缺氧对人牙周膜细胞OPG和RANKL 基因表达的影响

目的：研究缺氧对人牙周膜细胞骨保护素（OPG）和核因子κb受体活化因子配体（RANKL）基因表达的影响,揭示缺氧在正畸牙移动压力侧骨吸收中的作用。方法采取酶消化法结合组织块法培养人牙周膜细胞。取3～5代细胞,分别在常氧（O2浓度为20％,对照组）和缺氧（O2浓度为2％）状态下培养3、6、12、24 h ,采用RT‐PCR检测OPG、RANKL mRNA的表达情况。采用SPSS15．0软件包,对RT‐PCR数据进行单因素方差分析。结果在培养3、6 h时,缺氧组和对照组OPG、RANKL mR‐NA的表达水平比较差异无统计学意义（P＞0．05）;在培养12、24 h时,缺氧组OPG mRNA 表达水平低于常氧组,而缺氧组RANKL mRNA的表达水平高于常氧组,缺氧组RANKL／OPG的比值较常氧组升高,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论缺氧可以影响人牙周膜细胞OPG、RANKL mRNA的表达,在正畸牙移动压力侧骨吸收中起促进作用。     

肾小管上皮细胞对成骨细胞骨代谢相关基因表达的体外调节

目的观察近端肾小管上皮细胞对成骨细胞骨代谢相关基因表达的直接调节作用。方法体外分离培养大鼠近端肾小管上皮细胞与头盖骨成骨细胞;用甲状旁腺激素（PTH）、137^Cs-γ线及25（OH）D3预作用前者,再与后者分为4组共培养：①单培养组（成骨细胞单培养）、②共培养组（肾小管上皮细胞与成骨细胞共培养）、③刺激共培养组（肾小管上皮细胞经PTH＋25（OH）D3处理,再与成骨细胞共培养）、④抑制共培养组（肾小管上皮细胞经137^Cs-γ线照射＋25（OH）D3处理,再与成骨细胞共培养）;并用RT-PCR方法检测共培养体系中成骨细胞的BGP、ALP、ColI、RANKL与OPG mRNA表达。结果共培养组成骨细胞的骨形成相关基因BGP、ALP、Col I mRNA表达较单培养组显著降低（P〈0．001）;刺激共培养组各基因表达较共培养组显著上升（P〈0．05-P〈0．001）;抑制共培养组ALP表达水平较共培养组显著降低（P〈0．001）,BGP与Col I mRNA表达无显著变化。共培养组与单培养组比较,RANKL与OPC;mRNA表达显著降低（P〈0．001）,但RANKL／OPG比值显著高于后者（P〈0．01）;刺激共培养组与共培养组比较,OPG mRNA表达明显上调（P〈0．01）, RANKL mRNA表达变化无显著意义。RANKL／OPG比值显著降低（P〈0．05）;抑制共培养组与共培养组比较, OPG表达显著下降（P〈0．01）,RANKL/OPG比值则显著增高（P〈0．01）。结论培养的近端肾小管上皮细胞对成骨细胞骨代谢相关基因表达具有直接的调节作用。建立的共培养体系可用于骨代谢相关药物筛选及作用机制研究。     

TRAF6敲低对低氧状态下IL⁃17调控人牙周膜成纤维细胞表达OPG及RANKL的影响

目的：探讨敲低肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor?associated factor 6,TRAF6）对人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）在低氧状态经白介素17（interleukin 17,IL?17）刺激表达骨保护素（osteoprotegerin,OPG）及核因子κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor?κB ligand,RANKL）的影响。方法：将hPDLCs细胞设为常氧加IL?17组、低氧加IL?17组以及单纯低氧组,每组内分为阴性对照组（TRAF6?NC组）和干扰组（TRAF6?shRNA组）。将靶向TRAF6基因的shRNA慢病毒载体（TRAF6?shRNA）感染hPDLCs,通过倒置显微镜观察病毒感染效率并用RT?PCR方法验证,用Western blot及RT?PCR方法检测分析hPDLCs低氧诱导因子（hypoxia inducible factor?1,HIF?1）、OPG及RANKL的表达变化。结果：低氧加IL?17组RANKL与OPG蛋白相对表达量的比值RANKL/OPG高于常氧加IL?17组及低氧组。在低氧加IL?17条件下,与TRAF6?NC组相比,TRAF6?shRNA组RANKL表达减少,RANKL与OPG相对表达量的比值RANKL/OPG减少。结论：TRAF6参与低氧状态下IL?17刺激hPDLCs表达骨吸收分子的调控,敲低TRAF6可使低氧状态下IL?17诱导的hPDLCs表达骨吸收分子减少。     

RNA干扰骨髓基质细胞和/或骨髓瘤细胞APE1表达对共培养骨髓瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)及骨髓瘤细胞株U266 APE1表达对共培养的U266细胞增殖、凋亡的影响.方法 将构建的APE1 siRNA表达载体分别导入BMSCs及U266细胞中.Western blot法检测2种细胞中APE1蛋白表达;2株细胞经APE1 siRNA处理后采用Transwell插入式培养皿构建BMSCs与骨髓瘤细胞共培养模型,采用MTT法、Annexin V-PE/7-AAD双染法、RT-PCR分别检测U266细胞增殖、凋亡及细胞中IL-6/IL-8 mRNA表达水平.结果 APE1 siRNA 可明显降低BMSCs及U266细胞APE1蛋白表达,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01);在APE1 siRNA同时处理BMSCs和U266细胞后的共培养体系中,U266细胞增殖抑制及细胞凋亡明显高于单一细胞APE1敲低组及APE1 siRNA末处理组(P＜0.01);U266细胞中IL-6及IL-8 mRNA表达水平亦降低(P＜0.01).结论 抑制APE1在BMSCs和/或骨髓瘤细胞株U266的表达,可明显抑制共培养体系中U266细胞的增殖活性并促进其凋亡.     

蛇床子素对新生大鼠颅骨成骨细胞中OPG、RANKLmRNA表达的影响

目的：研究蛇床子素对新生大鼠颅骨成骨细胞中OPG、RANKLmRNA表达的影响。方法：新生大鼠颅骨成骨细胞分离培养后，取第4代细胞，以5×10^4／mL接种于100cm^2培养瓶中，常规培养3d后，更换为无血清DMEM培养液，细胞饥饿过夜。然后每瓶分别加入含不同浓度蛇床子素的培养液，每浓度4瓶，连续给药48h和72h。每日通过相差显微镜观察细胞的形态、生长状况及治疗组和对照组之间的差别。提取和鉴定成骨细胞总RNA。结果：在培养液中加入不同浓度的蛇床子素培养48h后，1×10^-7mol／L组OPG、OPG／RANKL与对照组比较差异有统计学意义；培养72h后，1×10^-6mol／L组OPG／RANKL、1×10^-7mol／L组OPGmRNA的相对表达量以及OPG／RANKL与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．01，P〈0．05）。结论：蛇床子素能通过OPG—RANKL—RANK系统影响骨重建。     

Effects of Serum Containing Jiangu Granules on Expression of OPG and RANKL mRNA in Osteoblast-like Cells

目的 观察健骨颗粒含药血清对OPG、RANKL mRNA表达的影响.方法 制备健骨颗粒含药血清和生理盐水血清,分别干预体外培养的成骨样细胞ROS17/2.8,干预48 h后,用MTT法检测细胞增殖,荧光定量PCR检测OPG、RANKL mRNA表达.结果 中药血清组对OPG mRNA表达较生理盐水血清组上升,对RANKL mRNA表达较生理盐水血清组降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 健骨颗粒含药血清能促进成骨样细胞的OPG mRNA表达并抑制其RANKL mRNA表达.     

热处理光滑念珠菌对大鼠气道上皮细胞Dectin-1、IL-6和 TNF-α表达的影响

目的：探讨大鼠气道上皮（RTE）细胞与热处理光滑念珠菌孵育后Dectin‐1、IL‐6和TNF‐α的表达及意义。方法以体外培养的RT E细胞与热处理光滑念珠菌孵育后分别于2、4、6 h观察RT E细胞形态变化,以未与光滑念珠菌孵育的RT E细胞为对照组。用Western blot法检测Dectin‐1蛋白的表达;实时荧光定量 PCR检测IL‐6和 TNF‐α mRNA的表达;ELISA法检测上清液IL‐6和TNF‐α的分泌。结果随着孵育时间的延长,RTE细胞破坏逐渐加重及Dectin‐1、IL‐6和TNF‐α的表达呈进行性增高。孵育2 h组与对照组比较、孵育4 h组与孵育2 h组比较、孵育6 h组与孵育4 h组比较,Dectin‐1、IL‐6和T N F‐α的表达差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 RTE细胞具有天然免疫功能,其Dectin‐1参与了对热处理光滑念珠菌的识别,并激活IL‐6和T N F‐α的分泌,介导炎性反应。IL‐6起负性调节作用。     

Lnc-AK077216基于OPG/RANKL/RANK通路对破骨细胞分化成熟的调控作用

目的 基于骨保护蛋白（OPG）/细胞核因子κB受体活化因子配体（RANKL）/细胞核因子κB受体活化因子（RANK）通路探究Lnc-AK077216对破骨细胞（OC）分化成熟的调控作用。方法 取对数生长期RAW264.7小鼠单核巨噬细胞,采用脂质体转染法将Lnc-AK077216-shRNA、Control-shRNA转染至RAW264.7细胞,分别设为转染组、空载组。另取未作处理细胞设为对照组。采用荧光显微镜观察转染率,并采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定转染后Lnc-AK077216 mRNA相对表达量;抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测诱导分化7 d后的OC数及阳性染色面积;采用qRT-PCR检测诱导分化培养3 d后各组OPG、RANKL、RANK mRNA相对表达量;采用Western blotting检测诱导分化培养3 d后各组OPG、RANKL、RANK蛋白相对表达量。结果 转染48 h后,荧光显微镜显示转染效率> 70％;转染48 h后转染组Lnc-AK077216 mRNA相对表达量低于对照组和空载组（P <0.05）;诱导分化前RAW264.7细胞多呈圆形且形态规则,诱导分化7 d后经TRAP染色,可观察到呈阳性的多核巨细胞,细胞有伪足、突起,且体积较大,表明生成OC;转染组OC数少于对照组和空载组（P <0.05）,阳性染色面积小于对照组和空载组（P <0.05）;转染组OPG mRNA和蛋白相对表达量高于对照组和空载组（P <0.05）,RANKL、RANK mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组和空载组（P <0.05）。结论 敲低Lnc-AK077216可抑制RAW264.7细胞向OC分化,其调控机制可能与上调OPG mRNA和蛋白表达,下调RANKL、RANK mRNA和蛋白表达有关。     

1α，25-二羟维生素D3对成骨细胞增殖分化和OPGmRNA/RANKLmRNA表达的影响

目的研究la,25一二羟维生素D,【la,25一（OH）zD,】对体外培育sD大鼠成骨细胞（oB）增殖、分化和细胞核因子K配体（RANKL）及骨保素（OPG）mRNA表达的影响。方法采用胰蛋白酶和胶原酶消化法从24h新生sD乳鼠颅盖骨分离得到的OB,经lnmol／L、10nmol／L、100nmol／L的lct,25-（OH）：D,干预24h、48h和72h后,MTT比色法检测OB增殖率;PNPP法测定碱性磷酸酶（ALP）活性;应用RT-PCR法检测细胞中OPG和RANKL的mRNA表达。结果lnmol／L组成骨细胞A值在干预24h、48h、72hA,分别为（O．335±0．080）、（0．451±0．086）、（O．545±0．085）;100nmol／L组OBALP活性分别增加至（6．274±1．561）U／g、（5．021±1．703）U／g、（6．854±1．468）U／g;OPGmRNA表达分别降低至（0．365±0．068）、（0．340±0．046）、（O．381±0．051）;RANKLmRNA表达分别增加至（O．622±0．089）、（O．550±0．064）、（O．468士0．062）;与0nmol／L组比较,RANKL／OPG比值分别增加138．53％、153．45％、157．71％,差异均具有统计学意义（P〈O．05）。结论高浓度1％25一（0H）2D2可抑制OB增值和OPGmRNA表达。促进其分化和矿化,上调RANKL／OPG的基因表达,从而促进破骨细胞介导的骨吸收,增强骨更新。     

骨康对体外培养人成骨细胞OPG及RANKL基因表达的影响

【目的】观察中药骨康含药血清对肾阳虚型骨质疏松症患者成骨细胞细胞因子骨保护素(OPG)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)mRNA表达的影响。【方法】取6月龄体质量2.5～3.0 kg的新西兰大耳白兔4只,雌雄各半,随机分为2组(中药骨康组、空白对照组),每组2只;分别灌服骨康煎剂4.2 g.kg-1.d-1,以及等容积生理盐水,连续灌胃共7 d,最后1次灌胃2 h后所有动物进行心脏采血,收集血清备用。分离并传代培养肾阳虚骨质疏松症患者成骨细胞,取第2代,制成2×105/mL的细胞悬液。实验组分别加入低、中、高不同浓度(体积分数5%、10%、20%)的骨康含药血清进行干预,空白对照组仅加培养液,继续培养。48 h后采用Trizol一步法提取总RNA,然后采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测OPG、RANKL mRNA的表达。【结果】骨康低、中、高浓度组OPG mRNA表达量显著上升,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);骨康中浓度组与骨康低浓度组、骨康高浓度组与骨康中浓度组组间分别比较差异均有统计学意义(P<0.05);骨康含药血清以体积分数5%、10%、20%浓度递增时,RANKL mRNA的表达量显著下降,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),骨康中浓度组与骨康低浓度组、骨康高浓度组与骨康低浓度组组间RANKL mRNA表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。【结论】骨康可以上调肾阳虚骨质疏松症患者体外培养成骨细胞OPG mRNA的表达,下调RANKL mRNA的表达。     

降钙素对小鼠成骨细胞增殖及OPG/RANKL表达的影响

目的探讨降钙素对小鼠成骨细胞增殖及骨保护素（OPG）／细胞核因子KB受体活化因子配体（RANKL）表达的影响。方法取出生24h内的小鼠30只,无菌的条件下取出颅骨,应用酶消化法进行成骨细胞的培养,在培养成骨细胞的培养液中加入不同浓度的降钙素,首先应用MTT法检测这种药物对成骨细胞增殖的影响,然后应用RT-PCR法检测其对OPG／RANKL mRNA的表达及ELISA法检测OPG蛋白分泌的影响。结果降钙素能促进成骨细胞的增殖。降钙素能增强成骨细胞中OPG mRNA的表达同时抑制成骨细胞中RANKL mRNA的表达,并能促进OPG蛋白的分泌。结论降钙素能促进成骨细胞的增殖及成骨细胞中OPG mRNA的表达,同时抑制RANKL的mRNA的表达。     

1,25-二羟维生素D3对小鼠成骨细胞OPG和RANKL基因表达的影响

目的观察1,25-二羟维生素D 3[1,25(OH)2D 3]对体外培养的小鼠成骨细胞osteoprotegerin(OPG)和receptor activator of NF-κB ligand(RANKL)基因表达的作用.方法取30只出生24 h内的新生小鼠,在无菌条件下取颅盖骨,去除纤维结缔组织,用胰蛋白酶-胶原酶消化法进行成骨细胞的原代培养.取第3～5代的成骨细胞,分成对照组和实验组,在实验组培养液中加入不同浓度的1,25(OH)2D3(10-8、10-9、10-11 mol/L),培养48 h后,取出培养液,-70℃冻存备用.从培养瓶中贴壁细胞提取总RNA,应用RT-PCR法检测细胞中OPG和RANKL的mRNA表达.应用EUSA方法检测培养液中OPG蛋白的浓度.结果各浓度1,25(OH)2D3作用的成骨细胞中,OPG的mRNA表达均较对照组显著减弱,并随1,25(OH)2D3浓度的增加而表达减弱,呈现明显的浓度依赖性;实验组RANKL mRNA的表达较对照组表达明显,且随1,25(OH)2D3浓度增加而增强;实验组成骨细胞中OPG蛋白的表达明显低于对照组(P＜0.05).结论1,25(OH)2D3抑制小鼠成骨细胞OPG的表达,同时增加RANKL的表达.     

含利塞膦酸骨水泥对SD大鼠成骨细胞OPG、RANKL和OC表达的影响

目的 利用大鼠胎鼠分离提取成骨细胞,观察含15％磷酸二氢钙＋0.5％利塞膦酸骨水泥和1％利塞膦酸骨水泥对体外培养的大鼠成骨细胞OPG、RANKL和OC基因表达的作用.方法 实验分成空白对照组、15％磷酸二氢钙＋0.5％利塞膦酸骨水泥浸提液组和1％利塞膦酸骨水泥浸提液组.实验组细胞培养基中加入相对应的磷硅酸钙骨水泥的PBS浸提液,浸提液以1：7与DMEM培养基混合作为细胞培养基;空白对照组成分以无菌PBS与DMEM培养基混合作为细胞培养基,每组6个平行,培养72 h后,提取细胞总RNA,应用RT·PCR法检测细胞中OPG、RANKL和OC的mRNA表达.结果 实验组成骨细胞中OPG和OC的mRNA表达较对照组的表达明显升高,RANKL的表达明显低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 含15％磷酸二氢钙的0.5％利塞膦酸骨水泥和1％利塞膦酸骨水泥浸提液对SD大鼠胎鼠成骨细胞OPG和OC的表达具有促进作用,同时降低了RANKL的表达.     

白细胞介素-17对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL、OPG的影响

目的 研究白细胞介素17(IL-17)水平对人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)中细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、骨保护素(OPG)表达的影响,探讨IL-17与正畸牙根吸收的相关性.方法 采用组织块培养法,在体外建立人牙周膜成纤维细胞系.以不同水平(0、5、10、20、40 ng/mL)的IL-17作用HPDLF 24 h.采用RT-PCR和ELISA法,分别检测RANKL和OPG的mRNA、蛋白的表达.结果 (1)在0 ng/mL组中,HPDLF表达RANKL、OPG.(2)0～20 ng/mL各组中,HPDLF中RANKL的mRNA、蛋白表达量与IL-17水平呈正相关性.(3)5～20 ng/mL各组中,OPG的mRNA、蛋白表达量与IL-17水平呈负相关性.(4)0～20 ng/mL组中,RANKL/OPG的mRNA、蛋白的比值与IL-17水平呈正相关性.结论 在无IL-17刺激时,HPDLF可表达RANKL、OPG.IL-17能够促进HPDLF表达RANKL,同时抑制HPDLF表达OPG,上调RANKL/OPG的比值.     

阿托伐他汀对骨髓来源的成骨细胞中OPG mRNA/RANKL mRNA水平的影响

目的:观察阿托伐他汀对体外培养骨髓基质细胞来源的成骨细胞中OPGmRNA/RANKLmRNA表达的影响。方法:小鼠骨髓基质细胞在成骨条件培养基中传代培养,加入不同浓度的阿托伐他汀。通过半定量RT鄄PCR的方法,比较不同浓度药物影响下OPGmRNA和RANKLmRNA表达的变化,评判阿托伐他汀对这两种蛋白表达的影响作用。结果:半定量RT鄄PCR的观察显示在传代培养7天时各组均有OPGmRNA的转录,随着药物浓度的增加,mRNA转录水平逐渐增加,10-6mol/L组和10-7mol/L组明显高于对照组(P<0.05)。RANKLmRNA水平随着药物浓度的增加呈现出下降的现象,10-6mol/L组和10-7mol/L组明显低于对照组。结论:在小鼠骨髓基质细胞来源的成骨细胞中,阿托伐他汀促进了成骨细胞OPG的表达,同时能抑制细胞RANKL的表达。