表达ROG的重组腺相关病毒载体的构建及高滴度病毒的制备

目的:观察三叉神经痛(trigeminal neuralgia,TN)患者痛支神经的有髓纤维脱髓鞘处是否有河豚毒素不敏感型(tetrodotoxin-resistant,TTX-R)hNav1.8通道蛋白的异常表达,探讨其与三叉神经痛的关系.方法:以6例原发性TN第三支痛经保守治疗无效行手术治疗患者的下牙槽神经为研究对象,以舌颌颈联合根治术患者的耳大神经、下牙槽神经为阴性和正常对照,以鼠脊神经为阳性对照,运用免疫组化的方法观察hNav1.8通道蛋白在TN患者痛支神经与对照神经标本超微结构中的表达.结果:hNav1.8通道蛋白在TN患者痛支神经的有髓纤维脱髓鞘处有大量表达,鼠脊神经轴突内有少量表达,而正常下牙槽神经及耳大神经中无表达.结论:hNav1.8通道蛋白在TN患者痛支有髓纤维脱髓鞘处的异常表达可能与TN的发病有关.     

phP53-luc质粒的构建及其用于检测化学物质遗传毒性的初步分析

目的:构建2个分别由p53基因启动子和核心启动子驱动的荧光素酶报告基因表达质粒,并探讨其用于检测遗传毒性化学物质的可行性.方法:通过PCR扩增人p53基因启动子片段,然后采用重组DNA技术克隆入pGL3-BASIC的荧光素酶报告基因的上游而获得phP53-luc表达质粒.用脂质体转染法将phP53-luc转染入NIH 3T3细胞并分别用5-氟尿嘧啶(5-FU)处理,最后裂解细胞用Dual-Luciferase Reporter Assay System检测荧光素酶报告基因表达.结果:构建了2个分别由p53基因启动子和核心启动子驱动的荧光素酶报告基因表达质粒,位于这2个质粒上的荧光素酶报告基因在NIH 3T3细胞内的表达显著地受遗传毒性化学物质的诱导,其表达比对照的pGL3-BASIC载体上的荧光素酶报告基因高近240倍.结论:基于人p53基因启动子的荧光素酶报告基因分析系统可以用于快速检测环境毒物的遗传毒性.     

小鼠Retn基因siRNAs的设计及其稳定表达载体的构建

目的:设计小鼠Retn基因特异性的siRNAs,并构建一系列能在哺乳动物细胞内稳定表达这些siRNAs的表达质粒,以便为在体外研究Retn基因的功能打下基础.方法:(1)设计并合成小鼠Retn基因特异性的一组寡核苷酸片段,并克隆到pSilencerEM1.0-Neo载体;(2)用电穿孔转染和G418筛选等方法建立能稳定表达相应siRNAs的一组3T3-L1细胞克隆;(3)诱导细胞分化为脂肪细胞,并用RT-PCR分析这些脂肪细胞内Retn基因的mRNA水平.结果:设计并构建了4个小鼠Retn基因特异性的siRNAs表达质粒,并证明其中的2种质粒能在脂肪细胞内稳定表达相应的siRNAs,显著地抑制了这些脂肪细胞内Retn基因的mRNA水平.结论:本研究设计并构建出的小鼠Retn基因特异性的siRNAs表达载体,所表达的siRNAs具有较强的RNA干涉功能,为Retn基因的功能研究奠定了实验基础.     

地高辛标记的DNA探针检测核酸疫苗中宿主菌基因组DNA的含量

将合成的引物与宿主菌的染色体模板DNA进行PCR扩增的核糖体DNA片段,以地高辛进行标记,与待测DNA样品进行点杂交,确定制备的乙肝DNA疫苗中其宿主菌基因组含量<15 ng/μg质粒DNA.这提示地高辛标记的探针用于检测基因组DNA的方法灵敏、可靠.     

BCG-DNA对哮喘患者外周血单个核细胞IFN-γ和IL-4产生的作用

目的:研究免疫活性物质卡介苗基因组DNA(BCG-DNA)对哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC) IFN-γ和IL-4产生的影响.方法:分离哮喘患者PBMC,分别加入BCG-DNA、地塞米松刺激培养,ELISA检测培养上清中IFN-γ及IL-4含量,RT-PCR检测PBMC IFN-γ mRNA及IL-4 mRNA的表达量,并与空白对照组相比较.结果:地塞米松在体外对哮喘患者PBMC产生的IFN-γ mRNA和蛋白、IL-4 mRNA和蛋白均有抑制作用;BCG-DNA抑制哮喘患者PBMC IL-4 mRNA和蛋白的分泌,而促进IFN-γ mRNA和蛋白的分泌,与对照组比较差异显著(P<0.01),且在体外对PBMC无毒性.结论:BCG-DNA不仅具有和地塞米松相同的下调IL-4表达的作用,而且还具有地塞米松所没有的诱导IFN-γ表达的作用,利于纠正哮喘患者体内存在的Th1/Th2比例失衡状态,起到治疗作用.     

IL-2调节人外周血T淋巴细胞CTLA-4表达

目的 探讨人外周血T淋巴细胞CTLA-4的表达情况及IL-2对其表达的调节作用。方法 采用流式细胞仪定量测定人外周血T淋巴细胞内及细胞膜上CTLA-4的水平，半定量RT-PCR检测T淋巴细胞内CTLA-4mRNA的水平，并在体外用IL-2刺激T淋巴细胞后观察CTLA-4及CTLA-4mRNA水平的变化。结果 人外周血T淋巴细胞膜表面几乎不表达CTLA-4，7．6％-18．0％的T淋巴细胞有胞内表达，CD4^ T淋巴细胞表达CTLA-4的阳性比例略高于CD8^ T淋巴细胞；人T淋巴细胞可溶性形式的CTLA-4mRNA半衰期短于全长CTLA-4mRNA；IL-2可以通过诱导人T淋巴细胞CTLA-4mRNA的转录上调CTLA-4的表达，IL-2诱导的细胞多为CD25^ T淋巴细胞。结论 CTLA4多存在于人外周血T淋巴细胞内，参与T淋巴细胞活化过程的调节。IL-2的免疫抑制作用可能与其诱导T淋巴细胞内CTLA-4mRNA转录，从而上调CTLA-4的表达有关。     

CpG-ODN气道内应用抑制哮喘小鼠过敏性气道炎症及GATA-3的表达

目的　研究气道内应用CpG寡脱氧核苷酸 (CpG ODN)对小鼠哮喘模型气道过敏性炎症的治疗作用及对肺内GATA 3表达的影响。方法　鸡卵蛋白 (OVA)免疫BALB c小鼠建立哮喘模型 ,激发后 1h气道内滴入 10 0 μgCpG ODN ,处死动物后观察支气管肺泡灌洗液 (BALF)中白细胞总数、嗜酸性粒细胞百分比 (EOS % )的变化及IL 4、IL 5、IL 12、IFN γ的含量变化。取肺组织行病理切片HE染色、AB PAS染色检查 ,观察小鼠气道炎症情况 ,免疫组化染色观察CpG ODN对小鼠哮喘模型肺部GATA 3表达的影响。结果　CpG ODN治疗组BALF中IL 12和IFN γ的产生增加 ,IL 4、IL 5的产生减少 ,BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞比例降低 ,肺部炎症情况明显减轻 ,肺血管周围及支气管周围表达GATA 3的细胞数较哮喘模型组及对照寡核苷酸治疗组明显减少。结论　哮喘小鼠激发阶段气道内滴入CpG可能通过诱导IL 12、IFN γ产生 ,抑制GATA 3的表达 ,导致TH2型细胞因子的产生减少 ,从而减轻哮喘气道过敏性炎症。     

56609株钩体lipL32基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的初步表达

钩体病是一种临床表现多样的人兽共患疾病 ,致病性钩端螺旋体 (钩体 )根据交叉凝集反应被分为2 5个血清群和大约 2 5 0个血清型。如此多血清型的钩体所引起的临床症状和体征复杂多样 ,经常造成误诊而延误治疗。因此 ,建立一种简单、快捷、敏感、特异的诊断方法很有必要。钩体的诊断或依赖于检测血清中的抗体或检测组织或体液中的病原体。由于分离钩体不但困难而且费时 ,所以血清学的诊断是一种应用最广泛的方法。与经典的MAT等方法相比 ,ELISA方法具有简单、快捷、敏感、特异等优点 ,但是检测用抗原的选择是决定该方法特异性和敏感性的…     

卡介苗基因组DNA对哮喘小鼠模型过敏性气道炎症的影响

目的探讨腹腔注射卡介苗基因组DNA(BCGDNA)对哮喘小鼠模型的影响。方法BALB/c小鼠经鸡卵蛋白(OVA)免疫建立哮喘模型,分别于致敏前、激发时腹腔注射100μgBCGDNA,观察哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和嗜酸性粒细胞数(EOS),ELISA检测脾单核细胞(SMNC)培养上清和BALF中白细胞介素4(IL4)、IL5、IL12及γ干扰素(IFNγ)的含量变化,常规病理切片观察肺内炎症情况,ABPAS染色观察杯状细胞增生和黏液分泌情况。结果哮喘小鼠OVA致敏前及激发时腹腔注射BCGDNA后可明显增加BALF和脾单核细胞培养上清中IL12和IFNγ的产生,使IL4和IL5的产生减少,BALF中嗜酸性粒细胞减少,黏液过度分泌明显减轻。结论哮喘小鼠腹腔注射BCGDNA可诱导IL12和IFNγ产生,抑制Th2型细胞反应,减轻哮喘气道炎症。