水杨羟肟酸功能化聚苯乙烯的制备及其与Tb(Ⅲ)离子配合物的荧光发射特性初探

凭借氯甲基化的聚苯乙烯（CMPS）与水杨羟肟酸（SHA）之间的Friedel-Crafts烷基化反应,使SHA键合在聚苯乙烯( PS) 的侧链上,制备了改性聚苯乙烯(SHA/PS)。再使SHA/PS 与Tb(Ⅲ) 离子配位,制得高分子-稀土配合物Tb(Ⅲ)-SHA/PS。采用红外光谱对其结构进行了表征,考察了影响SHA与CMPS之间Friedel-Crafts 烷基化反应的主要因素。结果表明,当催化剂SnCl4用量为0.06 mL,35 ℃反应18 h时,SHA/PS上SHA的键合率高达33.1%。Tb(Ⅲ)-SHA/PS配合物不仅具有与Tb(Ⅲ)离子相似的荧光光谱,而且SHA/PS配体对Tb(Ⅲ)离子产生了显著的Antenna效应,使其荧光强度大幅增强。     

El-Tor生物型霍乱弧菌可溶性血凝素的性质分析

用改进的 Finkelstein 方法从 Wg2(El-Tor 生物型)弧菌菌株中制备了可溶性血凝素(SHA)和细胞结合血凝素,并对其性质进行了研究。SHA 具有两种功能,它既能凝集鸡的红细胞又能降解某些蛋白质,具蛋白酶的活性。SHA 的最大活性需要 Ca~(2+),活性不被 D-甘露糖、D-果糖、L-果糖和 L-岩藻糖等单糖抑制。在4℃时其活性最稳定。     

DEAE-SephadexA50柱层析分离HbA_2、HbA和HbF的实验研究

本文应用 DEAE-Sephadex A50柱层析法从95%正常人红细胞溶血液和5%脐带血红细胞混合液中分离出 HbA_2、HbA 和 HbF。其中 HbA_2 部分经醋纤薄膜电泳检查,发现除含 HbA_2 外,尚含有少量碳酸酐酶。为了进一步纯化,采用SephadexG-75凝胶过滤层析,使 HbA_2 和碳酸酐酶分离。经纯化的 HbA_2 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,呈现一条 HbA_2 区带,证明 HbA_2 达到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的程度。采用分离纯化的 HbA_2 免疫动物,制取抗 HbA_2 血清,为 HbA_2 免疫检测的研究提供材料。     

登革2型病毒重组E蛋白的生物学特性分析

【目的】检测重组D2V全长E蛋白纯化后的免疫反应性与抗原性,为其亚单位疫苗研制奠定基础。【方法】酵母表达上清超滤浓缩后用金属螫合亲和层析(MCAC)法过柱,用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术观察蛋白条带。将纯化蛋白与组氨酸抗体、D2V E单抗进行斑点印迹和蛋白印迹,以确定纯化物是否为合组氨酸尾的D2V E融合蛋白,并用ELISA检测纯化E蛋白与不同DV抗体的结合反应。用纯化的重组D2V E蛋白免疫小鼠后测定其产生的抗体类型与滴度,以分析其抗原性。【结果】表达产物经MCAC柱纯化获得单一的相对分子质量为69×10~3的蛋白,组氨酸抗体与D2V E单抗的印迹试验证实该条带就是含多聚组氨酸尾型特异的重组E蛋白(rEgp),ELISA显示纯化的rEgp保留有免疫反应性及型特异性,内糖苷酶H消化证实其含有N联高甘露糖残基。接种rEgp可诱生针对D2V抗原与重组E蛋白的高效抗体。【结论】纯化的D2V全长E蛋白保留其免疫原性和免疫反应性,并具有型特异性。     

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物的观察

目的 :观察采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化目的 PCR产物的效果。方法 :使用不同的 31对引物 ,4 5例标本行 PCR扩增出不同的目的 DNA片段 ,将每一份 PCR产物分为 2份 ,其中 1份直接测序 ,为对照组 ;另 1份则做非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,以分离出的目的 DNA片段单链为模板行 2次 PCR,对 2次 PCR产物测序 ,此为实验组。结果 :实验组只有 4例不能被测序仪判读 (4 / 4 5 ) ,而对照组有 2 4例不能被测序仪判读 (2 4 / 4 5 ) ,两组比较 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 1 )结论 :根据单链DNA片段形成构象的不同来纯化 PCR产物可达到更好的纯化效果     

抗-A和抗-B单克隆抗体对红细胞内血红蛋白释放情况的影响

目的:探讨抗-A、抗-B单克隆抗体对红细胞内血红蛋白电泳释放的影响。方法:用A、B、O、AB 4种血型红细胞与抗-A及抗-B单克隆抗体反应后的产物进行淀粉-琼脂粉混合凝胶电泳,常规电泳后停电30 min再继续电泳,观察血红蛋白的释放情况。结果:A、B、O、AB型红细胞与单克隆抗体反应后血红蛋白释放情况不同,与此同时HbA2的电泳行为也发生变化。结论:单克隆抗体对各型红细胞的血红蛋白释放有影响。     

大鼠精子特异的LDH-C_4的提纯及其免疫性质分析

采用硫酸铵盐析、N~6-(6氨己基)-5′-AMP-Sepharose亲和层析和DEAE-Cellulose离子交换层析,从大鼠睾丸中纯化了LDH-C_4。比活性为16.3 IU/mg,纯化1087倍,产率32.5％。纯化的LDH-C_4经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定为一条酶带。将纯化的LDH-C_4免疫兔制备了效价为1:64的抗血清。BA-ELISA检测抗血清与大鼠心脏、肌肉和人、小鼠睾丸提取液之间的交叉反应,结果表明抗血清与大鼠心脏、肌肉提取液间存在微弱的交叉反应,而双向免疫扩散未形成沉淀线;抗血清与小鼠睾丸提取液之间存在很强的交叉反应,但与人睾丸提取液之间的交叉反应却很弱,双向免疫扩散显示它们的抗原决定簇部分相同,提示不同种属的LDH-C_4之间抗原性存在差异。     

大鼠脾脏20S蛋白酶体的分离纯化及电镜观察

目的　分离纯化正常大鼠脾脏 2 0S蛋白酶体 ,并观察其形态特征。方法　采用分级盐析、离子交换层析及凝胶过滤方法 ,分离纯化了正常大鼠脾脏 2 0S蛋白酶体 ,并进行透射电镜观察。结果　所制备的2 0S蛋白酶体纯度较高 ,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)显示 1条带 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)显示 8条带 ,分子量为 ( 19.8～ 31.7)× 10 3;电镜观察显示 ,脾脏 2 0S蛋白酶体呈现典型的圆筒状 ,具有同其它细胞 2 0S蛋白酶体一样的形态特征。结论　这为进一研究 2 0S蛋白酶体结构与功能的关系奠定了基础。     

人血浆部分纯化的内源性钠泵抑制物生物学特性

本研究采用高效液相色谱分析法两次纯化步骤,部分纯化人血浆内源性钠泵抑制物(ESPI),进而分析其生物学特性:1.抑制Na,K-ATP酶,2.抑制钠泵活性,3.竞争性地抑制~3H-巴因与红细胞上的受体或Na,K-ATP酶结合,4.具有“剂量-反应”抑制作用,5.其抑制作用具有可逆性,6.结合于Na,K-ATP酶的E_2构型。     

2种纯化流感病毒方法的比较研究

目的比较2种纯化浓缩鸡胚尿囊液中流感病毒方法。方法将流感病毒鸡胚尿囊液分别采用蔗糖密度梯度离心法(sucrose—density—gradient—centrifugation,SDGC)和红细胞吸附释放法(absorption and release-RBC,AR—RBC)进行纯化,收集纯化病毒测定血凝效价,比较2种纯化方法。结果SDGC法纯化病毒可在30％和45％蔗糖层面交界处的区带中检测到流感病毒,血凝效价为1：2560;用AR—RBC法纯化病毒过程中用新鲜鸡红细胞出现了溶血现象,而用甲醛处理过的鸡红细胞则无此现象,血凝效价均为1：2560。结论与SDGC法纯化病毒比较,AR-RBC法是一种经济实用、操作简便并有较高纯化效率的方法,尤以甲醛处理过的鸡红细胞纯化效果最好。     

胰岛素受体的分离纯化及其酪氨酸蛋白激酶特性的研究

本文利用差速离心,2%Triton X-100增溶,伴刀豆球蛋白A-琼脂糖,胰岛素-亲和胶及麦胚凝集素-亲和胶亲和层析分离纯化了人胎盘的胰岛素受体。纯化的受体经圆盘电泳及HPLC凝胶过滤得单一峰。SDS-电泳显示分子量分别为135000及90000的两条带。纯受体有自身磷酸化作用,且对外源性底物呈现酪氨酸蛋白激酶活性。有意义地是纯化的受体的磷酸化可受促癌剂促癌因子抑制。     

人子宫颈粘液抗菌活性多肽的分离纯化

目的　从人子宫颈粘液分离纯化新的抗菌多肽。方法　用 5 %乙酸提取人子宫颈粘液可溶物 ,经电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌试验发现 ,子宫颈粘液酸溶性提取物有一条主带对大肠杆菌耐氨苄株 ML - 35 P有强抗菌活性 ,命名为 HCP。应用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术及洗脱电泳技术得到构成该主带的混合物 ,最后应用反相高效液相色谱技术分离纯化多肽。经 Tricine- SDS- PAGE鉴定其相对分子质量 ,并运用琼脂糖弥散法鉴定其抗菌活性。结果　从子宫颈粘液酸溶性提取物中纯化出一多肽 ,相对分子质量约为 14× 10 3,命名为 HCP- 1,具有抗耐药性大肠杆菌和绿脓杆菌的活性。结论　 HCP- 1可能是宫颈粘液天然免疫机制中的新的效应分子     

霍乱弧菌O139菌毛的提取及鉴定

为给霍乱弧菌亚单位苗菌的研制提供基础,作者对霍乱弧菌Ｏ１３９菌毛的提取和鉴定方法进行了探讨。结果发现,菌毛的最佳表达条件为ＡＫＩ或ＣＦＡ培养其中３０℃静止培养２４－３６小时。     

长白山白眉蝮蛇毒磷脂酶A2的提纯

应用ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－５０离子交换层析法，从长白山白眉蝮蛇毒中分离出２个具有磷旨酶Ａ２（ＰｈｏｓｐｈｌｉｐａｓｅＡ２，ＰＬＡ２）活性的蛋白质组分。其中之一再经ＤＥＡＥ－ＣｅｌｌｕｌｏｓｅＡ－５２离子交换层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶过滤进一步纯化，经两种不同类型的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定均为单一条带，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶过滤呈单一对称的峰形。     

一种新的沙蚕纤溶酶的纯化、活性鉴定及部分分子特性

目的：从沙蚕Nereis virens的体腔液中纯化、鉴定出一种新的纤溶酶,并对其进行分子表征。方法：运用离子交换层析、凝胶过滤层析等常规色谱方法纯化蛋白酶,采用纤维蛋白板检测法鉴定纤溶活性及活性分布曲线,利用2D-电泳方法检测此纤溶酶的表观分子量和等电点,并检测多种蛋白酶抑制剂对其酶活性的影响,以确定此蛋白酶的类型。结果: 获取一种新的具有极强纤维蛋白水解活性的单链蛋白酶,其相对分子质量为29000,等电点为4.5,其蛋白水解活性在pH7.8和45℃时表现为最高,并能被二异丙基氟磷酸（DFP）和甲苯磺酚氟（PMSF）完全性抑制,确证其为一种典型的丝氨酸内肽酶。结论：Nereis virens的体腔液中存在一种纤溶活性极强的单链丝氨酸内肽酶,该纤溶酶对预防和治疗血栓性疾病具有一定的药用价值。     

大鼠脑阿片受体的溶脱与提纯

大鼠脑(去小脑)突触膜在含二硫苏糖醇和胰酶抑制剂的Tris中用CHAPS溶脱。将溶脱液先后通过自制的阿片类配体10b和10cd 2个亲和层析柱,均用纳洛酮溶液洗脱。洗脱液再经过麦胚凝集素亲和层析和N-乙酰葡萄糖胺洗脱。进一步用制备型粒状凝胶等电聚焦电泳纯化和浓缩,所用凝胶为SG200,在pH5和pH7.8各有一蛋白质峰。淋冼所得样品用银染法测蛋白质含量,并用RRA测与~3H-伊托啡结合的活性,结果表明二者都是OPR,纯化程度达80 000倍以上。分子量用凝胶过滤法测定,pH5和pH7.8样品中的OPR分子量分别为52kD和42kD。pH5中OPR经用与~3H-羟基芬太尼结合的活性鉴定为μ-型受体。     

蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定

 【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2（PTP4A2）基因并高效表达纯化,对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术,从肝癌细胞系HepG2的总RNA中,获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达载体,并导入大肠杆菌E.coliBL21中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化,western印记进行鉴定,质谱检测蛋白分子量。通过其对底物磷酸多肽的去磷酸化反应,鉴定其活性。【结果】获得编码肝癌细胞PTP4A2（全长氨基酸）的基因序列,测序结果与已发表的基因序列相一致。重组GST融合蛋白经western分析,在相对分子质量Mr=45000处,有特异的蛋白条带。重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,质谱检测其分子量为45470.6。底物多肽去磷酸化反应表明纯化产物具有较强活性。【结论】成功克隆人PTP4A2基因,并在E.coliBL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白,质谱检测分子量与预期结果一致,纯化产物具有蛋白磷酸酯酶活性。     

重组人Ⅱ型胶原250-270多肽的表达、纯化和鉴定

目的:表达与纯化重组人Ⅱ型胶原250-270多肽(rhCⅡ250-270),鉴定并确认rhCⅡ250-270多肽与预期的相符。方法:在E.coli BL 21中表达rhCⅡ250-270多肽,使用亲和层析法分离纯化。用限制性酶切、聚合酶链式反应(PCR)、基因序列测定、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹等方法在基因和蛋白水平上对rhCⅡ250-270多肽进行鉴定。结果:纯化的rhCⅡ250-270多肽,大小约43 kD,纯度为89.3%。E coRⅠ和SalⅠ双酶切法和PCR法鉴定测得DNA大小约为500bp和650bp,核苷酸序列测定证实基因DNA序列与设计的完全相符。SDS-PAGE显示rhCⅡ250-270多肽目的蛋白条带的大小约为43 kD,W estern B lotting证实GST融合蛋白上存在CⅡ片段。结论:表达和纯化rhCⅡ250-270多肽与预期的相符,并发现此多肽具有较强的免疫原性。     

人子宫颈黏液抗菌多肽的分离和鉴定

目的　从人的子宫颈黏液分离和鉴定新抗菌多肽,探讨子宫颈黏液抗菌机制。方法　用5%乙酸提取人子宫颈黏液可溶物,应用电泳凝胶抗菌蛋白分析法分析其抗菌蛋白,制备酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳及反相高效液相色谱分离纯化抗菌多肽。凝胶琼脂糖弥散法抗菌检测抗菌活性。纯化的抗菌多肽进行氮端氨基酸序列测定,根据其序列设计简并引物,利用简并聚合酶链反应(PCR)技术扩增其全长cDNA。通过BLAST硷基比对程序分析比较与已知蛋白的同源性。进一步应用常规基因重组技术构建其原核表达质和制备重组多肽。采用最小抑菌浓度和最小杀菌浓度检测重组多肽的抗菌效能。结果　从子宫颈黏液中分离纯化到一个具抗菌活性的多肽,通过蛋白测序、简并PCR及BLAST等方法鉴定该蛋白为HMGN2高游动性蛋白。制备获得重组HMGN2多肽,重组HMGN2抗大肠杆菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度分别为10 .42μg/ml±3. 13μg/ml和27. 78μg/ml±8 .33μg/ml,与人中性粒细胞防御素相当;最小杀菌浓度分别为20 .83μg/ml±6 .25μg/ml和55 .56μg/ml±16 .67μg/ml。结论　除已知的抗菌肽外,HMGN2亦可能是宫颈黏液含有的抗感染效应分子之一。     

重组人热休克蛋白70生物活性的快速鉴定

目的　快速鉴定纯化后的重组人热休克蛋白 70 (rHSP70 )的特异性及其是否具有生物活性。方法　将rHSP70与肿瘤细胞内的小分子多肽在一定条件下温育 ,并利用含 5 %甘油的Nativepage电泳分析。 结果　可快速鉴定出rHSP70是否具有生物活性 ,电泳后凝胶可做Western -blot特异性鉴定。结论　该法操作简便 ,重复性好 ,既可快速鉴定rhsp70的生物活性 ,又可特异性鉴定rhsp70自身