血红素加氧酶1分子克隆及表达载体的构建

背景:近年来许多研究发现血红素加氧酶1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用,并且在心肌缺血-再灌注损伤等应激反应中有重要的保护作用,从而成为研究热点.目的:克隆大鼠血红素加氧酶1全长基因,并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接,构建血红素加氧酶1的真核表达载体.设计、时间及地点:实验于2008-03/06在苏州大学生物技术研究所完成.材料:成年雄件SD大鼠,由苏州大学动物实验中心提供,用于脾脏细胞总RNA的提取;克隆载体PMDl8-T购自Takara公司;表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学生物技术研究所保存.方法:分离大鼠脾脏获取脾脏细胞,Trizol法提取脾脏细胞的总RNA,经反转录一聚合酶链反应扩增获得血红素加氧酶1基因,将扩增出来的产物与克隆载体PMDl8.T连接,转化TOP10感受态细菌,挑取阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序确证.测序正确后抽提质粒作为模板进行PCR,Sal-Ⅰ和BamH-Ⅰ同时双酶切PCR产物和载体PIRES2-EGFP,再在T4 DNA连接酶的作用下进行连接,构建其真核表达载体.主要观察指标:血红素加氧酶1基因的克隆和DNA测序结果证实序列是否正确;PIRES2.EGFP/血红素加氧酶1真核表达载体的构建以及测序证实目的基因成功插入载体.结果;①实验完成了大鼠血红素加氧酶1基因的克隆,所获得的序列与GeneBank中收录的大鼠血红素加氧酶1序列完全一致.②构建真核表达载体PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1,测序正确说明血红素加氧酶1基因成功插入表达载体PIRES2-EGFP中.结论:实验成功克隆了大鼠血红素加氧酶1基因全长,并构建了其真核表达载体.     

不同浓度二十二碳六烯酸对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道的激活作用及其机制

目的:探讨不同浓度二十二碳六烯酸(DHA)对正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾离子通道(BK通道)的激活作用及其机制?方法:酶消化法分离正常大鼠冠状动脉平滑肌细胞?采用全细胞膜片钳实验技术记录在未孵育与孵育细胞色素P450环氧化酶抑制剂SKF525A并灌流不同浓度DHA条件下BK通道电流密度变化;采用单通道膜片钳实验技术记录灌流不同浓度DHA时BK单通道开放概率的变化?结果:0.01~1.00 μmol/L(定义为低浓度)DHA激活BK通道的半效浓度(EC50)为(0.24 ± 0.05)μmol/L,但经SKF525A孵育后激活作用消失;3.00~10.00 μmol/L(定义为高浓度)DHA激活BK通道的EC50为(2.38 ± 0.22)μmol/L,经SKF525A孵育后,激活作用仍存在,且EC50无明显变化?在电极外液钙离子浓度为1 μmol/L和刺激电位60 mV条件下,DHA浓度为0?0.01?0.03?0.10?0.30?1.00 μmol/L时,BK通道开放概率分别为 (0.095 2 ± 0.009 5)?(0.093 9 ± 0.012 6)?(0.098 6 ± 0.016 9)?(0.099 5 ± 0.014 7)?(0.097 5 ± 0.010 4)和(0.102 3 ± 0.020 6)(P > 0.05,n=5),提示低浓度DHA不能激活BK单通道;继续增加DHA浓度,当浓度为3?10 μmol/L时,BK单通道开放概率分别为(0.700 3 ± 0.013 2)和(0.892 7 ± 0.052 3)(P < 0.05,n=5),提示高浓度DHA呈浓度依赖性激活BK单通道,EC50为(3.37 ± 0.10)μmol/L?结论:不同浓度DHA激活BK通道的机制不同,低浓度DHA通过细胞色素P450环氧化酶途径激活BK通道,高浓度DHA可能通过与BK通道结合后直接激活?     

不同浓度胎牛血清对原代心肌成纤维细胞增殖及分化的影响

目的: 探讨不同浓度胎牛血清体外培养对原代心肌成纤维细胞增殖和分化的影响。方法: 用酶消及差速贴壁法分离并培养SD乳鼠心肌成纤维细胞;采用不同浓度胎牛血清（1%、5%、10%和20%）培养心肌成纤维细胞并观察细胞形态,免疫荧光共聚焦法检测α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）蛋白表达,划痕实验检测心肌成纤维细胞的迁移能力,CCK8实验检测心肌成纤维细胞的增殖能力。结果: 随着胎牛血清浓度升高,细胞形态逐渐变圆,细胞表面积增加,α-SMA阳性细胞比例增加,心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化增多,细胞迁移能力增加。高浓度胎牛血清（20%）培养时心肌成纤维细胞增殖能力最旺盛,低浓度胎牛血清（1%）培养时心肌成纤维细胞增殖能力最低,5%和10%胎牛血清培养时心肌成纤维细胞增殖均旺盛。结论: 高浓度胎牛血清培养会导致心肌成纤维细胞分化,5%胎牛血清培养心肌成纤维细胞较10%和20%胎牛血清培养分化程度少,增殖能力较1%胎牛血清好,选用5%胎牛血清培养心肌成纤维细胞较好。     

血红素加氧酶1分子克隆及表达载体的构建

背景：近年来许多研究发现血红素加氧酶1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用,并且在心肌缺血-再灌注损伤等应激反应中有重要的保护作用,从而成为研究热点。 目的：克隆大鼠血红素加氧酶1全长基因,并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接,构建血红素加氧酶1的真核表达载体。 设计、时间及地点：实验于2008-03/06在苏州大学生物技术研究所完成。 材料：成年雄性SD大鼠,由苏州大学动物实验中心提供,用于脾脏细胞总RNA的提取;克隆载体PMD18-T购自Takara公司;表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学生物技术研究所保存。 方法：分离大鼠脾脏获取脾脏细胞,Trizol法提取脾脏细胞的总RNA,经反转录-聚合酶链反应扩增获得血红素加氧酶1基因,将扩增出来的产物与克隆载体PMD18-T连接,转化TOP10感受态细菌,挑取阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序确证。测序正确后抽提质粒作为模板进行PCR,Sal-Ⅰ和BamH-Ⅰ同时双酶切PCR产物和载体PIRES2-EGFP,再在T4 DNA连接酶的作用下进行连接,构建其真核表达载体。 主要观察指标：血红素加氧酶1基因的克隆和DNA测序结果证实序列是否正确;PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1真核表达载体的构建以及测序证实目的基因成功插入载体。 结果：①实验完成了大鼠血红素加氧酶1基因的克隆,所获得的序列与GeneBank中收录的大鼠血红素加氧酶1序列完全一致。②构建真核表达载体PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1,测序正确说明血红素加氧酶1基因成功插入表达载体PIRES2-EGFP中。 结论：实验成功克隆了大鼠血红素加氧酶1基因全长,并构建了其真核表达载体。     

超声介导不同种类微泡破裂对基因转移的影响

基因治疗目前在治疗基因缺陷疾病、肿瘤、炎症以及其他临床疾病方面显示出巨大潜力,但作为一种有效的方法,其成功与否很大程度上取决于它所使用的载体是否能以最小的毒性、有效地、选择性地将靶基因转移到靶细胞或靶组织.     

聚乙烯亚胺修饰的白蛋白微泡转染CHO细胞实验研究

目的:制作非病毒基因转移载体,提高白蛋白微泡转基因效率。方法:采用人体白蛋白、聚乙烯亚胺(PEI)和葡萄糖按一定的质量比混合后用超声振动仪声振20s制得PEI修饰的白蛋白微泡(PAMB),通过流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞比率以比较PEI、PEI+白蛋白、PAMB和Lipofectamine2000的基因转移效率。结果:单纯PEI组、白蛋白+PEI组、PAMB组和Lipofectamine2000组的平均转基因效率分别为(13.75±4.88)%、(5.20±1.15)%、(49.17±6.75)%和(53.72±5.69)%。PAMB组明显高于单纯PEI组,而与商品化Lipofectamine2000组没有统计学差异。结论:经PEI修饰后的白蛋白微泡转基因效率明显提高,是一种有效的体外基因转移载体,本研究也可能为在体基因转移提供新的方法。     

超声介导不同种类微泡破裂对基因转移的影响

基因治疗目前在治疗基因缺陷疾病、肿瘤、炎症以及其他临床疾病方面显示出巨大潜力,但作为一种有效的方法,其成功与否很大程度上取决于它所使用的载体是否能以最小的毒性、有效地、选择性地将靶基因转移到靶细胞或靶组织.     

磁导航指导下持续性心房颤动导管消融术后复发因素的分析

目的探讨磁导航指导下持续性心房颤动(房颤)导管消融患者术后复发的危险因素。方法在磁导航指导下,对49例持续性房颤患者行双侧肺静脉前庭电隔离+左心房顶部和二尖瓣峡部线性消融术。术后随访一年,分为房颤复发组(n=21)和房颤未复发组(n=28),比较两组患者手术操作时间、建模时间、肺静脉隔离时间、X线暴露时间、肺静脉前庭隔离急性成功率、手术相关并发症发生率及49例患者术后1个月、3个月、6个月和12个月的房颤复发率。结果 49例患者均成功实施左心房建模、标测和消融;复发组和未复发组手术操作时间、建模时间、肺静脉隔离时间、消融时间、X线暴露时间和肺静脉前庭隔离急性成功率差异均无统计学意义(P0.05)。两组患者均未发生肺静脉狭窄、心脏穿孔、心包填塞和猝死等严重并发症。随访一年,持续性房颤消融成功率为57.1%;Cox回归分析提示术前房颤发作时间及合并冠心病与术后房颤复发有关。结论磁导航指导下持续性房颤导管消融具有较高的有效性和较好的安全性。术前房颤持续时间及合并冠心病是术后持续性房颤复发的独立危险因素。     

四维超声定量技术评价不同分级肝硬化患者左房容积和功能的特征 #br#

目的探讨四维超声定量技术评价不同程度肝硬化患者左房容积和应变功能变化的价值。 方法纳入肝硬化患者60例,按照Child-Pugh分级分为Child-Pugh A组26例、Child-Pugh B组19例和Child-Pugh C组15例,对照组为60例同期健康体检者。应用四维超声左房定量技术（4D LAQ）检测,获得左房最大容积（LAVmax）、左房最小容积（LAVmin）及左房收缩前容积（LAVpreA）,计算出左房每搏量（LAEV）和左房整体射血分数（LAEF）;获取左室收缩期、舒张早期和舒张晚期的左房心肌纵向应变（LASr、LAScd 和 LASct）和圆周峰值应变参数（LASr_c、LAScd_c 和LASct_c）;同时测量常规超声参数：左房内径（LAD）、左室舒张末期内径（LVEDD）和左室射血分数（LVEF）等。 结果与对照组相比,肝硬化各组的左房四维容积参数LAVmax、LAVmin、LAVpreA及LAEV均显著升高（P＜0.01）。肝硬化Child-Pugh A组患者的LASr、LASct、LASr_c和LASct_c的绝对值较对照组增大（P＜0.01）,LAScd和LAScd_c的绝对值与对照组差异无统计学意义。Child-Pugh B和Child-Pugh C组患者LASr、LASct、LASr_c和LASct_c的绝对值均较Child-Pugh A组下降,LAScd和LAScd_c的绝对值较对照组降低（P＜0.05）。相关分析显示LAVmax、LAVmin和LAVpreA与肝硬化分级均呈正相关（rs分别为0.383、0.325、0.302,P＜0.05）,LASr、LAScd、LASct、LASr_c、LAScd_c和LASct_c的绝对值与肝硬化的分级均呈负相关（rs分别为-0.387、-0.463、-0.623、-0.365、-0.456、-0.467,P＜0.01）。结论 四维超声左心房定量技术可敏感评价左房的结构和功能变化,为肝硬化心肌病患者早期诊断、治疗干预和疗效评价提供可靠的证据。