人bcl-xL基因在转基因小鼠中的整合和表达

目的研究人bcl—xL基因在显微注射所产生的子代小鼠中的整合、转录和表达情况。方法采用PCR和Southern blot方法检测人bcl—xL基因在小鼠体内的整合；RT—PCR方法检测它们的bcl—xL mRNA水平；用Western blot及免疫组化法检测目的蛋白的表达情况。结果在显微注射所产生的转基因小鼠中，有4只为Southern blot检测阳性，并且在这4只小鼠及其子代中均检测到人bcl—xL的mRNA和过表达的目的蛋白。结论由于在这些小鼠中既有外源基因的整合，又有其mRNA和蛋白质的表达，所以，它们是真正的转基因动物。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型，并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法，把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中，胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠，经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件，TNNI2基因的第175个氨基酸缺失，通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测，tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

人胰岛素转基因小鼠模型的建立

目的:建立人胰岛素的转基因小鼠模型.方法:通过原核显微注射法,把外源基因pEF1α-mINS注射入FVB种小鼠受精卵,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠获得子代小鼠.结果:移植注射胚胎204枚给38只假孕小鼠共出生108只后代鼠,经PCR和Southern blot检测到5只阳性小鼠.结论:通过显微注射法使外源基因pEF1α-mINS在小鼠基因组中得到整合,建立了人胰岛素的转基因小鼠模型.     

人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立

目的：建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型，为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具．方法：通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt；采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中，然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管；取其产3wk龄子代鼠进行PCR初选，再通过Southern杂交进一步确证；利用HE染色法观察4mo龄转基因小鼠不同组织病理变化．结果：将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射，然后植入30只假孕母鼠的输卵管中，其中26只母鼠怀孕，移植成功率为86．67％；共出生子代鼠179只；PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因，转基因阳性小鼠比例为5．03％（9／179），Southem杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠；随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症，鼻咽黏膜上皮灶性增生．结论：成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠，且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生，可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段．     

TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型的建立

目的 建立TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型.方法 构建pEGFP-TNNT3(R69H)转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pEGFP-TNNT3(R69H)注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠.用PCR和Southern blot方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT-PCR及Western blot的方法检测TNNT3基因表达.结果 8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎82枚,出生40只子代鼠,经PCR和Southern方法检测得到5只转基因阳性小鼠.对其子代小鼠进行RT-PCR、Western blot检测结果显示,TNNT3在转基因小鼠心脏和骨骼肌中表达量明显增多.结论 通过显微注射法使外源基因pEGFP-TNNT3(R69H)在小鼠基因组中整合,成功建立了TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型.     

fat-1转基因小鼠的构建与鉴定

目的构建和鉴定携带有外源fat-1基因的转基因小鼠。方法将fat-1基因的cDNA与动物表达载体pEF—neo连接，构建pEF-fat-1重组质粒，酶切、测序鉴定正确后，以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠，通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEF-fat-1重组质粒，将其显微注射到小鼠受精卵中，得到G0代小鼠，PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。结论fat-1基因可整合到小鼠体内，得到的转基因小鼠为研究fat-1基因的生物学功能提供了动物模型。     

潮霉素抗性转基因BDF1小鼠模型的建立

目的建立具有潮霉素（hygromycin）抗性转基因BDF1小鼠，用于制备携有hygromycin抗性筛选标志ES阳性细胞克隆的饲养层。方法通过显微注射的方法，将含有潮霉素B磷酸转移酶基因片段（5.1kb）导入BDF1受精卵雄原核中，共注射169枚受精卵，然后将129枚受精卵细胞植入同期受孕的受体母鼠输卵管内。结果共产生37只转基因小鼠，经PCR和Southern检测获得9只阳性小鼠，对一只子代鼠进行RT-PCR检测证明hyg基因已经在肾、肌肉、脾内表达。结论成功的建立具有潮霉素抗性的BDF1转基因鼠，该模型动物可以为基因敲除研究提供良好的基础条件。     

甘丙肽过表达转基因小鼠的制作和鉴定

目的 建立甘丙肽（galanin,GAL）过表达转基因小鼠,为后续研究甘丙肽基因功能提供动物模型. 方法 重组质粒PDGFβ-GAL经XbaⅠ、HindⅢ双酶切后,将连接有启动子的甘丙肽基因片段回收纯化,用显微注射法将甘丙肽基因注入400枚受精卵的雄原核中,选取发育正常的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管壶腹部,待其产仔.用PCR方法鉴定子代小鼠基因型,蛋白印迹分析（Western blot）鉴定子代小鼠体内GAL蛋白表达情况. 结果 获得子代小鼠50只,有8只小鼠在基因组上整合有GAL基因,整合率为16％：Western blot显示转入的基因片段PDGF β-GAL在脑组织中的表达水平比肝组织高.结论 通过显微注射法成功建立了GAL过表达转基因小鼠模型.     

BIGH3R555w突变转基因小鼠模型的建立

目的建立BIGH3R555w突变转基因角膜营养不良小鼠模型。方法构建以磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase,PGK）为启动子的BIGH3（M）-IRES-EGFP重组质粒载体,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植入假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT—PCR及Western印迹法检测BIGH3基因表达。结果8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎84枚,出生35只子代鼠,经PCR检测得到4只转基因阳性小鼠。RT—PCR和Westem印迹法检测结果显示,BIGH3R555w在转基因小鼠角膜表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因B1GH3555w突变体在小鼠基因组中整合,成功建立了BIGH3突变转基因小鼠模型,该模型可为今后进一步研究角膜营养不良疾病的发病机制提供依据。     

bcl-xL基因介导白血病细胞多药耐药的形成

观察ｂｃｌ－ｘＬ基因可否介导白血病细胞的多药耐药,并探讨其机制。方法采用脂质体法将ｂｃｌ－ｘＬｃＤＮＡ转导入ＨＬ－６０细胞,免疫印迹法检测Ｂｃｌ－ｘＬ及抗凋亡蛋白Ｂａｘ的表达;ＭＴＴ法测定呈足乙甙、柔红霉素、阿霉素对转染细胞的细胞毒性;流式细胞仪定量检测凋亡细胞及细胞内药物浓度。     

检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠建立

目的建立用于检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠.方法采用显微注射方法,将携带lacZ和人碱性磷酸酶(human alkaline phosphatase,hAP)报告基因的ZAP载体导入近交C57BL/6小鼠554枚受精卵;利用PCR,Southern blotting技术对其仔鼠进行基因整合鉴定;应用X-gal染色方法,对转基因小鼠胚胎进行转基因表达检测.结果存活的398枚受精卵被移入21只假孕受体小鼠输卵管;13只受体怀孕产下68只后代.合子存活率和出生率分别为71%(398/554)和17%(68/398).在68只小鼠中,5只雄性和4只雌性小鼠整合有双报告基因.转基因整合率和有效率分别为13%(9/68)和1.6%(9/554).9只首建鼠与正常C57 BL/6小鼠杂交产生F1代小鼠.F1代小鼠转基因的传递符合孟德尔规律,X-gal染色仅在3只首建鼠的13.5 d龄胚胎中观察到.结论检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠已建立.     

GLUT4-Cre转基因模型建立与Cre酶特异性表达

目的：建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠，以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除。方法：选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达，利用基因重组技术，构建GLUT4-Cre转基因表达质粒。通过显微注射法将该质粒导入小鼠受精卵细胞核，获得的新生鼠经PCR和Southern杂交方法进行基因型的分析鉴定，常规方法培育、传代转基因鼠。用RT-PCR和免疫组化法对Cre酶在阳性转基因鼠体内mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果：获得5只阳性转基因首建鼠，其中3只已建系并稳定传代。在脑、脂肪组织中检测到Cre基因表达，而心肌、骨骼肌及肝脏组织中未检出转基因表达。结论：成功构建了在脑、脂肪组织中特异性表达Cre的转基因鼠，为研究与2型糖尿病、胰岛素抵抗等相关的条件性基因剔除小鼠模型的建立奠定了基础。     

人bcl-xl转基因小鼠外源基因的复制及传代的稳定性观察

显微注射法建立转bcl-xl基因小鼠，将PCR及Southern-blot检测阳性的小鼠与正常鼠酱并传代，然后检测子代中外源基因的遗传 情况。结果发现：10号小鼠传代过程中PCR阳性率保持稳定，符合孟德尔遗传规律，外源基因能够稳定遗传 。6号小鼠PCR阳性率呈轻微下降趋势，但能够保持相对稳定遗传 。13号和5号小鼠PCR阳性率均呈现明显的下降趋势。该二小鼠存在外源基因遗传丢失现象。结果提示：获得了能够稳定遗传 的转基因鼠系。     

5-脂氧化酶转基因小鼠模型的制备

目的研究SD大鼠两种繁殖方式对生产性能的影响,提供客观、科学的数据,为大鼠的规模化生产,选择合适的繁殖方法。方法在SPF级屏障设施饲养环境下,对SD大鼠的雌雄6：1循环交配法和雌雄1：1长期同居法进行比较对妊娠率、初生仔鼠重、平均窝产仔数、离乳仔鼠均重、离乳存活率和胎次间隔等生产性能指标的统计分析。结果SD大鼠两种不同繁殖方法的同胎次间的比较：离乳存活率呈极显著性差异（P〈0．01）;初生仔重,窝产仔数,离乳仔重,胎次间隔没有显著性差异（P〉0．05）。结论雌雄6：1循环交配法,可有效提高离乳存活率,提高种鼠的生产效率：同时,能有效控制动物种群数量和生产数量,适宜于大鼠的规模化生产。     

基于四环素调控系统的ApoE-rtTA/TRE-HCV-C双转基因小鼠的制备

目的为了丰富现有的四环素调控系统的小鼠资源库,同时也为更好地研究目的基因HCV-C的作用机制提供一个活体的动物模型,制备基于四环素调控系统原理的调控部分ApoE-rtTA的转基因小鼠,与反应部分TRE-HCV-C转基因小鼠,相互交配制作出双转基因小鼠。方法应用显微注射法将构建好的两种基因片段ApoE-rtTA及TRE-HCV-C分别注入超排的昆明母鼠的受精卵,再植入假母输卵管,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,将两者及阳性后代交配产生携带5只转基因鼠再经Western blot和RT-PCR在RNA和蛋白水平上进一步鉴定。结果产生了3只整合有ApoE-rtTA基因的首见鼠和125只阳性子代,以及产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首见鼠和16只阳性子代。PCR及Southern Blot证实上述阳性鼠确有转基因整合。将两者交配产生携带5只双转基因鼠。结论成功制备了携带有ApoE-rtTA及TRE-HCV-C转基因小鼠,建立了分别携带有这两种基因的鼠群,以及同时携带有两种基因的双转基因小鼠,为四环素调控系统提供了一个良好的通用型的调控动物模型,同时也可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

MTA1转基因小鼠的构建及鉴定

目的将人的MTA1外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建稳定高表达MTA1的小鼠模型。方法通过RT-PCR方法克隆人的MTA1编码序列,将MTA1插入真核表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-MTA1载体,回收片段后利用显微注射技术将目的基因片段注入到受精卵的雄原核中,使用MTA1特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠,再利用Western-blot及免疫组化方法检测MTA1在转基因小鼠全身级织表达情况。结果成功构建了MTA1转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中,10只ICR小鼠均怀孕,移植成功率为100%,共生出子代鼠80只,经PCR检测其中共有9只整合了MTA1基因,整合率为11.25%。经PCR鉴定MTA1整合阳性的F1代小鼠,再经Western-blot和免疫组化分析检测MTA1表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高,肾、骨骼肌表达无差异。结论成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTA1的转基因小鼠,为进一步MTA1研究奠定了良好的研究模型。     

LRP16转基因小鼠的繁殖与鉴定

目的：繁殖和鉴定携带有外源LRP16基因的转基因小鼠,为体内研究LRP16的生物学功能提供动物模型。方法首先将构建好的LRP16转基因重组质粒转染到293T细胞,鉴定该质粒是否可以有效表达目的蛋白,随后利用原核显微注射方法将线性化的重组质粒注射入品系为FVB的小鼠受精卵中,获得F0代小鼠。应用PCR方法对F0代小鼠进行鉴定,并将阳性F0代小鼠继续繁殖。结果 LRP16转基因重组质粒在293T细胞中可以有效表达,经PCR鉴定获得3只阳性F0代小鼠,阳性率为6.23%,选取其中1只整合有LRP16基因的F0代雄鼠,通过其与野生型FVB小鼠杂交获得7只F1代子鼠,其中4只为阳性鼠,阳性率为57.14%。从F1代中再次选取其中1只阳性雄鼠与野生型小鼠杂交繁殖获得5只F2代子鼠,PCR鉴定结果显示2只为阳性,阳性率为40%。结论 LRP16基因成功整合到小鼠基因组中,并且能够稳定遗传,为后续在动物整体水平研究LRP16的功能奠定了基础。