Raji 细胞基因组文库的构建与筛选

目的:构建Raji细胞基因组文库,用EBV DNA探针对文库进行筛选.方法:Raji细胞基因组DNA经Bam HI酶切消化后,低熔点琼脂糖回收9～23 kb的酶切DNA片段,通过匹配黏性末端与磷酸化的Lambda DASH Ⅱ Bam HI酶切载体臂连接,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体,测定原始文库与扩增文库的滴度,用同位素标记的EBV DNA探针对Raji细胞基因组文库进行筛选.结果:Raji细胞原始文库与扩增文库的滴度分别为1.8×105和2.8×108 pfu/mL.文库经筛选获得4个阳性克隆,随机挑取1个阳性克隆稀释后铺平板作进一步杂交鉴定,发现所有噬菌斑均有杂交信号,证明该克隆确为阳性克隆.抽提该阳性克隆DNA,进行BarnHI酶切鉴定,证实插入片段的长度为8.5 kb.经测序、BLAST序列比对,结果显示插入片段一侧为EBV Bam HI W片段,另一侧与人类15号染色体RP11-665A22克隆高度同源.结论:Raji细胞基因组文库的成功构建,为进一步克隆包含EBV整合位点的细胞基因组序列、探讨EBV整合参与肿瘤发生发展的分子机制奠定了基础.     

人类乳头状瘤病毒_(18)的DNA顺序在Hela细胞染色体上的整合位点

近来对人类乳头状瘤病毒(HPV)16和18的研究显示,此病毒类群的各个种对生殖系统的癌的病原学是重要的.在来源宫颈癌的细胞系和活检中,均发现 HPV16和18DNA 整合在寄主基因组中.目前,用于定位单拷贝基因的原位染色体杂交方法得到发展,这使得病毒 DNA 顺序可以定位在染色体带上.作者利用这种方法确定了 HPV18DNA 顺序在 Hela 细胞染色体上的整合位点.作者由宫颈癌活检对 HPV18DNA 进行分子克隆,并由全部4种高比活的3H—脱氧核苷三磷酸来标记.染色体从同步化的 Hela 细胞培养中获得.按照绘制单拷贝基因图的杂交程序,进行杂交、冲洗,并以 NTB2核子踪迹乳胶对载玻片上的杂交物进行显影.此后,对标本染色,对染色体上显示出颗粒的分散相进行拍照;随后,使标本脱色,进行 G 显带,再拍照.     

慢病毒载体在人角质形成细胞基因组中的整合位点分析

目的 检测慢病毒载体(lentiviral vector)在人角质形成细胞基因组中的整合位点,初步分析慢病毒载体在表皮细胞基因组中的整合位点分布规律.方法 以本课题组前期研究中构建的慢病毒载体感染的人永生化角质形成细胞系为研究对象,应用连接介导PCR(ligation-mediated PCR,LM-PCR)技术克隆慢病毒载体在其基因组中的整合位点序列,测序克隆片段后经在线工具GTSG-QuickMap在人类基因组上定位,从而得到整合位点.再从整合位点分布与染色体、基因及其转录起始位点的关系来分析慢病毒载体在人角质形成细胞基因组中的整合倾向性.结果 对1 148个阳性转化子DNA测序及定位分析,共得到199个整合位点.与GTSG-QuickMap模拟的随机对照相比,慢病毒载体的整合频率在第4、5、15、16号染色体上、基因转录起始位点上游5 kb至50 kb范围内显示出统计学显著性差异.结论 慢病毒载体倾向于整合在人角质形成细胞基因组中的基因转录起始位点附近区域,而并不倾向于整合在基因内部的整合模式.     

异种移植供体猪α-1,3GT基因打靶引导序列获得及其染色体定位

目的 :为阻止异种抗原靶分子的生成 ,抑制或减轻HAR发生 ,试图对异种抗原的合成酶α - 1,3GT基因进行打靶灭活 ,以产生α - 1,3GT表型缺乏且具有抗HAR反应能力的异种供体 (猪 )。方法 :以α - 1,3GT基因的cDNA片段为探针 ,采用噬菌斑原位杂交结合PCR技术筛选猪gDNA文库 ,经酶切、Southern杂交、测序鉴定所得片段 ,并采用荧光原位杂交定位。结果 :获 7个片段 ,均在 8kb以上 ,且包含第三内含子 ,其中 3个片段测序证实包括第三、第四外显子 ;荧光原位杂交证实该基因位于猪染色体 1q2 .10～q2 .11。结论 :研究表明所得片段可作为该基因打靶引导序列 ,染色体定位明确了基因打靶位点 ,PCR技术可以用于快速筛选 gDNA文库     

应用荧光原位杂交检测HBV基因在转基因小鼠染色体上的整合

目的应用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）,检测本研究中心制备的乙型肝炎病毒（HBV）转基因小鼠目的基因的整合位点。方法采用荧光原位杂交技术,以正常小鼠染色体标本为对照,通过荧光标记的探针与转基因小鼠染色体标本进行杂交,对比分析同一中期分裂相的G显带和FISH结果。结果转基因小鼠染色体检测到一对明显的荧光信号,推测其在14号同源染色体上,而对照组无信号。结论外源HBV基因以单位点形式稳定地整合到转基因小鼠的染色体上。     

应用Affymetrix SNP Array和FISH技术确认胎儿额外小标记染色体r（4）4p13q13.3

目的 利用AffymetriSNP Array和FISH技术鉴定额外小标记染色体的来源.方法 2013年7月1例38岁高龄孕妇来我院就诊,进行羊水染色体核型分析,G显带检测羊水和脐血胎儿染色体核型,应用AffymetrixCytoScan 750K Array基因芯片技术鉴定额外小标记染色体的片段与来源,然后运用WSH/D4Z1探针的FISH进行确认.结果 胎儿羊水G显带染色体核型为46,XX[15]/47,XX,＋mar[15],脐血G显带染色体核型为46,XX[14]/47,XX,＋mar[16];AffymetrixCytoScan 750KArray基因芯片分析结果为arr 4p13q13.3（41,593,201-72,130,692）X2-3,显示胎儿有4号染色体4p13-着丝粒-q13.3区段30.537 Mb的嵌合性重复;胎儿脐血细胞FISH检测显示28％间期细胞有4号染色体着丝粒的三体性.结论 综合应用染色体G-显带核型分析、FISH技术和AffymetrixCytoScan 750K Array芯片技术能准确确认额外微小标记染色体的来源及其片段的界定.     

染色体高分辨结合荧光原位杂交鉴定18q末端缺失综合征

 目的 探讨1例生长发育迟缓、智力低下女性患儿遗传学发病机制及其与复杂临床表现的关系。方法 采用高分辨染色体G显带技术确定患儿及其父母核型，应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）进一步对患儿核型鉴定并对染色体结构畸变精确定位。结果 患儿1条18号染色体q21.3至qter缺失，经FISH鉴定可确定为末端缺失，无小片段易位和倒位，断裂点在q21.32~q22.2约2 Mbp大小的区域。18q22.3~q23关键区域发生缺失，涉及包括鞘磷脂碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）、促生长激素神经肽受体(galanin receptor type I，GALR1)等基因单倍缺失。核型描述为：46,XX,del(18)(q21.3).ish del(18)(q21.32q22.2q23)(RP11-4G81+,RP11-57F7-,qter-)。结论 高分辨染色体技术结合FISH有利于判断染色体微小变异并进行较为精确的定位。虽然实验已证实染色体部分缺失与某些基因相关，但MBP与GALR1等基因单倍剂量是否是导致患儿生长发育迟缓的原因还需要进一步的实验证实。     

八探针荧光原位杂交技术在急性髓系白血病诊断中的应用

摘要：目的探讨八探针间期荧光原位杂交技术（FISH）在检测急性髓系白血病（AML）常见细胞遗传学异常中的价值。方
法采用八探针FISH系统,即以针对AML1/ETO融合基因、PML-RARα融合基因、CBFβ/MYH11 融合基因、MLL基因、
P53基因、Del（5q）、-7/Del(7q)、Del(20q)八种DNA探针对40例AML患者细胞遗传学异常进行检测,并与常规G显带核型
分析技术相比较。结果40 例AML中,共22 例多探针FISH检出了细胞遗传学改变,总阳性率为57.50%,包括：AML1/
ETO融合基因、PML-RARα融合基因、MLL基因断裂重排、Del(5q)、-7/Del(7q)、P53基因缺失、8号染色体三体7种细胞遗
传学异常。而常规G显带核型分析技术(CCG)对于相对应的遗传学异常仅检出8例,另检出3例八探针FISH不能检出的
异常,总阳性率为27.50%。结论FISH八探针诊断技术较常规G显带核型分析技术具有省时、准确、高效等优点,可作为
急性髓系白血病临床诊断的一个重要手段。     

原发性闭经妇女伴有关键区域Xp11.2和Xq24的隐性复杂染色体重排

本文报道大学医学院附属医院的1例36岁原发性闭经患者,通过外周血淋巴细胞G显带核型分析为复杂染色体重排(CCR),G显带核型为46,X,-2,-11,-22,-X,+m ar1+m ar2+m ar3+m ar4。同时对其行荧光原位杂交(FISH)检测。对2、11、22、X染色体进行商业上应用的多色FISH(M FISH)探针(同时有24种颜色)和全染色体探针分析CCR特点。使用常规、多色FISH检测确认CCR,发现先前使用M FISH检测所怀疑的标志3处确有染色体11的隐性插入。G显带和FISH联合检测数据显示有4条染色体和7处染色体断点与CCR相关,分别是2q21、2q31、11q22.1、11q22.3、…     

PCR技术在快速筛选DNA文库中的应用

目的探讨运用PCR(polymerase chain reaction)方法快速筛选DNA文库的可行性.方法以猪α-1,3GT cDNA片段为探针,用cDNA上的特异性序列合成的引物,采用噬菌斑原位杂交和PCR相结合的方法,对猪的gDNA文库进行α-1,3GT基因筛选,经酶切、Southern Blot、测序和荧光原位杂交定位.结果经过两次杂交和一次PCR即得信号很强的7个阳性单克隆,插入子均在8kb以上,且包含第三内含子,其中3个片段测序证实含第三、第四外显子;荧光原位杂交证实该基因位于染色体1q2.10-q2.11.结论PCR可以应用于快速筛选DNA文库.     

EB病毒基因片段转化细胞的基因定位与移植裸鼠的致瘤性检測

EB病毒是DNA肿瘤病毒,它与人类的两种恶性肿瘤Burkitt氏淋巴瘤和鼻咽癌相关,前者是B淋巴细胞的肿瘤,而后者是低分化的鼻咽上皮癌。用EB病毒基因片段(BamHI W及相邻片段)通过转染的方法已成功地转化Rat-1细胞并接种裸鼠形成移植瘤。用~3H标记的EBV DNA探针与转化细胞染色体作核酸原位杂交,结果显示EB病毒的BamHI W片段与1、8号染色体DNA有同源性。经统计证明W片段定位在这两个染色体上,转化细胞与对照细胞结构及数目上并无明显的差异,但转化细胞DNA合成是对照细胞的5.69倍。转化细胞接种裸鼠形成移植瘤后并可传代。移植存活率达93.3%。随着传代代数的增加,肿瘤增大的速度有加快的倾向,细胞染色体众数逐渐增加,接近三倍体(62)。     

EBV转化B淋巴细胞的差异基因筛选

目的 通过全基因组芯片筛选正常人外周血淋巴细胞(PBLs)和EB病毒(EBV)转化B淋巴细胞株CGM1中的差异基因,探讨EBV转化B淋巴细胞的机制.方法 分离培养正常人外周血淋巴细胞(PBLs),通过原位杂交检测PBLs和CGM1细胞中EBER表达情况;提取2株细胞RNA,利用人全基因组寡核苷酸基因表达谱芯片筛选2株细胞之间差异表达基因,并通过生物信息学对差异表达基因进行GO pathways和KEGG pathways分析.结果 EBER原位杂交结果显示PBLs EBER(-),CGM1 EBER(+);CGM1细胞与PBLs之间差异有统计学意义的基因有1587个,其中上调基因897个,下调基因690个,这些基因主要涉及P53、PI3K-Akt、Ras、MAPK、Toll-like receptor、WNT、TNF和JAK-STAT等信号通路,与细胞周期调节,B细胞增殖、活化、分化和细胞因子产生,DNA复制、损伤修复,病毒与宿主相互作用及病毒致癌作用等相关.结论 EBV通过细胞周期调节、细胞活化与分化、DNA复制和损伤修复、病毒与宿主相互作用等多个环节参与B淋巴细胞转化.     

In situ demonstration of Epstein-Barr virus in intravenous drug abusers with generalized lymphadenopathy.

We have studied by the in situ hybridization method the presence of Epstein-Barr virus (EBV) DNA genome in lymph node tissues from 11 patients with persistent generalized lymphadenopathy. Using a biotinylated EBV DNA probe, we demonstrated EBV nucleic acid in scattered germinal centre cells in eight of the 11 cases. Our results suggest that EBV is not a determinant factor in the pathogenesis of this lymphadenopathy, but support its possible implication in B cell malignant transformation in cases of AIDS-associated lymphoma.     

Lytic, nontransforming Epstein-Barr virus (EBV) from a patient with chronic active EBV infection.

A new wild-type isolate of Epstein-Barr virus (EBV) was identified in follow-up studies of a case of chronic active EBV infection in an 8-year-old girl who had high titres of antibody to viral capsid antigen and early antigen (EA) (greater than 20 480 and 2560 respectively), persistent splenomegaly and abnormal immunologic features. More than 10 throat washings from this patient failed to transform cord blood lymphocytes (CBL), but at least 7 were able to induce EA in Raji cells. Supernatants from cultures of the lymphoblastoid cell line obtained by in-vitro infection of this patient's leukocytes with the B95-8 strain of EBV revealed a herpesvirus particle when examined by electron microscopy. The same supernatants were unable to transform CBL but could induce EA in Raji cells upon superinfection. In 30 or more trials the patient's lymphocytes never transformed spontaneously but did become positive for EBV nuclear antigen and EA in the first week of culture at least twice. Parallel studies performed on the father of the patient yielded similar results. This, then, is the first report documenting lytic activity associated with a wild-type EBV isolate.     

人鼻咽癌DNA对Rat-Ⅰ细胞株的转化活性及其基因表达的研究

为了解EB病毒基因组阳性人鼻咽癌DNA在转染正常细胞后可能发生的生物学作用,作者将人鼻咽癌活检组织的DNA(EB病毒基因组阳性),用磷酸钙方法转染正常Rat-Ⅰ细胞,使其恶转;用软琼脂培养的转化细胞能贴壁生长,并形成克隆;转化细胞易与PHA发生凝集;克隆接种裸鼠形成纤维肉瘤;转化细胞和裸鼠肿瘤组织用抗C_3补体免疫荧光法检测EBNA呈阳性;染色体原位杂交显示在某些细胞中期染色体上有银粒出现。     

中国妇女生殖道湿疣与人乳头瘤病毒关系的基因与亚显微结构研究

核酸杂交发现,中国妇女宫颈癌与人乳头瘤病毒(HPV)-16关系密切,而湿疣则与HPV-11关系更为密切。在宫颈癌细胞中,HPV-DNA整合在癌细胞基因组中;而湿疣细胞中的HPV则游离存在于宿主细胞基因组外。电镜观察发现,在杂交呈阳性的癌细胞中,核内染色质间颗粒。染色质周围颗粒及核内小体多见。但未见HPV颗粒;而在湿疣组织中,除上述核内染色质颗粒及核内小体外,在部分病例中可见HPV颗粒。此外,在湿疣细胞还发现一种电子致密团块结构。提出不能仅凭疣细胞中有凹空细胞(koilocyte),便诊断HPV感染。     

益气解毒片对EB病毒相关抗体免疫封闭作用的解除效应初探

采用ＭＴＴ（二甲基噻唑二甲基四唑）法检测外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）对Ｒａｊｉ细胞的杀伤作用和免疫酶法测ＥＢ病毒相关抗体（ＥＢＶＶＣＡ－ＩｇＡ）的免疫阻抑作用,研究益气解毒片对该阻抑作用的解除效应,结果表明,益气解毒片方面可以直接杀伤Ｒａｊｉ细胞,另一方面有解除ＥＢＶＶＣＡ－ＩｇＡ的封闭作用,使免疫细胞直接杀伤携带ＥＢ病毒基因的Ｒａｊｉ细胞,提示益气解毒片可能解除ＥＢＶ ＶＣＡ－ＩｇＡ的免疫封闭作     

Detection of cellular ki-ras oncogene and Epstein-Barr viral DNA by polymerase chain reaction in situ.

A newly established technique of polymerase chain reaction (PCR) in situ is reported. The process involved the use of the PCR technique to amplify the target gene and to generate the radiolabelled products which was used as a probe to hybridize the target gene in situ. Ki-ras oncogene in human pancreatic carcinoma cell line (PC-2) and EBV DNA in Raji cell line were detected in situ by this technique with encouraging results. This technique has the advantages of both PCR and in situ hybridization, i.e., high sensitivity, quick amplification and precise localization. It is a rapid, simple, economical and reliable method.

     

EB病毒潜伏感染基因组在上皮肿瘤细胞克隆扩增中的保留

目的:探讨EBV感染的上皮细胞在克隆扩增过程中细胞中EBV基因组保留或丢失的实质.方法:使用EBV潜伏感染的上皮肿瘤细胞系293-EBV,其中的EBV基因组通过绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)示踪,经过多次传代使细胞的GFP表达强度有强弱差异,且部分细胞完全丢失EBV基因组,然...