靶向脐带间充质干细胞的构建及在小鼠脾脏的定位研究

目的：构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体,用携带P1-GFP融合基因的慢病毒感染MSC,使MSC具有靶向性,将靶向MSC注入小鼠体内后观察MSC在小鼠脾脏的定位及与淋巴细胞的关系。方法：用组织片贴壁法培养健康人脐带间充质干细胞,用基因工程技术构建含小分子肽P1-GFP融合基因慢病毒载体并感染人脐带间充质干细胞,通过尾静脉将转入P1-GFP融合基因的MSC注入小鼠体内,18小时后免疫组化染色观察GFP在小鼠脾脏的定位。结果：培养的健康人脐带间充质干细胞生长良好,MSC感染含P1-GFP融合基因的慢病毒18小时后MSC开始出现绿色荧光,随着培养时间的延长,荧光强度逐渐增强,72小时达高峰。靶向MSC表达髓系干细胞的表面标记 CD105（90.0%）/CD44（98%）,CD73（85.0%）/ CD90（98.5%）。将靶向MSC经尾静脉注入小鼠体内, 18小时后小鼠脾脏出现大量GFP阳性细胞,并与脾脏淋巴细胞密切接触。结论：本研究成功构建了含P1-GFP融合基因的靶向MSC,靶向MSC成功定向脾脏,并与脾脏淋巴细胞密切接触,可用于后续的实验研究。     

利用shRNA慢病毒高效敲降雄性小鼠睾丸基因

目的：建立快速、高效制备小鼠睾丸基因敲降的平台。方法：设计和构建靶向睾丸特异性表达基因Sox30转录本的 shRNA表达载体（pSliencer-GFP-shSox30）及其对照质粒（pSliencer-GFP-shScramble）,与慢病毒颗粒包装后通过网微注射转导至出生24 d小鼠睾丸生精小管管腔,利用免疫荧光等检测慢病毒敲降鼠体内靶向基因的效率及敲降Sox30后对生殖细胞发育的影响。结果：慢病毒处理敲降后,相比对照组小鼠,shSox30病毒敲降组小鼠睾丸组织中Sox30蛋白表达水平显著下调,生精管腔中圆形精子发育阻滞在2~3步,Ⅶ~Ⅷ期生精管腔中无长型精子。结论：shRNA慢病毒有效降低小鼠睾丸靶基因的表达水平,在制备睾丸特定基因敲降动物模型中具有巨大优势。     

扶正胶囊提取物对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠免疫调节作用研究

[目的] 探讨扶正胶囊提取物对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用。[方法] 将60只昆明小鼠进行随机分组,每组10只,分为空白组、模型组、阳性对照组以及扶正胶囊提取物低、中、高剂量组。采用环磷酰胺腹腔注射建立小鼠免疫功能低下模型,检测各组小鼠的胸腺指数和脾脏指数、单核细胞吞噬能力、血清中白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）水平和脾T淋巴细胞亚群CD3⁺T淋巴细胞（CD3⁺）、CD4⁺T淋巴细胞（CD4⁺）、CD8⁺T淋巴细胞（CD8⁺）的分布与比例。[结果] 扶正胶囊提取物能提升由环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的胸腺指数和脾脏指数,增强单核细胞吞噬功能,显著提高小鼠细胞免疫因子IL-4、IL-10、IFN-γ含量,降低IL-17、TNF-α含量,上调脾淋巴细胞亚群CD3⁺CD4⁺的表达程度和提升CD3⁺CD4⁺/CD3⁺CD8⁺比值。[结论] 扶正胶囊提取物能够提升环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠的免疫功能。     

人脐带间充质干细胞对肝癌细胞增殖性及凋亡的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchyma cell, MSC)对肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)癌细胞增殖和凋亡的影响,为HCC的治疗提供新的思路。 方法 取50%覆盖率的MSC培养皿,换上新鲜的DMEM/F-12培养基,待其培养至100%的覆盖率后收集培养基备用,即为MSC条件培养基。用新鲜DMEM/F-12培养基加上等量的MSC条件培养基的混合培养基培养HepG₂人类肝癌细胞株24、48和72h,使用MTT法测定HepG₂细胞的增殖活性、通过Hoechest33342和PI双染色后在荧光倒置显微镜下观察计数以测定HepG₂细胞的凋亡、用Transwell侵袭实验和黏附实验测定HepG₂细胞侵袭能力以及通过Western blot法检测凋亡相关信号通路蛋白的表达。 结果 混合培养基培养HepG₂细胞24h后,对其生长和凋亡及侵袭黏附能力没有显著影响(P>0.05)。但是培养延长到48h和72h后,HepG₂细胞的活性、增殖能力、侵袭能力和黏附能力都受到显著的抑制,这些变化伴随着细胞分裂相关因子Ki-67、PCNA和组蛋白H3磷酸化水平下调,以及细胞凋亡执行者caspase-3的激活和抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制。 结论 体外间接共培养实验表明,人脐带间充质干细胞具有抑制肝脏肿瘤细胞增殖及促进其凋亡的作用。     

新基因mgt-16逆转录病毒载体的构建及其在小鼠间充质干细胞中的表达

目的 构建表达小鼠新基因mgt-16的反转录病毒载体,并观察其在小鼠胚胎间充质干细胞C3H/10T1/2（简称10T1/2细胞）中的表达。方法 以含小鼠新基因mgt-16的DNA序列为模板PCR扩增得到mgt-16编码序列,T-A克隆后测序获得pMD18T-16质粒,与真核表达载体pEGFP-N1酶切、连接、转化,通过PCR、酶切鉴定和测序获得正确的pEGFP-N1-16载体。将pEGFP-N1-16载体中含mgt-16的片段克隆至反转录病毒载体pLEGFP-N1,通过酶切鉴定和测序获得正确的pLEGFP-N1-16反转录病毒载体。将pLEGFP-N1-16转染反转录病毒包装细胞Phoenix,制备携带mgt-16与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的反转录病毒,感染小鼠间充质干细胞10T1/2后,400 μg/mL G418 筛选获得稳定表达mgt-16与EGFP融合蛋白的10T1/2细胞克隆。荧光显微镜观察MGT-16蛋白的表达及亚细胞定位。结果 PCR扩增得到大小约300 bp的mgt-16条带,T-A克隆后测序显示获得的mgt-16序列与Genbank数据库序列相同。构建的pEGFP-N1-16载体经PCR、酶切鉴定和测序验证构建成功,构建的反转录病毒载体pLEGFP-N1-16经酶切鉴定和测序验证构建成功。荧光显微镜观察MGT-16主要在Phoenix细胞和小鼠间充质干细胞的细胞质表达,核周表达水平较高。结论 成功构建了小鼠新基因mgt-16的反转录病毒载体,并在间充质干细胞中表达,为进一步研究新基因mgt-16在间充质干细胞中的功能奠定了基础。     

Duchenne型肌营养不良小鼠模型鉴定及干细胞移植后dystrophin的变化

目的 建立Duchenne型肌营养不良(DMD)模型dko小鼠的鉴定方法,评估干细胞移植后dystrophin的再生水平.方法 采用SSP-PCR方法鉴定杂合子鼠交配产生的子代鼠的基因型.生化分析仪测定dko小鼠血浆肌酸激酶含量,HE染色观察肌肉组织学变化.扩增人脐带间充质干细胞并注射到dko小鼠后肢肌肉,2个月后免疫荧光染色法检测dystrophin的表达.结果 杂合子鼠交配可以产生三个基因型的子代鼠,21.2%的子代鼠可以鉴定为dko小鼠的基因型(285 bp).dko小鼠显示了肌营养不良的症状,血浆肌酸激酶含量高达(16,988.52±617.48)IU/L,典型的病理变化包括肌纤维大小不一,多见核中移细胞,结缔组织增生或炎性细胞浸润.将人脐带间充质干细胞注射到dko小鼠后肢肌肉,2个月后可检测到人dystrophin的表达.结论 采用SSP-PCR可用于鉴定dko小鼠基因型,dko小鼠是研究干细胞治疗DMD的理想动物模型.     

慢病毒介导不同启动子嵌合抗原受体CD19在T细胞中的表达

目的 高效包装含绿色荧光蛋白（GFP）的嵌合性抗原受体CD19重组慢病毒载体,对比不同启动子在T细胞中绿色荧光蛋白的表达效率。方法 构建3种不同启动子及CD19-CAR的质粒pHAGE-CMV-EF1α-GFP-CD19、pHAGE-CMV-GFP-CD19、pHAGE-EF1α-GFP-CD19,转染293T细胞,镜下观察转染的细胞状态,72h后收集上清,PCR定量病毒载体RNA核酸拷贝数,通过流式细胞术以及Western blot法测定单、双启动子启动GFP及CD3ζ的表达情况;慢病毒液分别转染T淋巴细胞后,通过荧光显微镜检测慢病毒转染效果,Western blot法测定蛋白的表达水平。结果 荧光显微镜观察：以293T细胞为靶细胞时,启动子由强到弱依次为CMV-EF1α > CMV > EF1α,流式结果显示,在293T细胞中的转导率分别为72.4%、20.6%、14.5%;Western blot法检测结果显示,在T细胞中启动子表达强弱为CMV-EF1α > EF1α > CMV。结论 在以重组慢病毒为载体的基因研究过程中,为了提高病毒在感染细胞的转染率,需要正确选择启动子以及相应的靶细胞。     

黄芪多糖干预环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的免疫功能

目的 探讨黄芪多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用,并建立一套可行的多糖类物质免疫调控指标与评价体系。方法 运用黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)分别处理正常及环磷酰胺(Cytoxan,CTX)致免疫抑制模型小鼠,通过测定其胸腺和脾脏指数、腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数,并对小鼠胸腺和脾脏的组织发育情况进行观察;结合流式细胞术检测了各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺)百分含量的变化。结果 黄芪多糖能显著促进正常小鼠及免疫抑制小鼠的免疫器官增重,增大其脾脏和胸腺器官指数;组织学观察结果也显示黄芪多糖可以促进正常小鼠脾脏和胸腺的组织发育,并能改善CTX所致的小鼠脾脏和胸腺组织发育损伤。黄芪多糖可提高正常小鼠及免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率及吞噬指数,并可明显提高正常及免疫抑制小鼠外周血血清中CD3⁺、CD4⁺和CD4⁺/CD8⁺比值,降低CD8⁺百分含量(P<0.05或P<0.01)。结论 黄芪多糖可提高小鼠机体的免疫机能,并建立了较为全面的多糖类物质免疫调控评价指标。     

慢病毒载体介导的人磷脂磷酸水解酶3基因在人脐带间充质干细胞中的表达

目的 体外分离和培养人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell,UC-MSCs）,并将含有人磷脂磷酸水解酶3（human lipid phosphate phosphatases 3,hLPP3）的慢病毒载体转染UC-MSCs,探讨hLPP-3在UC-MSCs中的表达.方法 从脐带中分离单细胞,经细胞形态学、流式细胞仪（FACS）检测、细胞分化潜能判定,鉴定UC-MSCs的生物学特性.同时将hLPP-3基因克隆入慢病毒载体,包装出病毒上清,以不同拷贝数转染UC-MSCs,用免疫印迹和实时定量PCR技术分别测定不同转染组hLPP-3的蛋白及mRNA表达水平.结果 成功在体外分离和培养了UC-MSCs,并诱导其向脂肪、骨、软骨细胞分化.流式细胞仪检测结果显示脐带MSC表达CD90、CD73及CD105,而不表达CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、CD11b及CD106蛋白.用含hLPP-3-GFP融合基因的慢病毒载体转染UC-MSCs,实时定量PCR检测发现,hLPP-3的mRNA转录水平与转染拷贝数有关,转染拷贝数越高,hLPP-3的表达量越高;转染后1个月,免疫印迹发现hLPP-3-GFP依然维持高表达.结论 成功地在体外分离和培养了UC-MSC,并用含有hLPP-3基因的慢病毒载体转染UC-MSCs,通过转染拷贝数在一定水平上调控了UC-MSC中hLPP-3 mRNA的转录水平和蛋白表达量.     

干扰CD36的表达对高脂饮食诱导的肥胖小鼠心肌细胞钙调控的影响

目的 研究干扰心肌组织中脂肪酸转位酶CD36的表达对高脂饮食诱导的肥胖小鼠心肌细胞钙调控的影响。方法 4周龄的雄性C57小鼠,随机分为正常对照组（N-mock）、肥胖对照组（O-mock）及肥胖干预组（O-CD36）,采用高脂饮食诱导肥胖。6周龄时,经心肌注射靶向CD36（O-CD36）或靶向无关基因（N-mock、O-mock）的重组慢病毒,以下调心肌组织中目标基因的表达。16周龄时,取小鼠左心室组织,检测CD36和肌质网钙泵（SERCA2a）的mRNA和蛋白表达;并分离单个心室肌细胞,使用活细胞工作站检测心肌细胞钙瞬变。结果 肥胖小鼠心肌组织中CD36的表达较正常小鼠无显著改变,慢病毒介导的RNA干扰显著下调了CD36的表达。肥胖引起心肌细胞SERCA2a的蛋白表达降低及肌质网钙处理能力的下降;下调CD36的表达增加了SERCA2a的含量,并改善了钙调控异常。结论 下调心肌组织中CD36的表达可改善肥胖所引起的心肌细胞钙调控异常。     

不同基因载体系统对脐带血间充质干细胞转染效果的初步研究

 目的 比较慢病毒载体和腺病毒载体转染人脐带血间充质干细胞后，外源基因的表达。方法采用人脐带血分离培养间充质干细胞，制备表达GFP的慢病毒载体和腺病毒载体，用以转染间充质干细胞，观察其外源基因的表达。结果 脐带血间充质干细胞与骨髓中的类似，其外表呈纤维样；转染5周后，慢病毒载体转染的GFP阳性表达明显高于腺病毒载体。结论 慢病毒载体较腺病毒载体作为基因转导系统更有优势。     

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

克氏综合征胎儿脐带间充质干细胞模型的建立

目的 建立克氏综合征胎儿脐带间充质干细胞细胞系（Klinefelter’s syndrome umbilical cord mesenchymal stem cells,KUMSCs）,使之用于克氏综合征的研究。方法 从临床医院获取患有Klinefelter综合征的流产胎儿脐带,采用体外脐带间充质干细胞分离培养得到间充质干细胞。经质量检测、流式细胞术、核型分析、细胞诱导分化实验等技术进行鉴定。结果 获得的KUMSCs经细菌、真菌、病毒、螺旋体、支原体、内毒素等检测均符合质量控制标准;流式细胞技术检测显示KUMSCs对CD73、CD90、CD29、CD105和CD44呈阳性反应,对CD34、CD45和人白细胞抗原-DR （human leukocyte antigen-DR,HLA-DR））呈阴性反应。细胞诱导分化实验结果表明KUMSCs可定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞。结论 成功建立了Klinefelter综合征胎儿脐带间充质干细胞模型,可应用于Klinefelter综合征发病机制、药物开发等实验研究。     

食蟹猴脐带间充质干细胞的分离与鉴定

目的建立食蟹猴脐带间充质干细胞的分离培养方法。方法新鲜食蟹猴脐带剪碎为糊状,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养,观察细胞形态特征,流式细胞技术分析细胞抗原标志的表达,并检测其体外多向分化潜能。结果运用组织贴块法可以从新鲜脐带中分离到贴壁生长、阳性表达CD29、CD44、CD90的成纤维细胞样细胞。这些细胞在体外诱导培养后可分别检测到脂滴、骨和软骨细胞。结论运用组织贴块培养法可用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液从食蟹猴脐带中分离到间充质干细胞。     

血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响

目的探讨血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响。方法将人脐带间充质干细胞分别培养在不含血清、含灭活血清和含未灭活血清的低糖达尔伯克改良伊格尔培养基(L-DMEM)中。每天用显微镜观察脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长情况,并计算细胞总数、统计细胞成活率。结果脐带间充质干细胞在含未灭活血清的L-DMEM中生长状况最好,在不含血清的L-DMEM中生长状况最差。结论含未灭活血清的L-DMEM是脐带间充质干细胞体外培养的最佳培养基。     

脐带源性和脐血源性间充质干细胞分离培养方法的比较

目的建立分离培养人脐带间充质干细胞（UCMSCs）和脐带血间充质干细胞（UCBMSCs）的方法,并比较其效果。方法无菌条件下采集健康足月新生儿脐带及脐血各30份,分别通过原代贴壁培养法、酶消化法培养UCMSCs,及淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步分离法获得脐血中单个核细胞培养UCBMSCs。应用含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基,比较UCMSCs和UCBMSCs分离培养的效果与生长形态。流式细胞术检测其表面标志及诱导分化鉴定其分化能力。结果UCMSCs原代贴壁培养法8d左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出且成簇生长,酶消化法培养UCMSCs5d左右均匀生长;UCBMSCs分离培养用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法得到的细胞数量较淋巴细胞分离法明显增多。两种来源MSCs培养方法相比较,UCMSCs原代培养的时间短,培养成功率明显增高。流式细胞仪检测两种来源的MSCs具有MSCs表面标志特征。定向诱导分化结果表明MSCs具有被诱导为成骨细胞、脂肪细胞的分化能力。结论人脐带来源间充质干细胞原代培养周期短,培养效率更高;脐血间充质干细胞的分离方法中羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法效率更高。     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs）探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法 通过贴壁培养法将mUCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的mUCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果 运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的mUCMSC,可见红色结节。结论 贴壁培养法分离培养所获得的mUCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

人脐血间充质干细胞鉴定及用5-氮胞苷诱导后的生物学特性研究

目的探讨脐血间充质干细胞经体外扩增纯化表面CD标志的鉴定及在体外定向分化成心肌样细胞的诱导剂5一氮胞苷（5-aza）作用后的生物学特性。方珐健康妊娠产妇分娩的胎儿脐带血,分离单个核细胞进行培养、传代,取第3代以后细胞用流式细胞仪直接标记分析CD34、CD44、CD90细胞表面标志。10μmmol／L5-aza诱导4周后,进行透视电镜观察,并检测细胞肌球蛋白重链基因的表达。结果体外纯化扩增后的脐血间充质干细胞含有与骨髓来源的间充质干细胞相同的细胞表面标志,第3代以后细胞纯度较高,经5-aza体外诱导培养可形成心肌样细胞。结论脐血间充质干细胞经体外纯化扩增,第3代以后的细胞纯度较高,在体外经5-aza诱导定向分化为心肌样细胞后,其基本的生物学特性未发生改变。     

人凋亡相关因子基因RNA干扰慢病毒载体的构建与包装

目的:构建人凋亡相关因子(Fas)基因短发夹RNA慢病毒载体,实现沉默人脐带间充质干细胞Fas基因的表达.方法:根据Fas基因mRNA序列,设计4组靶向Fas基因的短发夹RNA序列,合成、退火形成双链DNA片段,与经过DNA内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞,对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序及比对分析.通过转染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定.结果:经酶切及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,通过荧光显微镜观察证明病毒转入293T细胞,感染效率 > 90%,并获得高滴度的慢病毒载体,病毒滴度为3×108TU/ml.结论:成功构建人Fas基因RNA干扰慢病毒载体,为下一步转染脐带间充质干细胞提供理论参考.     

脐带间充质干细胞对D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老实验研究

目的研究人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)对D-半乳糖所致的亚急性衰老小鼠的抗衰老作用。方法对模型对照组和治疗组连续8周颈部皮下注射D-半乳糖(0.25 mg/10 g)以建立衰老模型,两周之后治疗组注射脐带间充质干细胞。检测脐带间充质干细胞治疗前后衰老相关指标:包括小鼠血清、肝组织、脑组织中的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的变化。结果模型对照组与治疗组相比,SOD、CAT偏低,MDA含量偏高并且存在显著性差异(P≤0.05),与空白对照组相比,则存在极显著性差异(P≤0.01)。结论脐带间充质干细胞能够显著改善D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠的相关衰老指标,具有抗衰老作用。