HBV adr亚型基因疫苗诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV)adr亚型基因疫苗pCMV-S2.S(PS），观察其诱导小鼠所产生的特异性体液和细胞免疫应答。方法：将PS注射于C57BL／6小鼠胫骨前肌内，应用ELISA方法检测不同时间小鼠血清中抗HBs抗体以及采用^51Cr释放实验检测淋巴细胞杀伤功能。结果：注射基因疫苗1周后，血清中抗HBs抗体转阳，4周后抗体达到高峰，并以高水平维持至少8周；第12周时PS诱导小鼠产生了良好的HBV特异的细胞免疫应答（P＜0.05）。结论；所构建的HBV adr亚型基因疫苗PS能够诱导小鼠产生较好的体液和细胞免疫应答。     

HBV preS2-S DNA免疫诱导小鼠体液免疫应答

目的:构建HBV表面抗原preS2-S基因表达质粒,并探讨其在小鼠体内的表达及诱导体液免疫应答的能力.方法:采用PCR方法,以PBR322-HBV2.0(adr亚型)质粒DNA为模板获得HBV preS2-S基因,并将其重组进入pcDNA3.0表达载体中,转染7721细胞系进行稳定表达;以此重组质粒免疫小鼠,ELISA方法检测免疫小鼠抗HBs抗体浓度.结果:构建了HBV preS2-S基因的表达质粒pcDNAS2-S,该表达质粒可在7721细胞中稳定高效表达;免疫接种小鼠2周后抗HBs抗体浓度明显升高,接种后第4周布比卡因处理组小鼠抗HBs抗体的浓度达到峰值161.4 mIU/ml,布比卡因非处理组第5周抗HBs抗体的浓度可达133.7 mIU/ml.结论:所构建的pcDNAS2-S表达质粒能有效表达并诱导小鼠体液免疫应答.     

非洲爪蟾TGF-β5和小鼠TRP-2联合免疫诱导产生抗肿瘤免疫应答

目的研究非洲爪蟾转化生长因子-β5(aTGF-β5)基因免疫对肿瘤治疗性质粒DNA疫苗诱导抗肿瘤免疫应答的效能的影响,探讨所诱导免疫应答的抗肿瘤机制.方法用aTGF-β5真核表达质粒和小鼠酪氨酸酶相关蛋白2(mTRP-2)真核表达质粒联合免疫野生型C57BL/6小鼠、CD4缺陷的C57BL/6小鼠和CD8缺陷的C57BL/6小鼠,于免疫前或免疫后接种黑色素瘤细胞B16F10,观测肿瘤生长和小鼠存活情况.结果两种质粒联合免疫能在野生型C57BL/6小鼠体内诱导产生保护性和治疗性抗肿瘤免疫,而mTRP-2真核表达质粒单独免疫野生型C57BL/6小鼠及两种质粒联合免疫CD4或CD8缺陷的C57BL/6小鼠均不能诱导产生抗肿瘤免疫应答.结论 aTGF-β5基因免疫能增强编码mTRP-2的肿瘤治疗性质粒DNA疫苗诱导抗肿瘤免疫应答的能力;T细胞免疫应答的诱导是抗小鼠黑色素瘤免疫应答所必需的.     

HBV基因疫苗诱导正常及HBV转基因小鼠产生体液免疫应答

目的:用乙型肝炎病毒(HBV)蛋白基因真核表达载体诱导正常小鼠及HBV转基因小鼠产生特异性体液免疫应答,以探讨其预防及治疗HBV慢性感染的可行性.方法:将HBV S2.S基因的真核表达载体pCMV-S2.S(PS)和相应的空载体pcDNA3.0分别免疫正常C57BL/6小鼠及同一品系HBV转基因小鼠(n=5).每只小鼠肌内注射纯化质粒100 μg.用ELISA方法检测小鼠血清抗HBs和抗preS2效价及HBV转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg的水平.注射基因疫苗后第8周,活检取转基因小鼠肝脏组织,制备石蜡切片并行H-E染色,光镜下观察其病理改变.结果:PS诱导正常及转基因小鼠产生了抗HBs及抗preS2,并且抗preS2的出现早于抗HBs约1～2周.PS免疫8 周后,转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg为阴性.注射基因疫苗后第8周病理检查转基因小鼠肝脏组织,肝细胞出现程度不同的广泛浊肿和水样变性,而相应的对照组无明显改变.免疫前后肝组织内单个核淋巴细胞数量无显著变化.结论:研究表明HBV中蛋白基因疫苗能够有效诱导HBsAg特异性的体液免疫应答,能够清除转基因小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;初步的实验结果为研制治疗HBV慢性感染的基因疫苗提供了依据.     

CpG ODN增强免疫力低下小鼠对乙肝疫苗的体液免疫应答

目的 探讨CpG ODN对免疫力低下小鼠的体液免疫增强作用。方法 选用老年C57BL／6小鼠和免疫抑制模型小鼠，将重组HBsAg疫苗和CpG ODN同时或单独肌注到小鼠体内，2周后以同样剂量加强免疫1次，再过3周后摘除眼球取血，用ELISA方法检测抗HBsAg IgG抗体。结果 免疫抑制模型中同时注射CpG ODN和疫苗组产生的IgG抗体绝对量是单独注射疫苗组的2倍；老年鼠组中10μg和20μg CpG ODN与疫苗同时注射组产生的IgG抗体绝对量分别是单独注射疫苗组的3倍和4倍。结论 CpG ODN能增强免疫力低下小鼠对乙肝疫苗的体液免疫应答。     

β葡聚糖对小鼠抗体产生的影响

目的观察β葡聚糖是否可以促进抗体产生并探讨其作用是否依赖补体.方法用β葡聚糖与抗原OVA联合免疫C57BL/6小鼠和补体C3基因缺陷小鼠,ELISA实验检测总IgG、IgG2a、IgG1抗体的产生.结果β葡聚糖与OVA联合免疫的C57BL/6小鼠,其OVA特异性IgG、IgG2a、IgG1抗体应答均显著高于单独用OVA免疫的小鼠,低于完全弗氏佐剂与OVA免疫的小鼠;补体C3基因缺陷小鼠IgG、IgG2a、IgG1抗体滴度均显著低于野生型C57BL/6小鼠.结论β葡聚糖可以促进抗体产生;补体C3缺损显著影响β葡聚糖介导的抗体应答.     

日本血吸虫大陆株副肌球蛋白全基因核酸疫苗诱生免疫应答的实验研究

目的初步研究日本血吸虫大陆株副肌球蛋白核酸疫苗在C57BL／6小鼠诱生的免疫应答特征。方法利用TRIzol方法抽提日本血吸虫大陆株成虫总RNA，并通过逆转录聚合酶链反应；扩增编码日本血吸虫大陆株副肌球蛋白（SjC97）的全基因cDNA，将其克隆入质粒表达载体（pcDNA／Amp）构建成日本血吸虫大陆株副肌球蛋白全基因核酸疫苗（pCMV－SjC97）；将其通过后腿胫前肌免疫C57BL／6小鼠，共免疫3次，每次间隔3周；利用酶联免疫吸附试验（ELISA）分析pCMV－SjC97免疫所诱生的特异性抗体IgG及IgG亚类，以及特异性抗体IgM及IgE。并初步分析了pCMV－SjC97免疫C57BL／6小鼠脾淋巴细胞抗原特异性体外增殖能力。结果pCMV－SjC97免疫能够诱生特异性抗体IgG及IgM；pCMV－SjC97诱生的抗体滴度与注射的DNA间存在一定的量-效关系；IgG亚类分析显示，pCMV-SjC97免疫主要诱生IgG2a和IgG2b亚类，未测到IgG1及IgG3亚类。PCMV-SjC97免疫能够诱导小鼠Th细胞激活。结论pCMV-SjC97核酸疫苗能够在C57BL／6小鼠诱生较强的体液免疫应答；pCMV-SjC97免疫主要诱生Th1型细胞免疫应答。     

MHC I类基因逆转录病毒表达载体的构建及其在造血细胞中的表达

目的：构建BALB/c小鼠MHC I类基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在C57BL/6小鼠造血细胞中，并用逆转录聚合酶链反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达。结果：用EcoR I和XhoI双酶切鉴定证实，H2D^d基因正确插入载体pMSCV。重组逆转录病毒感染的C57BL/6小鼠造血细胞整合了BALB/c小鼠的H2D^d基因，且能转录为mRNA，在其细胞膜上有H2D^d分子的表达。结论：成功构建小鼠H-2D^d编码基因的逆转录病毒载体，该基因已稳定地整合进C57BL/6小鼠造血细胞的基因组内，且在细胞中得到表达。     

小鼠实验性干燥综合征模型的建立

目的: 利用小鼠唾液腺蛋白免疫诱导构建实验性干燥综合征(experimental Sjgren syndrome,ESS)模型。方法: 制备唾液腺蛋白,将其免疫C57BL/6小鼠,诱导ESS模型,检测小鼠唾液流速,采用ELISA试剂盒检测血清中自身抗体水平,HE染色观察唾液腺组织中淋巴细胞的浸润情况。结果： 与对照组相比,ESS小鼠唾液流速显著降低(P<0.05);血清中抗唾液腺蛋白抗体,抗毒蕈碱乙酰胆碱3受体抗体(抗M3R抗体),抗核抗体等自身抗体水平明显增高(P<0.05);唾液腺组织和颈部淋巴结明显肿大;HE染色显示ESS小鼠唾液腺组织中大量淋巴细胞浸润且伴有腺管的破坏。结论： 通过小鼠唾液腺蛋白免疫C57BL/6小鼠,可成功构建ESS模型。     

MHC Ⅰ类基因逆转录病毒表达载体的构建及其在造血细胞中的表达

目的构建BALB/c小鼠MHC Ⅰ类基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在C57BL/6小鼠造血细胞中的表达.方法由逆转录病毒载体pMSCV介导,将BALB/c小鼠的H-2Dd基因导人C57BL/6小鼠的造血细胞中,并用逆转录聚合酶链反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达.结果用EcoRⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定证实,H2Dd基因正确插入载体pMSCV.重组逆转录病毒感染的C57BL/6小鼠造血细胞整合了BALB/c小鼠的H2Dd基因,且能转录为mRNA,在其细胞膜上有H2Dd分子的表达.结论成功构建小鼠H-2Dd编码基因的逆转录病毒载体,该基因已稳定地整合进C57BL/6小鼠造血细胞的基因组内,且在细胞中得到表达.     

乙型肝炎病毒核心抗原基因疫苗对小鼠的体液和细胞免疫原性观察

目的 观察不同品系小鼠（Ｈ－２＾ｂ,Ｈ－２＾ｄ）经乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）基因疫苗免疫后特异性辅助性Ｔ细胞反应类型和特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。方法 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法鉴定该基因疫苗的体外表达产物;基因枪法和肌内注射法接种该基因疫苗;间接ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）水平;＾５１铬释放法测定小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。结果     

小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答及细胞因子的免疫佐剂效应

目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。　方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细胞因子真核表达载体 ;背部皮下接种 P 815 - HBV - S细胞 ,观察成瘤情况 ;EL ISA法测定血清抗HBs;4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性。　结果 :免疫 8周后 ,以 p CR3.1- S、p CR3.1- S+IL- 2及 p CR3.1-S+IL- 12免疫的小鼠血清 ,45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1、1.98± 0 .17及 1.6 7± 0 .15 ,均较 p CR3.1组显著提高(P<0 .0 5 )。CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %、(6 1.9± 7.1) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与 p CR3.1- S组比较差异均显著 (P<0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 ,CTL细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) %、(5 6 .2± 7.5 ) %和 (75 .6± 9.1) % ,抗 CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) %、(13.6± 1.9) %和 (16 .9±2 .3) %。对照组成瘤率为 10 0 % ,p CR3.1- S组小鼠成瘤率为 12 .5 % ,p CR3.1- S+IL- 12真核表达载体组成瘤率为0 ,对照组平均存活期和 6周后存活率分别为 2 8.4天和 0天。后两组分别 >38.2天及 45     

乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后的免疫应答研究

目的 构建乙肝核酸疫苗pCI/S2S,研究其接种小鼠后,接种局部肌肉特异性抗原蛋白的表达以及所诱生的免疫应答反应.方法 从慢性乙肝患者的混合血清中制备HBV DNA模板,扩增出基因片段S2S,与pCI载体进行连接,得到重组质粒pCI/S2S.将其肌肉注射接种BALB/c小鼠,在不同的时间点检测血清中抗-HBs及抗-preS2;并于第12周时用细胞毒性检测试剂盒(LDH)检测体外细胞毒性T细胞(CTL)活性,同时以免疫组织化学法检测小鼠接种部位HBsAg的表达.结果 小鼠肌肉接种pCI/S2S完成后1周血清抗-HBs、抗-preS2开始阳转,阳转率于6周或8周达高峰,且能诱生特异性CTL应答.此外,免疫组织化学法能在小鼠的接种局部肌细胞中检测出目的抗原蛋白的表达.结论 乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后,能在小鼠体内诱生特异性的体液免疫和细胞免疫应答.     

白细胞介素-2对乙型肝炎病毒基因疫苗免疫效应的影响

目的　构建表达乙型肝炎病毒 (HBV)S蛋白的重组质粒pCR3 .1 -S作为基因疫苗 ,观察重组人白细胞介素 - 2 (rhIL - 2 )作为佐剂对其诱导BALB/c小鼠产生免疫应答的影响。方法　以不同剂量IL - 2作为佐剂 ,生理盐水作为对照 ,测定不同免疫组的血清抗HBs、淋巴细胞增殖活性、淋巴细胞杀伤活性 ,比较不同免疫组间体液和细胞免疫应答的差异。结果　抗HBsELISA滴度 ,IL - 2组与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5) ;淋巴细胞增殖指数、淋巴细胞杀伤率 ,IL - 2　 1 0 0 0U/ (只·次 )组、IL - 2　 2 0 0 0U/ (只·次 )组与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 5) ,而IL - 2　 50 0U/ (只·次 )组与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论　一定剂量的IL - 2作为佐剂可增强HBV基因疫苗的免疫效应。     

白细胞介素-12和白细胞介素-18质粒对HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H-2d)体液免疫应答的影响

目的：观察编码白细胞介素（IL）－12和IL－18的真核表达载体[pcDNA3.1/IL-12(以下简称IL－12质粒）和pcDNA3.1/IL-18(以下简称IL－18质粒）]对HBcAg DNA疫苗（pJW4303/HBc)诱导BalB/c(H-2^d)小鼠免疫应答的影响。方法：肌肉注射接种IL－12质粒、IL－18质粒和HBcAg DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBc IgG亚类（IgGl,IgG2a)水平。结果：免疫6周后，联合注射IL－12、IL－18和IL－12＋IL－18组小鼠血清的抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0．05），抗HBc IgG亚类以IgG2a占优。结论：IL－12、IL－18以及IL－12＋IL－18联合HBcAg DNA疫苗注射能够提高小鼠血清中抗HBc水平。     

HBV S基因与IL-12基因联合免疫小鼠的免疫应答

目的 观察小鼠对IL-12基因表达质粒与HBVS基因疫苗联合免疫的免疫应答。方法 用已构建的HBVS基因疫苗（pCR3.1-S)和表达IL-12p35和p40蛋白的真核表达载体pWRG3169分别给BALB/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫1次,用ELISA法及MTT法检测小鼠血清抗-HBs及脾细胞对HBsAg的特异性增殖反应。结果 免疫接种2wk后小鼠血甭抗-HBs滴度及脾细胞对HBsAg的刺激指数均明显高于对照组,pWRG3169 pCR3.1-S组明显高于单纯pCR3.1-S注射组。结论 IL-12表达质粒可以增强pCR3.1-S基因疫苗诱导的体液和细胞免疫应答强度,尤以细胞免疫增高明显。     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。     

乙肝病毒表面抗原基因疫苗诱导小鼠细胞及体液免疫应答的研究

为观察乙肝病毒 Ｈ Ｂｓ Ａｇ 基因疫苗免疫小鼠后的细胞及体液免疫应答,将该疫苗定向克隆于质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 巨细胞病毒启动子下游,构建能在真核细胞内表达的重组基因疫苗ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ Ｈ Ｂｓ Ａｇ 。将此疫苗通过多点肌肉注射免疫 Ｂａｌｂ／ Ｃ 小鼠后第六周,实验组小鼠均出现抗－ Ｈ Ｂｓ Ｉｇ Ｇ 阳性,其抗体水平明显高于对照组,同时 Ｔｈ１ 免疫应答相关的细胞因子 Ｉ Ｌ２ 及γ干扰素水平也明显高于对照组,表明本文构建的基因疫苗ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ Ｈ Ｂｓ Ａｇ 能诱导 Ｂａｌｂ／ Ｃ 小鼠产生良好的细胞及体液免疫应答。