自噬基因Beclin1启动子细胞自噬模型的建立

【目的】构建自噬基因Beclin1启动子报告基因细胞自噬模型,为筛选出以Beclin1为靶标的中药提供新的细胞模型。【方法】采用瞬时转染双荧光素酶报告基因测定法,确定最佳转染浓度、时间等条件,及Beclin1基因启动子转录活性细胞自噬模型的建立和验证,观察血清饥饿、过氧化氢氧化损伤及自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素对Beclin1基因启动子转录活性PC12细胞自噬模型的影响。【结果】血清饥饿诱导12 h,Beclin1基因启动子转录活性是体积分数10%血清组的1.8倍,而血清饥饿诱导18、24 h与诱导12 h比较其转录活性无明显变化;300μmol/L过氧化氢诱导9 h,Beclin1基因启动子转录活性是0μmol/L过氧化氢组的1.3倍;雷帕霉素在浓度0.1、1 nmol/L可上调Beclin1基因启动子转录活性,并呈浓度依赖性,而5 nmol/L及更高浓度的雷帕霉素可下调Beclin1基因启动子转录活性。【结论】成功建立用Beclin1基因启动子报告基因检测Beclin1基因启动子转录活性特异性的细胞发生自噬模型,血清饥饿、过氧化氢、自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素可诱导Beclin1基因启动子的转录活性。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

雷帕霉素诱导急性T淋巴白血病细胞自噬分子机制的研究

目的：研究不同浓度雷帕霉素对急性白血病CD4+T-Jurkat细胞增殖的影响，并从自噬方面探讨其作用机制。方法：MTT法检测不同浓度雷帕霉素对细胞增殖的影响；流式细胞术检测细胞凋亡率和周期阻滞；吖啶橙染色观察自噬溶酶体的变化；转录组测序数据分析自噬相关基因的差异表达；RT-qPCR和Western Blot实验检测自噬相关基因的转录和蛋白质表达水平；FAIRE-qPCR分析自噬基因启动子区的染色质可及性状态。结果：与对照组相比，雷帕霉素呈浓度和时间依赖性方式抑制Jurkat细胞的增殖；并将细胞周期阻滞在G0/G1期，但不能有效诱导细胞凋亡。通过吖啶橙染色观察，给药后可见自噬溶酶体的数量增加。RNA-seq数据显示，雷帕霉素可以显著影响自噬相关基因的转录水平。不同浓度雷帕霉素作用于Jurkat细胞48 h后，10 nmol/L和20 nmol/L浓度的雷帕霉素可上调ULK1、ATG13、ATG16L2、PI3K3R1、Raptor基因的表达，下调MAPK1基因的表达；50 nmol/L时，下调各基因的表达水平。自噬基因启动子区域染色质可及性也随之发生改变，与基因表达变化趋势基本一致。结论...     

雷帕霉素靶蛋白复合物1对Hela细胞微管蛋白稳定性的影响

目的: 探讨雷帕霉素靶蛋白复合物1 (mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1）对Hela细胞微管稳定性的影响及可能机制。方法: 使用50 nmol/L雷帕霉素预处理Hela细胞24 h后,加入5 μmol的诺考达唑处理30、60和120 min,免疫荧光检测微管蛋白的稳定性;使用50 nmol/L雷帕霉素处理Hela细胞24 h后,蛋白质印迹检测促微管解聚蛋白stathmin、KIF2A,促微管聚合蛋白CLIP170,微管切割蛋白Katanin、Spastin的表达变化。转染ATG5-shRNA抑制自噬相关基因5（autophagy-related gene5, ATG5）后,免疫荧光检测微管蛋白稳定性的改变。使用50 nmol/L雷帕霉素预处理Hela细胞24 h后,蛋白质印迹检测Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family member A,RhoA)的表达;转染GFP RhoA-Q63L或GFP RhoA-N19、p190RhoGAP-siRNA质粒后,免疫荧光检测微管稳定性的改变。结果： 用雷帕霉素抑制mTORC1的活性后Hela细胞微管的稳定性增强,但微管稳定性相关蛋白stathmin、KIF2A、CLIP170、Katanin、Spastin无明显变化。抑制细胞自噬后,微管的稳定性无明显改变。雷帕霉素抑制 mTORC1的活性后RhoA GTP酶的活化水平下调;下调p190RhoGAP的活化水平后,微管的稳定性减弱。结论： RhoA在mTORC1介导的Hela细胞微管稳定性中起重要作用。     

phP53-luc质粒的构建及其用于检测化学物质遗传毒性的初步分析

目的:构建2个分别由p53基因启动子和核心启动子驱动的荧光素酶报告基因表达质粒,并探讨其用于检测遗传毒性化学物质的可行性.方法:通过PCR扩增人p53基因启动子片段,然后采用重组DNA技术克隆入pGL3-BASIC的荧光素酶报告基因的上游而获得phP53-luc表达质粒.用脂质体转染法将phP53-luc转染入NIH 3T3细胞并分别用5-氟尿嘧啶(5-FU)处理,最后裂解细胞用Dual-Luciferase Reporter Assay System检测荧光素酶报告基因表达.结果:构建了2个分别由p53基因启动子和核心启动子驱动的荧光素酶报告基因表达质粒,位于这2个质粒上的荧光素酶报告基因在NIH 3T3细胞内的表达显著地受遗传毒性化学物质的诱导,其表达比对照的pGL3-BASIC载体上的荧光素酶报告基因高近240倍.结论:基于人p53基因启动子的荧光素酶报告基因分析系统可以用于快速检测环境毒物的遗传毒性.     

低氧调控p53RFP基因启动子活性的初步研究

目的 观察低氧对p53RFP基因表达及启动子活性的影响，探索低氧反应元件(HRE)是否参与了低氧对p53RFP基因启动子活性的调控。方法 将HEK293细胞置于低氧条件下培养，实时定量PCR及Western blot检测p53RFP mRNA及蛋白表达水平；通过定点突变技术构建HRE突变型p53RFP启动子双荧光素酶报告基因载体并转染HEK293细胞，分别置于常氧和低氧条件下培养，双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。结果 低氧处理不同时间点p53RFP mRNA表达水平均显著增加，差异有统计学意义(F=96.493,P<0.001);低氧组p53RFP及HIF-1α蛋白表达量均呈时间依赖性递增。成功构建了HRE突变型p53RFP启动子双荧光素酶报告基因载体，双荧光素酶报告基因检测显示，与常氧组相比，低氧条件下野生型p53RFP基因启动子活性增加(t=-19.504,P<0.001),HRE单突变或双突变后启动子活性均较野生型降低(F=160.891,P<0.001)。结论 低氧可诱导p53RFP基因表达上调；成功构建了HRE突变型p53RFP双荧光素酶报告基因载...     

雷帕霉素对白血病SUP-B15细胞株HIF-1α、VEGF表达的影响

目的:观察雷帕霉素对人急性淋巴细胞白血病SUP-B15细胞的生长及HIF-1α、VEGF表达的影响.方法:实验分为雷帕霉素处理组和对照组,雷帕霉素处理组以含不同终浓度雷帕霉素( 10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/C)的IMDM培养处理,对照组以相同体积细胞IMDM培养液培养,并于处理后24 h、48 h、72 h观察各组细胞形态,实时荧光定量PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达.结果:雷帕霉素处理后SUPB15活细胞数量减少,死细胞数量增加,可见细胞抱团生长、胞膜出泡、细胞破碎等现象,随药物浓度升高和作用时间增加变化程度明显.瑞氏染色观察可见,雷帕霉素处理组早期无明显变化,处理后期(72 h)细胞出现明显空泡样改变,并呈浓度依赖关系;雷帕霉素处理组细胞HIF-1α mRNA的表达在24h变化不明显;48 h时,10 nmol/L、100nmol/L雷帕霉素处理细胞HIF-1 αmRNA的表达上调,20 nmol/L、50 nmol/L雷帕霉素处理细胞HIF-1α表达下调;72 h时,各浓度的雷帕霉素对HIF-1αmRNA的表达均呈上调趋势;在雷帕霉素处理后,除较低浓度(10 nmol/L、20 nmol/L)雷帕霉素处理72 h外,SUP-B15细胞的VEGF mRNA表达均呈显著下调.结论:雷帕霉素可抑制SUP-B15细胞生长,导致形态明显改变,并能下调SUP-B15细胞VEGF mRNA的表达.     

过表达UCHL1-AS1及联合雷帕霉素对人肝癌细胞Bel-7404增殖的影响

目的慢病毒转染人肝癌细胞株Bel-7404,研究过表达UCHL1-AS1,以及与雷帕霉素联合处理对肝癌细胞株增殖的影响,为肝癌治疗提供新方向。方法慢病毒转染人肝癌细胞株Bel-7404,建立过表达UCHL1-AS1稳转株,用MTT实验检测过表达UCHL1-AS1的肝癌细胞增殖能力。设置control组(空白对照组)、NC组(阴性对照组)、UCHL1-AS1组(实验组)、雷帕霉素+control组、雷帕霉素+NC组、雷帕霉素+UCHL1-AS1组。不同浓度雷帕霉素(0 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L、100 nmol/L、200nmol/L、500nmol/L、1000 nmol/L)单独处理组,处理细胞48h后用MTT实验检测雷帕霉素对细胞增殖的抑制作用。结果未见UCHL1-AS1组与control组和NC组细胞的生长速率有差异。过表达UCHL1-AS1联合雷帕霉素作用细胞48h后,在200nmol/L和500nmol/L雷帕霉素联合UCHL1-AS1处理组与control组和NC组的抑制率存在明显的差异。结论过表达UCHL1-AS1对Bel-7404肝癌细胞增殖的无明显影响,过表达UCHL1-AS1与雷帕霉素联合作用对人肝癌细胞Bel-7404的增殖有明显的抑制作用,且此作用强于过表达UCHL1-AS1、雷帕霉素单独对细胞的作用。     

HR24L基因过表达抑制细胞凋亡

目的:研究人类DNA 损伤修复基因HR24L与细胞凋亡的关系.方法:PCR方法扩增HR24L基因开放阅读框序列,克隆入逆转录病毒载体pDOR-neo,转染HeLa细胞,筛选阳性克隆;Southern印迹验证HR24L基因的整合状况.Northern印迹检查HR24LmRNA的细胞内表达水平.过氧化氢、丁酸钠及血清饥饿诱导凋亡,流式细胞计数仪检测凋亡比例,电泳观察DNA Ladder,Western印迹检测凋亡相关蛋白质的表达.结果:获得转染有HR24L基因的HeLa细胞.与HeLa细胞相比,HeLa-HR24L细胞HR24LmRNA表达明显上升.HR24L基因过表达导致Bcl-2的表达升高,抑制caspase-3和Bax的表达,而对p53却无明显的影响.HR24L基因过表达抑制过氧化氢和血清饥饿诱导的细胞凋亡,但对丁酸钠诱导的细胞凋亡却无抑制作用.结论:HR24L基因过表达抑制细胞凋亡.     

低剂量三氧化二砷对HepG2细胞p53基因转录水平的下调作用

目的：探讨低剂量三氧化二砷（As2O3）对p53启动子转录活性的调节作用。方法：确定p53启动子区域,聚合酶链反应（PCR）扩增p53p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-p53p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性;并以小同浓度三氧化二砷刺激HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果：成功克隆出614bp的新的p53启动子,pCAT3-p53p和不同浓度的三氧化二砷（0．25hcmoL／L）瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCATF3-Basic守载体的11．2倍,表明pCAT3-p53p具有强的启动子活性。选用0．25、0．5、2．5、5．0μmol／L浓度的三氧化二砷刺激pCAT3p53p转染的HepG2细胞,其CAT吸光度值分别为：0．076、0．186、0．149、0．1l9,CAT活性随着三氧化二砷浓度的倍增呈衰减趋势。结论：p53启动子有反式激活下游基因表达的活性,低剂量：三氧化二砷对p53基因转录水平具有下调作用。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点，诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据，做出准确诊断，给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂，腹腔内疾病占64．63％，共17种病因；腹腔外疾病占35．37％，共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查，在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。