,无异常。结论肿瘤样干细胞Piwil2-iCSC外泌体能促进hucMSCs的增 殖、迁移及侵袭,但是未出现肿瘤样异质性改变。     

经膀胱颈部分结扎建立膀胱输尿管返流性肾损害动物模型

  目的  建立一种膀胱出口梗阻导致的返流性肾损害动物模型。  方法  取6～8周龄雄性C57BL/6小鼠60只,随机划分为对照组、假手术组和膀胱颈部分结扎（PBOO）组,每组20只,PBOO组小鼠麻醉后开腹分离膀胱颈,用0.3 mm直径的金属棒引导部分结扎膀胱颈,假手术组仅开腹分离膀胱颈,不结扎,对照组不做处理。术后7 d,每组随机挑选12只存活的小鼠,观察膀胱、输尿管、肾盂和肾脏大体变化,行经膀胱逆行性尿路造影,取肾组织进行组织病理学分析,Western blot、免疫荧光和免疫组化分别检测波形蛋白、增殖细胞核抗原（PCNA）、α平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）表达水平。  结果  与对照组和假手术组相比,PBOO组小鼠膀胱、输尿管、肾盂明显扩张,膀胱输尿管返流明显,肾脏体积和质量增加（P<0.001）,肾实质变薄（P<0.000 1）;组织病理学检查可见肾小球萎缩,肾小管扩张,小管间质炎细胞浸润,肾小球基底膜增生,间质纤维化明显;Western blot、免疫荧光和免疫组化分别测得肾组织中波形蛋白、PCNA、α-SMA的表达水平均升高（P<0.000 1）。  结论  小鼠行PBOO术后,膀胱、输尿管、肾脏均发生明显形态改变,并出现返流性肾纤维化样损害,可以作为研究膀胱出口梗阻导致的肾纤维化病理改变机制及治疗措施的动物模型。     

儿童未成熟畸胎瘤临床诊治特点分析

目的探讨儿童未成熟畸胎瘤的临床及诊治特点。方法对我院2011年11月~2014年10月收治的25例小儿未成熟畸胎瘤临床资料进行回顾性分析。结果 25例未成熟畸胎瘤患儿均经手术治疗,除1例肝脏转移外,其余均未复发及死亡。结论小儿性腺内未成熟畸胎瘤起病隐匿,性腺外常症状明显,两者均应全面诊断、综合治疗,并做好远期随访监测,性腺外未成熟畸胎瘤应注重周围淋巴结清扫。     

邻苯二甲酸二乙酯诱导的大鼠尿道下裂与Mafb的表达相关:基于转录组测序结果

目的通过转录组测序筛选大鼠尿道发育过程中相关差异基因,并进行验证;探究邻苯二甲酸二乙酯（DEHP）诱导SD大鼠 尿道下裂的发生机制。方法40只成年SD孕鼠随机分成4组（n=10）,前两组予以空白对照处理,分别于妊娠期16 d（GD16组） 和GD19 d（GD19组）剖宫产取出雄性胎鼠,将收集好的胎鼠阴茎组织进行转录组测序,lllumina HiSeq 2000筛选出差异表达基 因（DEGs）,然后对DEGs进行差异基因功能（GO）和pathway显著富集性分析;选取其中的DEG（Mafb）进行免疫荧光验证。后 两组分别予以玉米油（对照组）和DEHP [750 mg/(kg·d)]（DEHP暴露组）于GD12 d至GD19 d每日灌胃处理,GD19 d剖宫产取 出雄性胎鼠,并判断有无尿道下裂的发生。扫描电镜和HE染色观察阴茎组织形态学改变,免疫荧光和Western blot检验阴茎组 织中Mafb、β-catenin的表达水平。结果GD19组胎鼠阴茎组织与GD16组胎鼠阴茎组织转录组测序结果示1360个DEGs（其中 上调797个,下调563个）,差异基因主要富集于细胞粘着斑信号通路、轴突导向信号通路、细胞外基质受体作用信号通路等,选 取DEG（Mafb）进行免疫荧光验证,发现Mafb的表达随发育显著增加,与测序结果相符。而DEHP暴露组胎鼠阴茎组织与对照 组胎鼠阴茎组织相比,Mafb、β-catenin表达水平显著下调（P<0.01）。结论随着大鼠阴茎组织的正常发育,Mafb的表达逐渐增 加;而DEHP暴露组较对照组Mafb、β-catenin表达显著下调,提示β-catenin信号通路影响Mafb表达可能与DEHP诱导大鼠尿道 下裂发生相关。     

雄激素受体干预对包皮成纤维细胞Mafb基因表达的影响

目的：探讨双氢睾酮（dihydrotestosterone,DHT）与氟他胺（flutamide,Flu）对Mafb基因表达的影响。方法：利用原代培养的正常儿童包皮成纤维细胞株,分别采取不同浓度DHT与Flu干预,通过RT-PCR、免疫细胞荧光和Western blot检测Mafb的转录表达情况。结果：在DHT浓度为3.0×10-8 mol/L与3.0×10-6 mol/L干预条件下,Mafb mRNA的表达量分别为0.372±0.003、0.594±0.045,与正常组（0.444±0.007）相比,DHT 3.0×10-6 mol/L组明显上调（P=0.005）,而DHT 3.0×10-8 mol/L组上调差异不明显（P=0.145）;Flu 15 μmol/L干预条件下,Mafb mRNA的表达量为0.221±0.013,与正常组相比,表达量明显下降（P=0.000）。细胞免疫荧光分析表明,与正常对照组相比（0.027±0.006）,DHT 3.0×10-8 mol/L组（0.046±0.004）、3.0×10-6 mol/L组（0.076±0.003）Mafb表达量明显上调（P=0.010,P=0.000）,而Flu组（0.006±0.002）明显下调（P=0.009）。同样Western blot结果显示,较对照组蛋白水平（0.163±0.001）相比,DHT 3.0×10-8 mol /L组（0.146±0.001）上调无统计学差异（P=0.960）,DHT 3.0×10-6 mol/L组（0.598±0.087）Mafb表达量上调差异有统计学意义（P=0.000）,而Flu组（0.066±0.002）明显下调（P=0.040）。结论：在体外培养包皮成纤维细胞株中,Mafb基因的表达受DHT和Flu的调控。Mafb作为雄激素受体下游调控蛋白,可能是雄激素受体信号通路促进尿道发育的重要机制。