反义bcl—2 mRNA对人神经母细胞瘤细胞SH—SY5Y生长和凋亡的作用

目的：研究反义bcl-2 mRNA对人神经母细胞瘤（NB）细胞株SH－SY5Y的生长和凋亡的作用。方法：采用定向克隆构建携带反义bcl-2 cDNA片段的逆转录病毒载体PBabe-puro/Asbcl-2;应用脂质体Lipofectamine转染SH－SY5Y,经嘌呤霉素筛选,应用RT－PCR证实外源性反义bcl-2 mRNA的表达,建立细胞株SH－SY5Y／Asbcl-2,应用免疫组化和Western印迹分析Bcl－2蛋白的表达变化;MTT法做细胞的生长曲线观察细胞的生长情况;通过提取基因组DNA检测顺式氯铂（CP）诱导的细胞凋亡所形成的DNA梯带。结果：RT－PCR证实转染细胞SH-SY5Y/相A－2中有外源性反义bcl-2 mRNA的表达,免疫组化及Western印迹分析显示SH－SY5Y／Asbcl-细胞凋亡形成的DNA梯度更明显。结论：脂质体方法转染携带反义bcl-2 cDNA片段的转录病毒载体能够获得稳定转染和表达反义bcl-2 mRNA的细胞。反义bcl-2 mRNA可抑制内源性Bcl-2蛋白的表达,抑制SH－SY5Y的细胞的生长,增加SH－SY5Y细胞对CP的敏感性,促进细胞凋亡。     

逆转录病毒载体介导HBV前C/C反义RNA的体外抗HBV作用

目的：了解反义乙型肝炎病毒(HBV)基因转移、表达的抗HBV作用。方法：BamH Ⅰ酶切HBV质粒获取1504bp前C／C基因片段，将其正、反向插入逆转录病毒载体pDOR构建了正、反义前C／C重组体。将重组体转染逆转录病毒包装细胞PA317，G418筛选获取抗性细胞及假逆转录病毒。RT-PCR检测了反义HBV基因表达的反义RNA。将重组假逆转录病毒感染2．2．15细胞，ELISA及斑点杂交法分别检测被感染细胞培养上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA。结果：反义前C／C重组逆转录病毒载体在细胞内能转录HBV反义RNA。反义前C／C重组假病毒感染的2．2．15细胞HBsAg、HBEAg的合成分别降低了55．5％、78％；HBV DNA水平也明显低于空白对照组。该抑制具有一定特异性。增加假病毒感染次数在一定范围内能提高抑制作用。正义假逆转录病毒感染对2．2．15细胞HBV DNA水平及抗原合成无影响。结论：逆转录病毒载体介导反义HBV基因转移表达的反义RNA能抑制HBV复制及抗原合成，具有潜在应用价值。     

雄激素受体反义RNA对前列腺癌细胞雄激素受体表达的抑制作用研究

目的 观测雄激素受体（AR）反义RNA逆转录病毒表达载体在前列腺癌细胞中的表达及其对AR表达的影响。方法 将AR反义RNA逆转录病毒表达载体导入前列腺癌细胞株LNCaP，PCR检测AR目的片段在重组LNCaP细胞基因组中的存在，RT－PCR检测AR反义RNA表达和AR mRNA水平，Western blot检测AR蛋白表达水平。结果 PCR在LNCaP^as-AR基因组DNA中扩增出了AR目的片段，表明AR目的片段整合到了细胞基因组。RT－PCR证实LNCaP^as-AR有AR反义RNA表达，且其AR mRNA水平较LNCaP和空载体转染的LNCaP^Neo显著下调（P＜0.05)，Western blot证实LNCaP^as-AR细胞AR蛋白含量显著下降（P＜0.05)。结论 AR反义RNA可抑制前列腺癌细胞AR表达。     

反义bcl-2 和反义survivin对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞生长的作用

目的研究反义bcl-2和反义survivin(svv)对人神经母细胞瘤(NB)细胞系SK-N-MC细胞生长的作用.方法利用基因重组技术,采用定向克隆构建在真核细胞中能够稳定表达反义bcl-2 或反义svv 的逆转录病毒载体PBabe puro-Asbcl-2和PBabe puro-Assvv,并分别经脂质体LipofectamineTM介导转染人NB细胞株SK-N-MC细胞,经嘌呤霉素(2.0 μg/ml)筛选得到抗性克隆,同时以空载体Pbabe puro 转染SK-N-MC作为对照;以免疫组化和Western 印迹分析反义bcl-2、反义svv对细胞内源性Bcl-2、SVV蛋白质的表达抑制作用,应用MTT法研究细胞(5×103 /孔)的生长和增殖情况,并接种于裸鼠(3只/组),观察107 个细胞在6周时的成瘤情况,以研究反义bcl-2、反义svv对SK-N-MC细胞生长的作用.结果反义bcl-2转染后的细胞SK-N-MC/PBabe puro-Asbcl-2中的Bcl-2表达明显降低,反义svv转染后的细胞SK-N-MC/PBabe puro-Assvv中的SVV表达也明显降低;且这两种细胞均生长缓慢, 裸鼠移植瘤体积均明显小于SK-N-MC原始细胞或转染空载体的细胞接种形成的移植瘤.结论稳定表达的反义bcl-2、反义svv均能够有效抑制SK-N-MC细胞内源性相应蛋白质Bcl-2、SVV的表达,提示这两个基因在NB细胞的肿瘤形成中均具有一定的作用.     

靶向人端粒酶逆转录酶进行RNAi的逆转录病毒载体的构建

目的构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰RNA的真核表达载体。方法采用PCR法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列、U6启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰RNA对应的DNA序列,随后将与之相应的DNA序列片断依次克隆入真核表达载体pLXSN中,并通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体进行鉴定。以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达EGFP蛋白的情况。以MTT方法检测初步分析重组病毒对人Hela细胞的RNAi效果。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT。以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒滴定了病毒滴度后,重组病毒感染人Hela细胞24h时用流式细胞仪测得EGFP表达的阳性率为24.1%。重组逆转录病毒感染人Hela细胞48h时,MTT实验测得细胞死亡率为53.2%。结论成功构建了针对人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT,并制备了重组逆转录病毒,初步观察了效应,为进一步利用小干扰RNA技术研究肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

Overexpression of bcl-2 protects hepatoma cell line HCC-9204 from ethanol-i nduced apoptosis

目的：探讨bcl-2过表达对乙醇诱导的原发性肝细胞癌（简称肝癌）细胞凋亡的影响。方法：用脂质体介导的转染法将含有人bcl-2cDNA的逆转录病毒表达载体pDOR-SB导入不表达bcl-2蛋白的人肝癌细胞系HCC-9204中,并设转染pDOR和不转染的HCC-9204细胞对照。用G-418筛选后获得转入bcl-2基因的细胞克隆,并用免疫细胞化学ABC法检测Bcl-2蛋白的表达情况。有限稀释法连续克隆化直至获得用流式细胞仪检测100％表达Bcl-2蛋白的单克隆细胞株。6％乙醇分别作用于上述细胞6h后,甲噻唑蓝法检测细胞杀伤率,TUNEL染色法和流式细胞仪DNA含量检测分析细胞凋亡的发生程度。结果：转染pDOR-SB的细胞大部分为Bcl-2蛋白阳性,而转染pDOR或未转染的HCC-9204细胞中未见Bcl-2蛋白阳性信号。经过连续3次克隆化后,流式细胞仪检测表明所获得的单克隆细胞株100％稳定表达Bcl-2蛋白,命名为HCC-bcl2细胞。HCC-bcl2细胞在6％乙醇作用6h后的细胞杀伤率、TUNEL指数和亚二体凋亡峰比例均明显低于转染pDOR或未转染的HCC-9204细胞。结论：Bcl-2蛋白过表达能够抑制乙醇诱导的肝癌细胞系HCC-9204细胞凋亡。     

RNA干扰抑制KM3细胞APE1蛋白表达对其增殖与凋亡的影响

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease,APE1)基因RNA干扰对KM3人多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞APE1蛋白表达及细胞增殖、凋亡的影响,以期为转基因治疗多发性骨髓瘤提供实验依据.方法将构建的APE1 siRNA表达载体导人人多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞,应用Western blot检测APE1蛋白表达的改变,并通过细胞增殖曲线、MTT法和流式细胞术、DNA片段化百分率检测观察靶细胞的增殖与凋亡.结果 Western blot分析表明APE1 siRNA表达载体使KM3细胞APE1蛋白表达下降,细胞生长曲线观察、MTT法检测显示,转染的KM3细胞生长受抑,流式细胞术和DNA片段化百分率检测观察到APE1 RNA干扰使靶细胞凋亡明显增加.结论 APE1 RNA干扰通过降低APE1蛋白表达,抑制KM3细胞生长和促进其凋亡.     

人MCPH1基因shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法: 将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体pSiRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化。结果:重组pSiRNA-MCPH1质粒经测序鉴定正确;重组逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论:携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

反义AFP增强子/TK基因重组逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞中的专一性表达

目的构建在肝癌细胞中特异性高表达的重组逆转录病毒载体,观察其对体外培养肝癌细胞生物学行为的影响。方法应用DNA重组技术将α-甲胎蛋白増强子(AFE)核心区DNA与单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因融合,反向插入逆转录病毒载体pLXSN,重组体命名为pL/TK/AFE/SN;经PA317细胞包装、G418筛选、病毒滴度测定,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩增培养,收获病毒上清,感染体外培养的Hap3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞。用Southernblot、Northernblot检测转染细胞的DNA、mRNA,以羟甲基无环鸟苷(GCV)对细胞的杀伤毒性检测外源基因在转染细胞中的表达。结果酶切及Southernblot证实插入pL/TK/AFE/SN的反义AFE/TK基因大小、方向及克隆位点正确。达到一定的产病毒滴度。Northernblot分析显示Hep3B肝癌细胞有TK基因mRNA水平表达;应用GCV后,导入反义AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论成功构建了含反义AFE/TK基因的重组逆转录病毒载体并包装出具有感染能力的假型逆转录病毒;重组载体所含的反义AFP増强子能调控外源性TK基因特异地在Hep3B肝癌细胞中高表达。     

反义bcl-2基因抗白血病作用的研究

目的 研究反义bcl-2基因抗白血病作用及其特点,探讨反义基因或联合药物体外净化和治疗白血病可行性。方法 （1）RT－PCR和蛋白印迹方法检测HL－60、U937、K562、CEM白血病细胞株以及常见白血病类型的bcl-2 mRNA和P26蛋白表达情况。（2）选择高表达bcl-2基因的HL－60细胞株作为靶细胞,用人工合成bcl-2正反义硫代寡聚脱氧核苷酸（PS－ODN）体外培养处理。检测bcl-2 mRNA和P26蛋白的变化;DNA梯形分析细胞凋亡,锥虫蓝拒染法和克隆培养观察细胞生长;同时将HL－60细胞与PS－ODN培养孵育7天后的活细胞腹腔接种Scid鼠,半巢式RT－PCR和病理分析该HL－60细胞在体内生物学行为改变。（3）建立三种白血病细胞株CEM、K562、HL－60 Scid鼠白血病模型和有效监测与追踪白血病细胞株的方法,掌握体内白血病细胞株生物学行为;用bcl-2正反义PS－ODN腹腔给药治疗HL－60 Scid鼠白血病模型,观察治疗后体内白血病进展变化。（4）用RT－PCR方法克隆bcl-2基因和构建其两种不同的反义RNA逆转录病毒表达载体。（5）转染高表达bcl-2的HL－60细胞,比较两种反义RNA在对抗bcl-2的作用与降低内源性bcl-2蛋白水平上的异同性。观察两种反义RNA介导的靶基因抑制对烷化溶血磷脂（ALP）和四种化疗药物诱导的HL－60细胞凋亡的影响。（6）RT－PCR检测基因转染HL－60在化疗药物作用下FGFβ1表达。结果 （1）白血病细胞株表达bcl-2有差异,bcl-2 mRNA和它的P26蛋白不平行。（2）三种白血病细胞株HL－60,K562,CEM可在Scid鼠增殖,产生典型白血病浸润模型特征,白血病增殖和浸润程度与白血病细胞生物特性有关,其顺序为CEM＞K562＞HL－60。（3）人工合成的bcl-2反义硫化寡脱氧核苷酸（ASPO）能够下调HL－60细胞bcl-2表达,诱导凋亡,抑制增殖和克隆形成;同时使其失去在体内的致白血病能力。（4）bcl-2反义硫代寡脱氧核苷酸,腹腔给药能够抑制肿块增长,白血病扩张,延长Scid鼠生存期,呈剂量依赖性。（5）部分编码区的反义RNA能够降低HL－60细胞内源性Bcl-2蛋白水平,提高ALP和四种化疗药物对HL－60杀伤率,促进它们诱导的HL－60细胞凋亡。（6）反义基因转染的HL－60细胞在化疗药物作用下负调控因子TGFβ1基因表达增加。结论 bcl-2反义基因可有效对抗bcl-2原癌基因表达,发挥明显的抗白血病作用,为体外净化白血病细胞和体内治疗白血病提供依据。     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 研究双靶区反义RNA重组载体质粒的转染、表达及抗乙型肝炎病毒的作用。方法 构建表达乙型肝炎病毒X、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒与脂质体混合，经尾静脉注入小鼠体内，用荧光聚合酶链反应定量法检测血清乙型肝炎病毒DNA含量，用Nested—PCR法检测血清乙型肝炎病毒DNA转阴率。结果 与给药前相比，小鼠血清乙型肝炎病毒DNA的复制，在逆转录病毒载体-asX组和逆转录病毒载体-asP组分别于第2、第8周达到抑制高峰，抑制率均为58％；在逆转录病毒载体-asXP组于第1、第8周出现两次抑制高峰，抑制率分别为66％、77%；其余组未出现明显变化。给药后8周，小鼠血清乙型肝炎病毒DNA，在逆转录病毒载体-asX组、逆转录病毒载体-asP和逆转录病毒载体-asXP分别有2只、1只，1只转阴，转阴率分别为25.0％、12．5％、16．7％。结论 乙型肝炎病毒X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠乙型肝炎病毒DNA的抑制作用优于单靶区反义RNA，但其对血清乙型肝炎病毒DNA的转阴率与单靶区反义RNA无显著性差异。     

Bcl-2过表达抑制乙醇诱导的HCC-9204肝癌细胞凋亡

目的　探讨凋亡相关基因 bcl- 2过表达对乙醇诱导的肝细胞癌 (HCC)细胞凋亡的影响 .方法　将含有人 bcl- 2 c DNA的逆转录病毒表达载体 p DOR- SB质粒转染到不表达 bcl- 2蛋白的人肝癌细胞系 HCC- 92 0 4细胞中 ,用免疫组织化学 ABC法检测bcl- 2蛋白的表达情况 .连续克隆化直至获得 10 0 %表达 bcl- 2蛋白的单克隆细胞株 ,并进行流式细胞术检测 .用 6%乙醇分别作用于上述细胞 6 h后 ,用 MTT法和 TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡发生程度 .结果　转染 p DOR- SB的细胞大部分为bcl- 2蛋白表达阳性 ,而转染 p DOR空载体或未转染…     

雄激素受体反义RNA逆转录病毒载体的构建及其鉴定

目的　构建雄激素受体 (AR)反义RNA逆转录病毒载体pL AR SN并进行包装和鉴定。方法　PCR扩增ARcDNA片段并将之反向插入到逆转录病毒载体pLXSN ,用脂质体法转染PA31 7细胞 ,提取转染细胞基因组DNA和培养上清中重组逆转录病毒RNA ,用PCR和RT PCR法进行鉴定 ,NIH 3T3细胞测定病毒滴度。结果　限制性内切酶分析证明pL AR SN含有反向插入的ARcDNA目的片段 ;培养上清中病毒滴度为 2 .34× 1 0 5 CFU/ml,PCR和RT PCR分别从转染细胞基因组DNA和培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的目的片段。结论　成功构建了AR反义RNA逆转录病毒载体并包装出了高滴度的重组逆转录病毒。     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 探讨表达乙型肝炎病毒（HBV）双靶区反义RNA的逆转录病毒载体对HBV复制和表达的影响。方法 用分子克隆法构建表达HBVX、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,转染PA317细胞,用NIH3T3细胞扩增法检测假病毒颗粒滴度,以假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测其上清HBsAg和HBeAg,并以荧光聚合酶链反应定量方法检测2.2.15细胞内DNA和RNA含量。结果 HBVX、P双靶区反义RNA抗HBV的作用较单靶区反义RNA更明显,且对HBVS、C、P三个开放读码区的DNA和RNA抑制作用大,正义RNA无明显抑制作用。结论 细胞内表达HBV反义RNA具有明显抗HBV复制和表达的作用。双靶区反义RNA作用更明显。     

携带人bcl-2基因的慢病毒表达载体的构建及其在人原代卵巢颗粒细胞中的表达

目的 构建及鉴定bcl-2基因慢病毒表达载体,并观察在体外人卵巢原代颗粒细胞中的表达.方法 采用PCR技术从含有人bcl-2基因的质粒克隆模板pCMV-SPORT6钓取bcl-2基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,通过酶切、测序验证bcl-2基因后,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞.获得携带bcl-2基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-bcl-2,并转染靶细胞人卵巢原代颗粒细胞.通过检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的 蛋白bcl-2进一步验证pGC-FU-bcl-2在靶细胞中的表达.结果 (1)pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-bcl-2共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-bcl-2;(2)目的 基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人卵巢原代颗粒细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功构建了携带bcl-2基因的重组慢病毒载体,转染人卵巢原代颗粒细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究bcl-2的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定基础.     

ARRB1融合蛋白表达载体ARRB1-EGFP的构建及其在神经胶质瘤细胞中的表达

目的 构建重组表达载体ARRB1-EGFP,在细胞中表达与鉴定,为进一步研究其功能奠定基础.方法 RT-PCR获得编码人ARRB1的全基因序列,克隆到真核表达载体pEGFPN1,构建重组表达载体ARRB1-EGFP,并转化于E.coli DH5 α中筛选阳性重组子,通过限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转染人HEK293细胞中表达,表达产物经Western blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光方法比较融合蛋白与内源性ARRB1在SNB19细胞的定位.结果 成功构建了ARRB1融合蛋白的真核表达载体,并经Western blot鉴定正确.免疫荧光提示融合蛋白与内源性ARRB1定位相似.结论 ARRB1-EGFP融合蛋白可以安全、高效地转导入HEK293以及SNB19细胞中.     

pSiRNA-D114逆转录病毒载体的构建及对骨肉瘤UMR106细胞D114蛋白表达的作用

目的 建立逆转录病毒介导的人D114基因RNA干扰体外表达体系并观察对骨肉瘤UMRl06细胞的作用.方法 将人Dil4基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒psilencer 5.1-H1 R.etro中,构建成携带人D114基因RNAi逆转录病毒载体pSiP,NA-D114,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染骨肉瘤细胞UMR106.用Westem blot分别检测对转染细胞人D114蛋白表达的影响.结果 重组pSiR.-NA-D114质粒经测序鉴定正确.重组逆转录病毒滴度可达221×104cfu/mL,感染UMR106骨肉瘤细胞3 d能明显抑制细胞Dll4蛋白表达,其表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.结论 成功构建了沉默D114表达的载体pSiRNA-D114,并且该载体能有效地敲低骨肉瘤细胞D114基因表达.     

HBX基因逆转录病毒载体的构建及在LO2细胞内的稳定表达

目的 构建乙型肝炎病毒X基因(HBX)逆转录病毒载体,并使其在人正常肝细胞LO2内的进行稳定表达.方法 PCR扩增HBX基因,克隆到逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag中,构建表达HBX的重组逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag-HBX,通过通过PCR、酶切、测序验证HBX基因后;体外将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBX基因的重组逆转录病毒,并感染靶细胞人正常肝细胞LO2,稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,获得成功转入HBX的LO2细胞.通过RT-PCR和Western blot进一步验证HBX基因及HBx蛋白在LO2细胞内的表达.结果 (1)成功获得携带HBX基因的阳性重组质粒pSEB-Flag-HBX;(2)HBX基因被逆转录病毒成功地导入靶细胞LO2细胞,并实现稳定表达,RT-PCR检测到HBX mRNA在靶细胞中的表达,Western blot检测到HBx蛋白在靶细胞LO2-HBx细胞中的表达.结论 成功构建了携带HBX基因的重组逆转录病毒载体,感染人正常肝细胞LO2后能够稳定表达HBx蛋白,为进一步探讨HBx在肝癌发生发展中的作用提供了较为理想的实验模型.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒。方法利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hH1neo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定。重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定。结果酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3。实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率>80%。结论构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础。