GLUT4和脂联素在3T3-L1脂肪细胞中共享囊泡转运机制

目的 观察葡萄糖转运蛋白GLUT4和脂联素在3T3-L1细胞中的亚细胞分布。方法 诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,比较细胞分化前后GLUT4和脂联素的表达情况;通过蔗糖密度梯度离心比较GLUT4囊泡和脂联素囊泡的密度;采用结构照明超高分辨率显微镜（3D-SIM）观察GLUT4和脂联素在3T3-L1脂肪细胞内的分布情况。结果 3T3-L1前脂肪细胞呈梭形,胞质内无脂滴,细胞分化成熟后呈圆形,胞质内含有大量脂滴;GLUT4和脂联素在3T3-L1前脂肪细胞中不表达,在分化成熟的脂肪细胞中高表达;GLUT4囊泡和脂联素囊泡具有相似的密度;GLUT4和脂联素在细胞中共定位。结论 GLUT4和脂联素在3T3-L1脂肪细胞中分布于相似的细胞囊泡结构,共享转运机制。     

CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响

【立论依据】 AMPK是细胞及整体能量稳态的调控器。代谢综合征状态下,机体组织广泛存在AMPK活性下降,但AMPK如何失活仍存许多疑问。因此,弄清楚AMPK的失活机制对阐明代谢综合征的发病机制具有重要意义。 【设计思路】 有研究表明CDK5在肥胖小鼠脂肪组织中异常激活,AMPKα2的活性显著降低。同时,AMPKα2 345和529位丝氨酸满足Cdk5的底物一般都具有特定S/TPXK/R序列的条件。据此推测:活化的CDK5能够磷酸化AMPKα2 345和529位丝氨酸,进而抑制AMPKα2的活性,参与代谢综合征的发病。本课题拟在3T3-L1前脂肪细胞上研究Cdk5介导的AMPKα2蛋白磷酸化的作用,为代谢综合征和糖尿病的治疗提供新的思路。 【实验内容】 应用lipofectamine2000转染技术构建Cdk5 siRNA基因的脂肪细胞系3T3-L1-Cdk5 siRNA实验组及其阴性对照组细胞系3T-L1- Mock siRNA(Mock siRNA 为空siRNA转染),实验分为3T3-L1-Cdk5 siRNA组,3T-L1- Mock siRNA 组和3T-L1组,以AIMV无血清培养基培养3T3-L1细胞,使其自然增殖,于增殖第3天起用TNF-α作用于增殖中的3T3-L1细胞,之后每24小时以MTT法观察细胞增殖情况;采用含胰岛素、地塞米松与IBMX的分化培养基诱导分化3T3-L1细胞,于诱导分化第8天起用TNF-α作用于分化中的3T3-L1细胞,此后每3天以油红O染色并染料提取的半定量方法及细胞内甘油三酯测定的方法了解细胞内脂质含量;采用细胞Cdk5/P35和AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒检测3T3-L1细胞中Cdk5和AMPKα2的活性,蛋白质印迹的方法检测3T3-L1细胞AMPKα2 ^S345 、AMPKα2 ^S529及AMPKα2^S345、⁵²⁹磷酸化水平。从而观察CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响。 【材料】 3T3-L1前脂肪细胞,AIM-V medium,DMEM/F12 培养基,Cdk5 siRNA, AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒,油红O, CO2细胞恒温培养箱。 【可行性】 Cdk5是脯氨酸引导的丝/苏氨酸蛋白酶,特异性磷酸化其底物蛋白的丝氨酸和苏氨酸位点。其磷酸化底物一般都有特定的S/TPXK/R序列。而人、大鼠和小鼠AMPKα2蛋白序列的自动抑制区345位丝氨酸和亚单元结合区域529位丝氨酸有共同的序列YLASSPPSGS 和TGSTLSSVSP,满足Cdk5的底物一般都具有特定的S/TPXK/R序列的条件,实验假设理论上具有可行性。 【创新性】 本课题以Cdk5介导AMPKα2磷酸化进而抑制其活性为切入点,探讨对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响,具有一定的创新性。     

穹窿主体蛋白通过上调干扰素调节因子2抑制动脉内皮细胞凋亡

目的：探究穹窿主体蛋白（major vault protein,MVP）对动脉内皮细胞（endothelial cell,EC）增殖的作用,揭示MVP对动脉EC发挥保护作用的潜在机制。方法：以人主动脉EC（human aortic EC,HAEC）为细胞模型,感染慢病毒以抑制或过表达 MVP。使用CCK-8实验和流式细胞术检测细胞增殖活性和死亡。使用凋亡抑制剂Z-VAD和坏死性凋亡抑制剂Nec-1确定细胞死亡方式。以流式细胞术检测Annexin V结合阳性率和Caspase 3活性,以Western blot检测Caspase剪切体蛋白表达以评价细胞凋亡。以荧光定量PCR和Western blot 技术鉴定靶分子,并明确MVP与靶分子之间的调控关系。结果：敲降MVP抑制 HAEC增殖,促进HAEC死亡,过表达MVP结果则相反。Z-VAD逆转MVP敲降引起的死亡,而Nec-1无此作用。过表达MVP抑制TNF-α诱导的HAEC凋亡,敲降MVP时作用相反。MVP通过上调干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2,IRF2）促进凋亡抑制蛋白1（cellular inhibitor of apoptosis protein 1,cIAP1）的转录。敲降IRF2逆转MVP过表达引起的cIAP1表达增多和凋亡抑制。结论：MVP通过上调IRF2蛋白促进cIAP1转录表达从而抑制TNF-α诱导的HAEC凋亡,发挥对EC的保护作用。     

棕榈酰化转移酶9调控非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭及相关机制研究

目的：探讨棕榈酰化转移酶 9（zinc finger DHHC-type containing 9,ZDHHC9）在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中的表达及预后,及ZDHHC9对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及作用机制。方法：通过NCBI GEC 数据库和基于基因表达水平值的交互式分析平台（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA）数据库分析ZDHHC9在 NSCLC中的表达及其与患者预后之间的关系。利用实时定量 PCR（Real-time qPCR）检测正常支气管上皮细胞系（16HBE）及 NSCLC细胞系（A549、H1299、H1703）的表达情况。在H1703和A549细胞系中敲降ZDHHC9,利用CCK-8实验检测细胞增殖能力,Transwell和划痕实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western blot检测相关蛋白水平变化。结果：GEO和GEPIA数据库生物信息技术分析结果显示,ZDHHC9 在 NSCLC 组织中较癌旁组织显著升高,并且 ZDHHC9 表达量与患者的无病生存率相关（P < 0.01）。敲降 ZDHHC9 后,H1703 和 A549 细胞增殖活力显著下降,同时侵袭和迁移能力受到抑制,并且敲降 ZDHHC9 降低 NSCLC细胞脂肪酸合成关键酶的表达水平。结论：ZDHHC9可能通过调控NSCLC细胞脂肪酸合成促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。     

Coronin3促进食管癌Eca-109细胞的迁移和侵袭

目的 探讨Coronin3基因促进食管癌Eca-109细胞株迁移和侵袭的可能机制。方法 用慢病毒稳转的方式构建过表达和敲减Coronin3的Eca-109食管癌细胞株,通过划痕和Transwell实验分别检测Coronin3基因对Eca-109食管癌细胞的迁移和侵袭的影响。Western blot法实验检测Coronin3对CDH11及E-cadherin、N-cadherin等EMT标志分子蛋白表达的影响。实时荧光定量PCR实验检测Coronin3对CDH11及E-cadherin、N-cadherin等EMT标志分子mRNA表达的影响。结果 笔者成功构建了Coronin3过表达和敲减的Eca-109细胞株。Coronin3过表达能够促进细胞迁移和侵袭。与之相反,Coronin3敲减能够显著抑制细胞迁移和侵袭。Coronin3过表达能够提高CDH11的蛋白和mRNA水平,提高α-SMA、N-cadherin的蛋白和mRNA水平,降低E-cadherin的蛋白和mRNA水平。与之相反,Coronin3敲减能显著降低CDH11的蛋白和mRNA水平,降低α-SMA、N-cadherin的蛋白和mRNA水平,提高E-cadherin的蛋白和mRNA水平。结论 Coronin3可以通过促进上皮-间质转换（EMT）来调控食管癌的转移和侵袭,为治疗食管癌提供了潜在的新靶标。     

KCTD15基因调控3T3-L1脂肪前体细胞分化的研究

目的 探讨含钾通道四聚化结构域15(KCTD15)基因在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中的作用.方法 ①采用半定量逆转录PCR检测在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中KCTD15 mRNA表达变化.②在3T3-L1脂肪前体细胞增殖早期通过RNA干扰技术靶向敲低KCTD15基因的表达,在靶向敲低KCTD15基因后的转染KCTD15 siRNA 48 h后通过半定量逆转录PCR验证KCTD15基因的敲低效果.用油红O染色法观察KCTD15敲低后3T3-L1细胞第0天和第10天的细胞形态学改变.③采用半定量逆转录PCR检测KCTD15基因敲低后PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ成脂基因的变化.结果 在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中,KCTD15 mRNA表达水平逐渐降低(P＜0.05);KCTD15敲低能显著抑制3T3-L1脂肪前体细胞分化;KCTD15敲低后PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ成脂基因无明显变化.结论 在分化早期阶段敲低KCTD15基因能抑制3T3-L1脂肪前体细胞分化.     

硫酸软硫骨素对3T3-L1细胞增殖和分化的影响

目的 研究硫酸软骨素对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响,并对其机制进行初步探讨.方法 噻唑蓝法观察0、5、10、25、50、100、200 mg/L浓度的硫酸软骨素对3T3-L1细胞增殖能力的影响;3T3-L1细胞由3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素和地塞米松联合诱导分化,实验组加入硫酸软骨素干预,诱导分化第8天油红O染色观察脂肪细胞分化程度;荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4) mRNA表达水平;Western blot检测脂肪细胞分化过程中PPARγ、C/EBPα和Smad3蛋白表达.结果 硫酸软骨素对3T3-L1细胞的促增殖作用呈剂量和时间相关性,其中25 mg/L的硫酸软骨素作用24 h后对3T3-L1细胞的促增殖作用最大.硫酸软骨素能够抑制3T3-L1细胞成脂分化,减少脂滴聚集.并且硫酸软骨素能够下调PPARγ、C/EBPα和FABP4 mRNA,抑制PPARγ和C/EBPα、上调Smad3蛋白表达水平.结论 在适当浓度范围内硫酸软骨素具有促进3T3-L1细胞增殖作用,并通过激活Smad3、下调PPARγ和C/EBPα抑制成脂.     

慢病毒介导不同启动子嵌合抗原受体CD19在T细胞中的表达

目的 高效包装含绿色荧光蛋白（GFP）的嵌合性抗原受体CD19重组慢病毒载体,对比不同启动子在T细胞中绿色荧光蛋白的表达效率。方法 构建3种不同启动子及CD19-CAR的质粒pHAGE-CMV-EF1α-GFP-CD19、pHAGE-CMV-GFP-CD19、pHAGE-EF1α-GFP-CD19,转染293T细胞,镜下观察转染的细胞状态,72h后收集上清,PCR定量病毒载体RNA核酸拷贝数,通过流式细胞术以及Western blot法测定单、双启动子启动GFP及CD3ζ的表达情况;慢病毒液分别转染T淋巴细胞后,通过荧光显微镜检测慢病毒转染效果,Western blot法测定蛋白的表达水平。结果 荧光显微镜观察：以293T细胞为靶细胞时,启动子由强到弱依次为CMV-EF1α > CMV > EF1α,流式结果显示,在293T细胞中的转导率分别为72.4%、20.6%、14.5%;Western blot法检测结果显示,在T细胞中启动子表达强弱为CMV-EF1α > EF1α > CMV。结论 在以重组慢病毒为载体的基因研究过程中,为了提高病毒在感染细胞的转染率,需要正确选择启动子以及相应的靶细胞。     

CRIF1参与高糖诱导的rRNA基因转录

目的 探索CRIF1在高糖诱导下对rRNA基因转录中的作用。方法 在HEK293T细胞中,转染CRIF1表达载体或空载对照,培养48h后收取细胞提取总RNA,通过RT-qPCR检测pre-rRNA的mRNA水平;用含0、1、4.5g/L糖浓度的培养基培养HEK293T细胞12h后,收集全细胞提取物,进行Western blot法检测CRIF1蛋白的表达水平;在HEK293T细胞中转染shCRIF1干扰质粒或空载对照,36h后换用含0、1、4.5g/L糖浓度的培养基继续培养细胞12h后,收取细胞提取总RNA,通过RT-qPCR检测pre-rRNA的水平。结果 CRIF1可促进pre-rRNA的表达;随着糖浓度的升高,CRIF1的表达量逐渐增加;敲低CRIF1可抑制糖浓度依赖的pre-rRNA的表达。结论 CRIF1可提高高糖诱导下pre-rRNA的表达水平,从而参与高糖诱导的rRNA基因的转录调控。     

METTL3介导的m6A修饰在结直肠癌奥沙利铂耐药中的作用研究

目的 探究N⁶-甲基腺嘌呤（N⁶-methyladenosine，m⁶A）调控因子甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase-like 3，METTL3）在结直肠癌奥沙利铂（oxaliplatin，OXA）耐药中的作用。方法 采用浓度梯度法构建OXA耐药细胞株HCT116/OXA，CCK-8分析其耐药性；采用Dot blot及m⁶A RNA甲基化定量ELISA实验检测细胞RNA m⁶A水平，RNA-seq及qRT-PCR筛选差异m⁶A调控因子，Western blot验证METTL3表达水平；利用腺病毒感染技术在HCT116细胞过表达METTL3，CCK-8检测各组细胞的增殖活性；通过对GEO数据库中HCT116细胞敲除METTL3的MeRIP-seq和RNA-seq数据与耐药细胞RNA-seq联合分析，筛选耐药相关的METTL3介导m⁶A修饰调控的下游靶基因及信号通路；TCGA数据库分析METTL3与患者预后的相关性。结果 HCT116/OXA细胞对OXA的耐药性明显高于其亲代细胞（P<0.01）；与HCT116相比，耐药细胞的RNA m⁶A水平异常上调（P<0.01），且伴随METTL3的mRNA和蛋白水平升高；过表达METTL3明显增强HCT116细胞对OXA的耐药性（P<0.01）；多组学数据联合分析筛选的METTL3介导m⁶A修饰调控的与耐药相关的关键基因主要富集在ABC转运蛋白、干细胞多能性调节信号通路、TGF-β信号通路等；METTL3高表达与结直肠癌患者的不良预后明显相关（P<0.01）。结论 METTL3介导的m⁶A修饰可能通过调节ABC转运蛋白、调节干细胞多能性的信号通路、TGF-β信号通路等经典耐药信号通路促进结直肠癌OXA耐药。     

生存素对3T3-L1脂肪细胞中载脂蛋白E表达和分泌的影响

目的: 探讨生存素（Survivin）对3T3-L1脂肪细胞中载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）表达和分泌的影响。方法: 构建Survivin过表达慢病毒载体及其对照载体，分别感染3T3-L1前脂肪细胞并进行分化培养。在分化第8天对细胞进行转录组分析。采用实时定量PCR检测3T3-L1脂肪细胞中ApoE mRNA的表达，蛋白质印迹法检测胞内及分泌的APOE蛋白表达水平。结果： 建立了稳定过表达Survivin的3T3-L1前脂肪细胞株，分化培养至第8天，过表达Survivin不影响脂肪细胞分化。转录组分析结果显示ApoE具有较高表达丰度，并且载脂蛋白家族中只有ApoE发生明显下调。Survivin过表达组细胞ApoE mRNA水平（t=9.676，P<0.01）以及蛋白水平（t=4.183，P<0.05）均显著低于对照组，并且细胞培养上清液中APOE分泌蛋白的表达水平同样显著低于对照组（t=5.683，P<0.01）。结论： Survivin在3T3-L1脂肪细胞中过表达时，能够在转录以及蛋白水平特异性下调3T3-L1脂肪细胞ApoE的表达。     

CXCR1调控STAT3信号通路对结肠癌细胞增殖凋亡的影响

目的 探讨化学趋化因子受体1（CXCR1）对结肠癌细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 收集结肠癌组织和对应的癌旁组织,提取组织蛋白,Western blot法检测组织中CXCR1表达水平。以人结肠癌细胞HCT116为研究对象,细胞转染CXCR1小干扰RNA（CXCR1 siRNA组）,同时转染siRNA对照组。设置对照组,对照组中只加入转染试剂。培养48h后,Western blot法检测细胞中CXCR1、Bcl-2、Bax、STAT3、p-STAT3表达水平,MTT检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。人结肠癌细胞与STAT3信号通路抑制剂AG490作用后,检测细胞增殖凋亡情况。结果 CXCR1在结肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织（P<0.01）。CXCR1 siRNA组细胞中CXCR1、p-STAT3、Bcl-2蛋白水平和细胞存活率明显低于对照组（P<0.01）。CXCR1 siRNA组细胞中Bax水平和细胞凋亡率明显高于对照组（P<0.01）。siRNA对照组细胞中CXCR1、Bcl-2、Bax、STAT3、p-STAT3水平和细胞凋亡率、细胞存活率与对照组比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。抑制剂作用后的细胞增殖凋亡趋势与CXCR1 siRNA组细胞相一致。结论 CXCR1在结肠癌组织中表达上调。抑制CXCR1的表达可以抑制结肠癌细胞增殖,促进结肠癌细胞凋亡,作用机制与STAT3信号通路有关。     

hsa_circ_0005389在新生儿急性呼吸窘迫综合征细胞炎症模型中的作用研究

目的：基于人环状RNA（circular RNA,circRNA）高通量测序和生物信息学分析结果,研究hsa_circ_0005389与新生儿急性呼吸窘迫综合征（neonatal acute respiratory distress syndrome,NARDS）的关系,以期为NARDS的诊断和治疗提供新的方向。方法：建立脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导急性肺损伤细胞模型。通过 RT-qPCR及Western blot检测炎性标志物及相关通路指标在阴性对照组和敲低 hsa_circ_0005389 表达的干预组中的表达变化情况,同时用CCK-8与流式细胞仪检测正常 A549细胞与建立急性肺损伤模型的 A549 细胞敲低或者过表达 hsa_circ_0005389后的增殖与凋亡情况。结果：RT-qPCR及 Western blot结果显示,A549 细胞暴露于10 μg/cm² LPS 48 h时,各炎性标志物及相关通路指标高表达（P < 0.05）。与阴性对照组相比,敲低 hsa_circ_0005389 表达后,A549 细胞中可溶性肿瘤坏死因子受体 1（soluble tumor necrosis factor receptor 1, sTNFR1）mRNA 相对表达量和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）蛋白表达量显著降低（P < 0.05）;在急性肺损伤模型中,敲低hsa_circ_0005389表达后,各炎性标志物及相关通路指标mRNA相对表达量均下降（P < 0.001）。CCK-8与流式细胞仪检测结果显示,与阴性对照组相比,敲低hsa_circ_0005389表达的A549 细胞增殖加快,凋亡率降低（P < 0.05）,而过表达 hsa_circ_0005389后A549细胞增殖减慢,凋亡率增加（P < 0.05）。结论：急性肺损伤细胞模型中,hsa_circ_0005389促进肺损伤炎性标志物的表达,并且影响肺上皮细胞的增殖和凋亡,提示hsa_circ_0005389 参与NARDS的炎症过程,可能是NARDS潜在的干预靶标。     

大鼠AQP7基因重组腺病毒载体的构建及其在3T3-L1脂肪细胞中的表达

目的:构建携带大鼠AQP7基因的腺病毒载体,并检测其在3T3-L1脂肪细胞中的表达。方法:采用RT-PCR方法,从大鼠脂肪组织中扩增克隆大鼠AQP7基因,插入到穿梭质粒中获得重组质粒pDC316-AQP7。PCR、酶切鉴定后,重组穿梭质粒和骨架质粒经脂质体2000转染293细胞出毒产生重组腺病毒。经PCR进行鉴定,转染293细胞扩增并纯化,半数组织培养感染剂量(TCID 50)方法测定腺病毒滴度。体外转染分化成熟的3T3-L1细胞,用Western blot方法检测AQP7的表达水平。结果:PCR、酶切及测序证实重组穿梭质粒构建正确。同时成功构建AQP7重组腺病毒,并制备出高滴度的病毒保存液,可以有效转染3T3-L1细胞。结论:成功构建了含大鼠AQP7基因的重组腺病毒载体且其可以在3T3-L1细胞中有效表达,为今后更好地研究AQP7在肥胖发生发展过程中的调控机制奠定了基础。     

3T3-L1前脂肪细胞分化过程中自噬的发生与线粒体数目的改变

目的:探索3T3-L1前脂肪细胞分化过程中自噬的发生与线粒体数目改变的关系?方法:培养3T3-L1前脂肪细胞,利用电子显微镜技术观察细胞分化过程中自噬小泡的形成与变化?线粒体数目的改变,同时运用Western blot检测NRF1?mtTFA的表达?结果:电镜结果显示:在3T3-L1 前脂肪细胞分化过程中,自噬小泡出现在细胞分化的第2天,随后迅速增加,第4天自噬小泡的面积达到最大,第6天开始消失;线粒体数目在分化第2天显著下降,第4天开始逐渐增加,到第6天超过分化前的水平并在第8天恢复;在分化过程中的自噬小泡内,有被吞噬的线粒体?Western blot结果则显示调控线粒体合成的转录因子NRF1?mtTFA的表达在分化第2天显著下降,第4天迅速升高,至分化末期再次下降?结论:3T3-L1前脂肪细胞分化过程的早中期形成了大量的自噬小泡,包括一些线粒体自噬,这些线粒体自噬的发生可能是分化早期线粒体数目减少的原因之一?     

11β－羟化类固醇脱氢酶1促进3T3-L1前脂肪细胞分化

目的:应用3T3-L1细胞模型研究11β-羟化类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)与前脂肪细胞分化的关系,探讨11β-HSD1在前脂肪细胞分化及肥胖中的作用.方法:构建11β-HSD1-SiRNA表达质粒pGCsi1encerTMH1/TetO1-11β-HSD1并稳定转染3T3-L1细胞,采用油红染色观察脂滴堆积情况,采用Western blot方法检测11β-HSD1在正常3T3-L1细胞分化过程中的表达;并用Real-time PCR检测脂肪细胞分化相关标志基因的变化,阐明11β-HSD1对前脂肪细胞成脂分化的影响.结果:正常3T3-L1前脂肪细胞在上述三联诱导分化后脂滴堆积随着分化过程逐渐增加;在pGCsilencerTMH1/TetO1-11β-HSD1转染的3T3-L1诱导分化过程中可见脂滴堆积的减少.在3T3-L1前脂肪细胞分化模型中(days 0,2,4,6,8),11β-HSD1蛋白水平是上调的.3T3-L1前脂肪细胞分化模型中GR在分化模型早期(D4及D6)是上调的,但是在分化后期(D8)很快又下降.在正常3T3-L1前脂肪细胞分化早期LPL上调,随着分化后期FAS、PPARγ等明显上升,Pref-1作为脂肪细胞分化抑制因子,在分化早期升高,在分化后期明显下调.在pGCsilencerTM H1/TetO1-11β-HSD1转染后的3T3-L1细胞分化模型中上述有关标志基因发生变化.结论:11β-HSD1作为受体前调节剂促进前脂肪细胞分化,与肥胖和胰岛素抵抗相关.     

RGFP966通过PI3K/AKT通路抑制胃癌细胞增殖

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶3特异性抑制剂RGFP966对胃癌细胞增殖能力和细胞周期的影响及其作用机制。方法：采用CCK-8法检测RGFP966处理MKN-45和MGC-803细胞后各组细胞的活力；细胞克隆形成实验检测RGFP966对胃癌细胞集落形成能力的影响；流式细胞术检测细胞周期；Western blot 实验检测细胞增殖和周期相关蛋白 Ki-67、c-Myc、Cyclin A2、Cyclin D1以及PI3K/AKT 信号通路相关蛋白的表达情况。结果：与对照组相比，RGFP966可显著抑制胃癌细胞MKN-45 和MGC-803的增殖能力、集落形成能力。与对照组相比，流式细胞术显示RGFP966诱导胃癌细胞阻滞在G0/G1期。与对照组相比，RGFP966处理后细胞增殖和周期相关蛋白Ki-67、c-Myc、Cyclin A2、Cyclin D1表达均下降，RGFP966可显著降低PI3K和 AKT的磷酸化水平。结论：RGFP966抑制胃癌细胞的增殖能力并诱导胃癌细胞阻滞在G0/G1期，其作用机制可能与RGFP966 抑制PI3K/AKT信号通路有关。     

Drp1缺失通过ABCB10激活线粒体未折叠蛋白反应

目的：在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)中探讨动力相关蛋白1(dynamin related protein 1, Drp1)基因缺失激活线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein reaction,mtUPR)的分子机制。方法：采用不同浓度 (0、2.5、5.0、10.0mmol/L)3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NP)处理Drp1敲除或敲低的MEF细胞、Drp1抑制剂Mdivi-1或选择性阻断Drp1与下游蛋白相互作用的小分子多肽P110处理的MEF细胞以及相应对照,随后进行Western blot检测CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)、ATP 结合盒 B 亚家族成员 10(ATP binding cassette subfamily B member 10,ABCB10)、Lon肽酶1(Lon peptidase 1,LONP1)以及热休克蛋白60(heat shock protein 60,Hsp60) 的表达。RT-qPCR 检测Drp1敲低或Mdivi-1处理后MEF细胞的ABCB10的mRNA水平。同时敲低Drp1和ABCB10,Western blot检测CHOP蛋白的表达,试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量,流式细胞术检测线粒体活性氧和线粒体膜电位水平。结果：3-NP处理后,Drp1敲除或敲低的MEF细胞以及Mdivi-1或P110处理的MEF细胞中CHOP表达呈现倍数上调。Drp1敲除或敲低的MEF细胞以及Mdivi-1或P110处理的MEF细胞中ABCB10蛋白表达上调,mtUPR效应蛋白LONP1和 Hsp60表达上调。Drp1敲低的MEF细胞和Mdivi-1处理的MEF细胞中ABCB10 mRNA水平上调。同时敲低Drp1和ABCB10后, 与Drp1敲低组相比,CHOP表达下调,LDH含量降低,线粒体活性氧水平降低,线粒体膜电位水平增加。结论：在MEF细胞中, Drp1表达下调可引起ABCB10表达量增加,导致mtUPR关键蛋白CHOP、LONP1和Hsp60蛋白表达上调,进而激活mtUPR。     

Aβ通过Ash1l上调H3K4二甲基化水平抑制BDNF表达并介导海马神经元损伤

目的 在Aβ处理海马神经元后,观测H3K4甲基化水平的变化,以及BDNF表达和神经元死亡的改变。方法 在Aβ处理后,用蛋白免疫印迹以及染色质免疫共沉淀方法检测神经元中总H3K4甲基化水平和BDNF启动子H3K4甲基化水平。在siRNA敲减Ash1l后,通过荧光定量PCR和酶联免疫吸附的方法检测BDNF表达。同时,使用MTT实验检测敲减Ash1l后Aβ诱导海马神经元损伤的改变。结果 在Aβ处理海马神经元后,BDNF启动子和总H3K4甲基化水平均显著上升,而敲减Ash1l可以阻止这一现象。另外,在敲减Ash1l后,Aβ诱导的BDNF表达下调被抑制,同时海马神经元损伤也得到缓解。结论 Ash1l蛋白被发现可以在Aβ多肽下游调节BDNF启动子区的H3K4Me2水平,通过抑制BDNF的表达促进神经元的死亡。     

内脂素基因在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化

目的观察3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程的不同时段内脂素基因表达水平的变化,探讨内脂素基因与脂肪细胞分化、脂质积聚之间的关系。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在该细胞生长至完全汇合（con-fluent）后2d,采用经典的鸡尾酒方法诱导其分化,并于诱导分化过程中用油红O染色鉴定脂肪细胞分化情况,采用RT-PCR和Western blot技术检测内脂素基因表达的变化规律。结果油红O染色显示,细胞内脂滴逐渐增大、增多,至分化末期占视野90%以上。内脂素基因在诱导分化初期不表达,分化第2天开始表达,分化第4~8天表达显著上调,分化至第10~12天,内脂素基因表达保持在较高水平并趋于稳定。其中,诱导分化后第6~12天较分化第0天显著升高（P〈0.05）,诱导分化第10~12天较第2~6天显著升高,诱导分化第12天较第6~8天显著升高（P〈0.05）。Western blot方法检测结果显示,随细胞分化成熟内脂素蛋白表达水平逐渐升高。结论内脂素基因与脂肪细胞分化和脂质积聚有密切的关系。