异种冻存肝细胞移植治疗急性肝衰的可行性研究

目的：探讨冻存猪肝细胞移植治疗大白鼠急性肝衰的可行性。方法：将猪肝细胞在液氮中冻存１５０ｄ后移植给切除８０％肝叶的大鼠。结果：冻存肝细胞活率为冻前的７８％，光、电镜显示细胞完整，细胞内糖原和葡萄糖－６－磷酸酶丰富。移植组鼠的存活率为１６／ｌ７，明显高于对照组３／９，Ｐ＝０．００２。但肝衰后２和７ｄ的两组间残肝重量及肝功能生化值并无显著差异。结论：冻存猪肝细胞移植可治疗急性肝衰，其作用机理可能是综合效应的结果。     

深低温在肝细胞移植中减轻免疫排斥反应的作用

目的：探讨深低温减轻肝细胞移植免疫排斥作用。方法：抗体依赖性细胞毒性（ＡＤＣＣ）检测猪肝细胞溶解率，圆二色测定其膜蛋白构象。移植新鲜或冻存猪肝细胞于肝衰鼠腹腔内，并行ＳＤ鼠冻存肝细胞同种移植，观察鼠存活率。结果：ＡＤＣＣ显示新鲜细胞数０．２４×１０５，冻存细胞０．６８×１０５；新鲜肝细胞膜蛋白中α螺旋为４７．５％，液氮处理后，α螺旋增至５６．５％。肝衰鼠３３．３％存活，新鲜猪肝细胞移植鼠６６．７％；移植冻存猪肝细胞后，存活率显著提高到９４．１％，但与ＳＤ鼠冻存肝细胞同种移植组（７１．４％）间无显著差异。结论：深低温使膜蛋白中α螺旋增加，并导致移植细胞的免疫反应原性降低；冻存肝细胞移植可提高急性肝衰治愈率。     

猪肝细胞膜蛋白结构与异种移植细胞免疫反应原性的关系

目的:探讨猪肝细胞膜蛋白结构与异种移植细胞免疫反应原性的关系.方法:肝衰大鼠分为冻存细胞移植组(17只)、新鲜细胞移植组(9只)和对照组(9只,不移植肝细胞),腹腔内分别移植新鲜和冻存的猪肝细胞,记录鼠的存活率.圆二色光谱测定新鲜和冻存猪肝细胞的膜蛋白构象,抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)试验检测肝细胞破损情况.结果:对照鼠存活3只(3/9),新鲜细胞移植鼠存活6只(6/9);移植冻存肝细胞后,存活16只(16/17),显著高于对照鼠,P＝0.002 2.新鲜肝细胞膜蛋白构象中α螺旋比率为47.5%,经液氮处理后,α螺旋增至56.5%;ADCC显示存活的新鲜细胞数为0.24×105,冻存细胞0.68×105.结论:异种移植细胞免疫反应原性的降低与肝细胞膜蛋白中α螺旋比率增高有关.     

猪肝细胞膜蛋白结构与异种移植细胞免疫反应原性的关系

探讨猪肝细胞膜蛋白结构与异种移植细胞免疫反应原性的关系。方法：肝衰大鼠分为冻存细胞移植值,新鲜细胞移植组和对照组,腹腔内分别移植新鲜和冻存的猪肝细胞,记录鼠的存活率。圆二色光谱测定新鲜和冻存猪肝细胞的膜蛋白构象,抗体依赖性细胞毒性试验检测肝细胞破损情况。     

深低温在肝细胞移植中减轻免疫排斥反应的作用

探讨深低温减轻肝细胞移植免疫排朱作用。方法：抗体依赖性细胞毒性检测猪肝细胞溶解率，圆二色测定其膜蛋白要象。移植新鲜或冻存猪肝细胞于肝衰鼠腹腔内，并行ＳＤ鼠东存肝细胞同种移植，观察鼠存活率。结果；ＡＤＣＣ显示新鲜细胞数０．２４×１０＾５，冻存细胞０．６８×１０＾５，新鲜肝细胞膜蛋白中α螺旋为４７．５％，液氮处理后，α螺旋增至５６．５％。     

原代大鼠肝细胞分离方法与冻存条件的优化

目的 :优化原代大鼠肝细胞 (PRH)分离方法与冻存条件。方法 :建立低浓度胶原酶原位循环灌流法分离肝细胞 ;分别采用含 2 %与l0 %DMSO的冻存液于 - 70℃或液氮中冻存PRH ,并比较各组冻存后PRH活力。结果 :1.该分离方法肝细胞产量为 1.5 84± 0 .5 2 5× 10 8/10 0g大鼠体重 ,存活率达 95 .2± 2 .9% ,肝细胞纯度 >95 % ,胶原酶用量减少为 4 .5mg/10 0 g大鼠体重。 2 .含 2 %DMSO冻存液于 - 70℃组与液氮组PRH存活率均可达 90 %～ 95 % ;ALB冻存 14d - 70℃组PRH明显高于液氮组与新鲜分离组 ,LDH值于冻存 7d的 - 70℃组与液氮组明显低于新鲜分离组 ,其它各组间均无显著差异。结论 :低浓度胶原酶原位循环灌流法为高效的PRH分离技术 ;含 2 %DMSO冻存液于 - 70℃可作为原代肝细胞冻存的理想条件。     

乳猪肝细胞-196 ℃保存的初步研究

目的探索适合于乳猪肝细胞-196 ℃冷冻保存的条件和方法.方法体外分离新生乳猪肝细胞,以含不同浓度二甲亚砜(DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存.2个月后复苏接种培养,对其存活率、贴壁率、尿素合成能力、猪白蛋白mRNA的表达等进行检测,并观察其形态结构变化.结果不同DMSO浓度保存猪肝细胞复苏后的活力及形态均有所不同, 其中含5% DMSO冻存液组保存效果最差;10%组次之;15%组最佳.15% DMSO冻存液组复苏后肝细胞的存活率为(83±4)%,贴壁率是(81±5)%,细胞形态与未冻存组相似,均保持较强的尿素合成能力及猪白蛋白mRNA的表达,较5%与10% DMSO冻存液组有显著性差别(P<0.05).冻存时肝细胞浓度为(5～10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组.结论 15% DMSO浓度适合于乳猪肝细胞的长期保存.高浓度组猪肝细胞的冻存效果优于低浓度组.     

微囊化猪肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝功能支持的实验研究

目的:探讨微囊化猪肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的效果。方法:采用原位胶原酶循环肝灌注法分离中国实验用小型猪肝细胞,海藻酸钠-氯化钡法微囊化。应用D-氨基半乳糖(D-gal)1.2g/kg体重腹腔内注射制作SD大鼠急性肝衰竭模型。急性肝衰竭大鼠随机分为3组。注药24h后分别将PRMI1640培养液2ml腹腔注射为对照组(1组)、2ml游离猪肝细胞(2×107个/ml)腹腔内移植组(2组)、2ml微囊化猪肝细胞(2×107个/ml)腹腔内移植组(3组)。观察移植后大鼠14天存活率、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TB)的改变。结果:肝细胞移植后大鼠14天存活率:1组为20.0%(5/25),2组为66.7%(16/24),3组为76.0%(19/25),3组间差异有显著性(P<0.05)。移植后第1天1组ALT、TB和移植前相比差异无显著性,2、3组ALT、TB下降。第4天3组ALT、TB均继续下降,2、3组低于1组(P<0.05),2、3两组间差异无显著性(P>0.05)。移植后第7天,ALT进一步下降,3组间差异有显著性(P<0.05);TB3组显著低于2组和1组(P<0.05),2组低于1组但差异无显著性(P>0.05)。移植后第14天,肝功能均明显恢复,ALT、TB2、3组均低于1组(P<0.05),2、3两组间差异无显著性(P>0.05)。结论:微囊化猪肝细胞腹腔内移植可以提高药物诱导急性肝衰竭大鼠的存活率,改善ALF大鼠的肝功能。     

液氮冻存不同时间大鼠带瓣管道对其活性和组织中IGF-1水平的影响

目的:观察、研究液氮冻存不同时间的大鼠带瓣管道的活性和其组织中胰岛素样生长因子(IGF-1)的水平,提供一种检测带瓣管道活性的新思路.方法:Wistar大鼠60只,随机分为新鲜组(A组),-196℃液氮冻存1个月(B组),冻存3个月(C组).取材处理后检测其葡萄糖代谢、管道结构及组织中IGF-1水平的变化.结果:大鼠带瓣管道的3组葡萄糖代谢率测定,A组(3.812±0.4768)mmol/L、B组(3.826±0.3495)mmol/L、C组(3.655±0.3736)mmol/L比较,差异无统计学意义(P＞0.05);IGF-1在带瓣管道中的表达分别为35％、30％、30％,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:液氮冻存后的大鼠带瓣管道活性良好,提示IGF-1的表达水平可作为评价带瓣管道活性的指标.     

大鼠肝细胞移植对受鼠肝脏增生的影响

实验选用Wistar成年大鼠及胎鼠为肝细胞移植供鼠,SD成年大鼠为肝细胞移植受鼠,观察成年鼠及胎鼠肝细胞移植对受鼠肝脏增生的影响,发现接受胎鼠肝细胞移植鼠的肝重量于移植后24小时,肝细胞分裂指数及肝组织~3H-TdR掺入量于移植后24、48小时均高于对照组及接受成年鼠肝细胞移植组鼠,而成年鼠肝细胞移植组与对照组无明显差异,表明胎鼠肝细胞移植     

苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞的实验研究

目的 应用苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞,观察苦参碱对大规模低温冻存人胎肝细胞功能的影响。方法 改良肝细胞获取方法分离人胎肝细胞,经过1h预培养后。将5种不同浓度（1×107,2.5×107,5×107,7.5×107,10×107)的胎肝细胞以6mg/L苦参碱+5%DMSO冻存保护液置于骨髓干细胞冻存袋在液氮中冷冻保存1个月。1个月后复苏,进行活率、形态学及功能检测。结果 五种不同浓度的细胞冻存一月后,细胞浓度为2.5×107/ml组复苏后存活率与其余四组相比差异有统计学意义（P<0.05）且明显高于其余四组。复苏后细胞存活率和24h贴壁率分别为73%、69%,经过短期培养后,细胞功能逐渐恢复。结论 (1苦参碱对低温冻存之人胎肝细胞有保护作用,与二甲基亚砜联合使用可降低后者的浓度;（2）以5%DMSO+6mg/L苦参碱作为冻存保护剂,细胞浓度在2.5×107冻存效果最佳。该大规模冻存方法基本上可以满足生物人工肝肝细胞应用的需求。     

PLA-O-CMC纳米粒子培养的猪肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝再生作用的初步研究

目的:探讨胶原凝胶包埋聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖(PLA-O-CMC)纳米粒子粘附培养猪肝细胞移植对急性肝衰竭(ALF)大鼠肝的再生作用。方法:D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠ALF模型;48h后分别将5mlⅠ型胶原凝胶包埋的PLA-O-CMC纳米粒子粘附培养24h猪的肝细胞、5mlⅠ型胶原凝胶固定培养24h的猪肝细胞、5ml培养24h的猪肝细胞悬液(均含5.0×107个)移植到各组ALF大鼠腹腔内,并以5mlRPMI1640腹腔内注射作为阴性对照。观察大鼠14天存活率和受体肝脏的病理变化。结果:移植后14天ALF大鼠的存活率:单纯肝细胞移植组(Ⅰ组)为56.25%,胶原肝细胞移植组(Ⅱ组)为62.5%,纳米胶原肝细胞移植组(Ⅲ组)为75%,阴性对照组(Ⅳ组)为18.75%,各移植组14天存活率高于对照组(P<0.05),各移植组间无统计学意义(P>0.05)。ALF大鼠肝脏再生于ALF后5～7天最为显著;各组肝脏病理变化以Ⅲ组恢复最好,双核细胞最多,肝再生最快。结论:应用PLA-O-CMC纳米粒子和Ⅰ型胶原联合培养猪肝细胞移植于ALF大鼠腹腔内能促进肝脏的再生。     

自体肝细胞脾内移植治疗急性肝衰竭的实验研究

目的 探索临床应用自体肝细胞脾内移植治疗急性肝衰竭的新路。方法 用Wistar大白鼠制备急性外科型肝衰竭漠型,采用肝中叶门静脉分枝插管,用Ⅰ型胶原酶灌注制备游离肝细胞,行自体肝细胞脾内移植。结果 病理组织学观察移植组10wk后大鼠脾内有弥散状、团状或单排列状肝细胞存在;同位素^99mTc-HIDA测定证实其肝功能接近正常;对照组术后24h死亡30％,48h累计死亡55％．移植组分别为20％和30％。结论 实验提示脾内移值肝细胞可以存活且有一定代谢功能．能显提高急性肝衰竭大鼠的存活率。     

冷冻猪肝细胞在生物型人工肝系统中的生存状态研究

目的研究冷冻复温后猪肝细胞在生物型人工肝支持系统(BALSS)中的生存状态.方法用酶法从中国实验用小型猪肝脏分离出猪肝细胞;将1×1010猪肝细胞冷冻保存在-196 ℃液氮中;1个月后复温,将等量的冷冻和新鲜猪肝细胞分别培养在BALSS中,比较其形态、存活率和白蛋白、尿素、葡萄糖合成功能及对利多卡因的转化功能.结果冷冻保存的猪肝细胞,复温后其存活率较高;在培养于BALSS时其生化功能、利多卡因转化功能及超微结构与新鲜肝细胞类似.结论用该冻存方法保存的猪肝细胞可试用于BALSS系统.     

完全动脉化辅助性肝移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究

目的　探讨辅助性肝移植门静脉动脉化加肝动脉血供对急性肝功能衰竭治疗作用。方法　切除85 %肝脏诱导大鼠肝衰 ,将 30 %肝脏移植于残肝下方 ,通过右肾动脉行移植肝门静脉动脉化并建立肝动脉血供。观察肝衰组和移植组大鼠存活率、肝功能和结构改变。结果　移植组 2周存活率为 73 3% ,肝衰组 4 8h存活率 0 % (P <0 0 5 )。移植术后 14d残肝明显增生 ,肝功恢复正常 ,移植肝萎缩纤维化。结论　辅助性肝移植门静脉动脉化为急性肝功衰竭提供了有效的支持作用 ,使原肝再生功能恢复而移植肝萎缩     

解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠Caspase-8、BID的影响

目的解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠Caspase-8、Bid的影响。方法将急性肝衰动物模型随机分成模型组、裸肝细胞移植组、微囊化肝细胞移植组、解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植组。造模后24 h、48 h、72 h、120 h和168 h测定ALT、AST,免疫组化法检测Caspase-8、Bid表达。结果解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植组ALT、AST下降,48 h、72 h与裸肝组、微囊组比较差异有统计学意义(P<0.05);解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植组Caspase-8、Bid表达下降,48～168 h较裸肝组、微囊组有统计学意义(P<0.05)。结论解毒活血汤联合微囊化肝细胞移植显著改善肝衰大鼠肝功能及预后。     

微囊化异种肝细胞移植对药物性肝衰的治疗作用及免疫隔离机制的初步研究

目的 :探讨微囊化异种肝细胞脾内移植对药物性肝衰大鼠的治疗作用 ;测定受体存活率、肝功能的变化及CD4 ,CD8的变化。方法 :海藻酸钠体外包裹经胶原酶技术制备的异种 (豚鼠 )肝细胞为供体 ,SD大鼠为受体 ,D -氨基半乳糖 (19.5ml/kg)腹腔内一次性注射 ,制作肝衰模型。 4 8h后将微囊化的游离豚鼠肝细胞 (1.5× 10 7)移植于大鼠脾脏内。以豚鼠裸肝细胞 (1.5× 10 7)移植及生理盐水1.2ml脾脏注射为对照。移植后 14d观察存活率、肝功能及肝脏病理情况 ,免疫组化ABC法测定CD4 ,CD8的变化。结果 :微囊化肝细胞移植组存活率 80 % ,明显高于生理盐水组 (2 5 % )和裸肝细胞移植组(70 % )。 (P <0 .0 1　V　P <0 .0 5 )。微囊肝细胞移植组 14d总胆红素 (7.99± 0 .5 8mg/L)和ALT(5 5±6 .7u) ,明显低于生理盐水组 (9.6 3± 0 .83mg/LV 91± 8.0u)和裸肝细胞组 (8.9± 0 .6 6mg/LV 74± 7.1u)(P <0 .0 5VP <0 .0 1)。移植后 12h ,72h ,14d分别测定受体脾脏CD4 ,CD8淋巴细胞 ,微囊化肝细胞组72h ,14d呈阳性。裸肝细胞组均呈阳性。结论 :大鼠药物性肝衰微囊化肝细胞脾内移植后维持存活率14d ,细胞免疫参与排斥反应 ,肝细胞微囊化处理可延迟细胞免疫的发生时间。     

异种肝细胞脾内移植海藻酸钠包裹最佳浓度及免疫隔离机制的初步研究

目的:探讨微囊化异种肝细胞脾内移植对药物性肝衰大鼠的治疗过程中海藻酸钠包裹移植肝细胞的最佳浓度;观察受体存活率,测定肝功能及CD4,CD8的变化。方法:分别以浓度为5.0%、1.5%、0.15%的海藻酸钠悬液体外包裹经胶原酶技术制备的异种(豚鼠)肝细胞为供体,SD大鼠为受体,D-氨基半乳糖(19.5ml/kg)腹腔内一次性注射,制作肝衰模型。48h后将三组微囊化的游离豚鼠肝细胞(1.5×107个)分别移植入大鼠脾脏内。以生理盐水1.2ml脾脏注射为对照。移植后48h、96h观察存活率,肝功能、免疫球蛋白及肝脏病理情况,免疫组化ABC法测定CD4,CD8的变化。结果:微囊化肝细胞移植组存活率分别为50.0%、80.0%、90.0%,明显高于生理盐水组(25.0%)(P<0.01)。移植后96h测定总胆红素和AST显示:在不同浓度的三组微囊化移植肝细胞中,0.15%的海藻酸钠包裹组明显低于其它各组及对照组。移植后48h、96h,分别测定受体脾脏CD4,CD8淋巴细胞,0.15%微囊包裹组96h呈阳性,1.5%、5.0%包裹组48h均呈阳性。结论:大鼠药物性肝衰微囊化肝细胞脾内移植海藻酸钠包裹浓度为0.15%,细胞免疫参与排斥反应,包裹浓度过高影响移植肝细胞功能及免疫隔离效果。     

CTLA4-Ig诱导大鼠同种肝细胞移植免疫耐受的实验研究

目的研究CTLA4-Ig诱导在D-氨基半乳糖致急性肝功能衰竭大鼠脾内同种异体肝细胞移植的免疫耐受。方法急性药物性肝衰模型:用10%D-氨基半乳糖溶液按1.0 g/kg一次性大鼠腹腔注射;用Ⅳ型胶原酶肝脏原位灌注,制备肝细胞悬液,浓度为4×107/ml,2 h内经脾移植;24只用D-氨基半乳糖诱导的急性肝衰大鼠,24 h后均进行经脾同种异体肝细胞移植,然后随机分为两组,一组为治疗组,腹腔一次性注射CTLA4-Ig,另一组为对照组,不予处理。两组均分别于术后第1,3,5,7天观察IL-2、TNF、肝功能及脾脏HE染色的变化。结果治疗组与对照组比较,术后治疗组IL-2含量明显下降,差异有显著性,P<0.05;术后TNF含量两组之间差异无显著性,P>0.05;术后肝功能治疗组比对照组下降明显,P<0.05。组织学改变:术后第7天治疗组仍可见肝细胞或肝细胞团,对照组脾内见大量淋巴细胞浸润,但很少见肝细胞。结论CTLA4-Ig能诱导大鼠经脾同种异体肝细胞移植的免疫耐受,促使急性肝衰大鼠肝功能得到改善。     

肝细胞脾内移植治疗大鼠肝衰竭

目的:优化急性肝衰竭模型的构建方法及探讨经脾内同种异体肝细胞移植治疗大鼠急性药物性肝衰竭的疗效,并观察脾内移植肝细胞的生物学活性。方法:采用D-氨基半乳糖(D-gal)建立大鼠急性药物性肝衰竭模型。腹腔注射不同剂量的(1.0,1.2,1.4,1.6g/kg)D-gal后,以肝功能指标、病理形态学、死亡率等综合评估肝脏细胞损伤的状态,确定模型构建的最佳方案。造模后24h,随机分为2组进行治疗,Ⅰ组:经脾内移植肝细胞悬液1ml(4.4×107个);Ⅱ组:经脾内移植不含肝细胞的培养液1ml。观察大鼠1周的存活率、肝脏功能和病理变化及移植肝细胞的生物学活性。结果:①不同剂量的D-gal可导致不同程度的肝损伤,而以1.2g/kgD-gal造模组的大鼠死亡率适中,肝功能损害及其肝脏病理组织学改变均符合临界急性肝衰竭的程度,较好地模拟了急性肝衰竭的病理生理改变且稳定性较好。②移植后3d,Ⅰ组与Ⅱ组大鼠存活率相比具有显著性差异(P<0.01);肝功能指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBiL)均有明显改善(P<0.01);肝组织病理切片显示:Ⅰ组的肝组织损伤程度明显比Ⅱ组轻。经HE和PAS染色证实,移植的肝细胞在受体脾内结构和功能保持较好。结论:①D-gal1.2g/kg腹腔注射可较好构建SD大鼠急性肝衰竭模型。②经脾内肝细胞移植能明显提高药物性肝衰竭大鼠的存活率、改善肝功能及肝组织病理变化。