雄激素受体反义RNA逆转录病毒载体的构建及其鉴定

目的　构建雄激素受体 (AR)反义RNA逆转录病毒载体pL AR SN并进行包装和鉴定。方法　PCR扩增ARcDNA片段并将之反向插入到逆转录病毒载体pLXSN ,用脂质体法转染PA31 7细胞 ,提取转染细胞基因组DNA和培养上清中重组逆转录病毒RNA ,用PCR和RT PCR法进行鉴定 ,NIH 3T3细胞测定病毒滴度。结果　限制性内切酶分析证明pL AR SN含有反向插入的ARcDNA目的片段 ;培养上清中病毒滴度为 2 .34× 1 0 5 CFU/ml,PCR和RT PCR分别从转染细胞基因组DNA和培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的目的片段。结论　成功构建了AR反义RNA逆转录病毒载体并包装出了高滴度的重组逆转录病毒。     

MGMT反义RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：探讨反义RNA逆转胶质瘤细胞耐药的可能性，构建MGMT反义RNA的真核表达载体。方法：以Xho Ⅰ和PvuⅡ双酶切质粒pHM14，回收178bp的片段，定向插入以HpaⅠ和XhoⅠ双酶切pLXSN所获得的线性化载体，构建针对MGMTmRNA5′端的反义表达载体pLaMT5SN；以EcoRⅠ单酶切pHM14，回收779bp的片段，插入以EcoRⅠ单酶切pLXSN并经CIAP去磷酸化的线性载体，构建针对MGMTmRNA全长序列的反义表达载体pLaMTSN。结果：pLaMT5SN经HindⅢ酶切可见370bp的片段；pLaMTSN经PCR扩增证明目的片段反向插入pLXSN，鉴定结果表明构建成功。结论：成功构建了两个MGMT反义RNA的真核表达载体，为研究MGMT反义RNA逆转胶质瘤耐药细胞的耐药表型提供了良好的实验材料。     

HBV全基因组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建HBV全基因组逆转录病毒载体,并进行酶切鉴定和测序.方法 用合适的引物,通过PCR方法 扩增pBlueScript sk(-)-HBV载体上的HBV全基因组,分别用Hind Ⅲ和Sd Ⅰ进行PCR产物和pLEGFP-N1载体的双酶切,用连接酶将HBV DNA和载体进行连接,转化连接产物后,进行质粒提取、酶切和测序鉴定.结果 PCR产物凝胶电泳可见3.2 kb条带.pLEGFP-N1-HBV重组质粒酶切结果 电泳后,可看见6.9 kb和3.2 kb的条带,测序结果 表明重组质粒含有HBV全基因组.结论 成功构建了HBV全基因组逆转录病毒载体,为下一步形成稳定的细胞模型奠定基础.     

针对HBV－X基因的反义核酸体外抗病毒作用

针对ＨＢＶ－Ｘ基因的反义核酸体外抗病毒作用冯志华，周永兴，姚志强，陈勇，焦建中，李光玉（第四军医大学唐都医院传染病科西安７１００３８）关键词反义核酸，ＨＢＶ－Ｘ基因，基因治疗中图号Ｒ５１２．６２ＨＢＶ－Ｘ基因的表达产物ＨＢｘＡｇ具有反义激活功能．Ａｒ...     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 探讨表达乙型肝炎病毒（HBV）双靶区反义RNA的逆转录病毒载体对HBV复制和表达的影响。方法 用分子克隆法构建表达HBVX、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,转染PA317细胞,用NIH3T3细胞扩增法检测假病毒颗粒滴度,以假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测其上清HBsAg和HBeAg,并以荧光聚合酶链反应定量方法检测2.2.15细胞内DNA和RNA含量。结果 HBVX、P双靶区反义RNA抗HBV的作用较单靶区反义RNA更明显,且对HBVS、C、P三个开放读码区的DNA和RNA抑制作用大,正义RNA无明显抑制作用。结论 细胞内表达HBV反义RNA具有明显抗HBV复制和表达的作用。双靶区反义RNA作用更明显。     

MGMT反义RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：探讨反义ＲＮＡ逆转胶质瘤细胞耐药的可能性，构建ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ的真核表达载体。方法：以ＸｈｏⅠ和ＰｖｕⅡ双酶切质粒ｐＨＭ１４，回收１７８ｂｐ的片段，定向插入以ＨｐａⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切ｐＬＸＳＮ所获得的线性化载体，构建针对ＭＧＭＴｍＲＮＡ５＇端的反义表达载体ｐＬａＭＴ５ＳＮ；以ＥｃｏＲⅠ单酶切ｐＨＭ１４，回收７７９ｂｐ的片段，插入以ＥｃｏＲⅠ单酶切ｐＬＸＳＮ并经ＣＩＡＰ去磷酸化的线性载体，构建针对ＭＧＭＴｍＲＮＡ全长序列的反义表达载体ｐＬａＭＴＳＮ。结果：ｐＬａＭＴ５ＳＮ经ＨｉｎｄⅢ酶切可见３７０ｂｐ的片段；ｐＬａＭＴＳＮ经ＰＣＲ扩增证明目的片段反向插入ｐＬＸＳＮ，鉴定结果表明构建成功。结论：成功构建了两个ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ的真核表达载体，为研究ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ逆转胶质瘤耐药细胞的耐药表型提供了良好的实验材料。     

逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体的构建与鉴定

目的构建逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体,并在HEK293细胞株中观察其基因沉默效果。方法PCR方法扩增人U6启动子,下游引入核酸内切酶位点BamHI、SalI,反向插入质粒Pmscv/Hyg的3′端LTR上游。扩增EGFP基因,插入载体Pmscv/Hyg的多克隆位点。合成干扰P53基因表达的寡核苷酸序列,退火复性后插入U6启动子下游BamHI、SalI酶切位点间。重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转染病毒包装细胞PT67,产生具有一次感染能力的病毒颗粒。病毒上清感染靶细胞HEK293,经潮霉素筛选,RT-PCR和western blot检测靶基因P53表达情况。结果质粒酶切及DNA测序表明成功构建重组病毒载体,并在PT67细胞中包装成具有一次感染能力的逆转录病毒。经Hygromycin筛选,HEK293细胞中P53蛋白和mRNA表达显著下调。结论成功构建以Pmscv/Hyg为基础的RNA干扰表达载体,重组载体包装出的逆转录病毒可有效介导基因沉默。     

双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 研究双靶区反义RNA重组载体质粒的转染、表达及抗乙型肝炎病毒的作用。方法 构建表达乙型肝炎病毒X、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清乙型肝炎病毒DNA含量,用Nested—PCR法检测血清乙型肝炎病毒DNA转阴率。结果 与给药前相比,小鼠血清乙型肝炎病毒DNA的复制,在逆转录病毒载体-asX组和逆转录病毒载体-asP组分别于第2、第8周达到抑制高峰,抑制率均为58％;在逆转录病毒载体-asXP组于第1、第8周出现两次抑制高峰,抑制率分别为66％、77%;其余组未出现明显变化。给药后8周,小鼠血清乙型肝炎病毒DNA,在逆转录病毒载体-asX组、逆转录病毒载体-asP和逆转录病毒载体-asXP分别有2只、1只,1只转阴,转阴率分别为25.0％、12．5％、16．7％。结论 乙型肝炎病毒X、P双靶区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠乙型肝炎病毒DNA的抑制作用优于单靶区反义RNA,但其对血清乙型肝炎病毒DNA的转阴率与单靶区反义RNA无显著性差异。     

反义X区RNA和反义P区RNA小鼠体内抗HBV的比较

目的:探讨针对乙型肝炎病毒(HBV)X区反义RNA和P区反义RNA对乙型肝炎转基因小鼠HBV复制和表达的影响.方法:构建表达HBV X区反义RNA和P区反义RNA的重组载体质粒,与脂质体混合,经尾静脉注入小鼠体内,用荧光聚合酶链反应定量法检测血清HBV DNA含量,用Nested-PCR法检测血清HBV DNA转阴率.结果:PLXSN-asX小鼠血清HBV DNA的复制于给药后2 d被抑制,至给药后8周抑制依然存在;PLXSN-asP小鼠血清HBV DNA的复制于给药后4 wk被抑制,至给药后8周抑制处于上升趋势. 与给药前相比,小鼠血清HBV DNA的复制,在PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别于2和8 wk达到抑制高峰,抑制率均为58%; 8周后小鼠血清HBV DNA转阴率PLXSN-asX组和PLXSN-asP组分别为25.0%(2/8), 12.5%(1/8).结论:HBV X区反义RNA与HBV P区反义RNA对乙型肝炎病毒转基因鼠抗HBV作用效率无显著差异,但X区反义RNA的起效时间明显早于P区反义RNA.     

HBV前C/C及其调控序列热点变异与肝炎病变程度的关系

目的:通过对慢性HBV患者中HBV preC/C基因及其调控序列的变异热点的分析,研究各区段变异热点与疾病病变程度的关系.方法:对42例慢性HBV患者中扩增的HBV DNA各3个克隆进行序列分析.结果:42例不同病变程度的慢性HBV中,T1762/A1764双突变在轻度慢性肝炎中发生变异5例(38.5%),中度慢性肝炎发生变异4例(30.8%),重度慢性肝炎发生变异11例(68.7%),T1762/A1764双变异在三组患者中的分布无差异(P＞0.05).前C A1896变异在轻度慢性肝炎中发生率为30.8%,在中度慢性肝炎中发生率为46.2%,在重度慢性肝炎中的发生率为50.0%,A1896变异在三组患者中分布的差异无统计学意义(P＞0.05).HBV/C区的变异热点中,轻度慢性肝炎患者中发生氨基酸替代合计23个,中度慢性肝炎患者中发生氨基酸替代合计33个,重度慢性肝炎患者中发生氨基酸替代合计40个.在三组患者中C区氨基酸替代的分布有统计学差异(P＜0.05),替代随病变程度的加重而增加.结论:慢性HBV患者的HBV C基因及其调控序列变异具有多样性和复杂性,与体内的免疫清除和病毒逃避免疫攻击相关,从而容易导致疾病的慢性化.     

肝细胞浆内HBV DNA与HBV感染状态关系的探讨

在原位杂交研究的基础上,本文对慢性乙肝患者胞浆型HBV DNA及肝内其它乙肝指标进行综合分析。发现胞浆型HBV DNA可分3种类型:①肝内同时有核衣壳蛋白(HBcAg)与包膜蛋白(HBsAg)表达,此与HBV复制的产物表达特征一致;②肝内仅有HBsAg表达,此与HBVDNA和宿主基因组整合后的表达特点相似;③肝内HBsAg、HBcAg表达均缺如,可能代表一种HBV非复制状态。由此表明在HBV非复制期,出现胞浆HBV DNA杂交信号可能系DNA RNA杂交体所致。     

乙肝病毒(HBV)感染对肝细胞癌(HCC)患者A-to-I RNA编辑的影响

 目的 探究乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者肝脏正常组织和癌组织中腺嘌呤转变为次黄嘌呤（adenine to inosine,A-to-I）RNA编辑活性的影响。方法 从基因表达数据库（gene expression omnibus,GEO）收集28套成对正常组织和癌组织的转录组数据,分为HBV阴性正常组织（HBV-N）组、HBV阴性癌组织（HBV-T）组、HBV阳性正常组织（HBV+N）组和HBV阳性癌组织（HBV+T）组。用SPRINT软件进行位点鉴定后,从催化酶表达水平、位点编辑水平和位点所在基因的基因本体论（gene ontology,GO）富集通路层面进行分析。结果 在正常组织和癌组织中均发现HBV感染时腺苷酸脱氨酶1（adenosine deaminases acting on RNA 1,ADAR1）表达水平更高。癌组织中HBV阳性样本的A-to-I RNA编辑水平上升,正常组织中则无此现象。两类组织中HBV阳性样本编辑基因显著富集在细胞增殖、基因调控相关信号通路。结论 HBV感染上调ADAR1的表达,从而改变宿主编辑事件活性,这对HCC的发生发展可能有促进作用。     

Effect of preS2 antisense RNA on hepatocellular carcinoma with a novel delivery system

HepatitisBvirus (HBV)infectioniswidelyprevalentinChina ,andthereisnoefficientwaytocureit Antisensetechnique,blockingthetargetgeneandinhibitingitsexpressionatthemolecularlevel,hasshownpotentialantiviralandantitumoreffects 1 3 　Choosingthetargetsiteonthe 3 2kbHBVgenomeisthekeytotheantisensetechnique Inpreviousresearch ,wefoundthatanantisenseoligonucleotidecomplementarytopreS2 (as preS2 )hadthestrongestinhibitoryeffectonHBVantigenexpressioninvitroamongfourpiecesofHBVantisenseoligonucleoti…     

携带HBV C基因重组MVA假病毒颗粒的构建及其抗原性鉴定

目的 构建携带HBV C基因的重组MVA假病毒颗粒并鉴定其抗原性.方法 将HBV C基因通过基因重组构建入穿梭载体pSC11,得到质粒pSC11-C,将此质粒转染MVA病毒通过同源重组得到MVA-C.结果 利用基因测序,PCR鉴定证实所得假病毒颗粒携带HBVC基因,并且具有良好的抗原性.经过9次传代得到单克隆重组病毒.结论 成功构建了携带HBV C基因的重组MVA假病毒颗粒MVA-C,为研究HBV慢性感染的基因治疗提供了新途径.     

HBV感染各阶段血清乙肝表面抗原与HBV DNA及年龄的相关性分析

目的:探析未接受抗病毒干预治疗的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者各阶段的血清乙肝表面抗原(HBsAg)定量值与HBV DNA及患者年龄的关系.方法:2015年3月~2016年12月在我院就诊但未接受抗病毒治疗的498例慢性HBV感染患者的临床资料.根据临床诊断结果,将入选者分成非活动性HBsAg携带组(145例)、慢性HBV携带组(57例)、乙型肝炎E抗原(HBeAg)(+)慢性乙型肝炎(CHB)组(151例)、HBeAg(-)CHB组(65例)、HBeAg(-)乙肝肝硬化(LC-B)组(43例)和HBeAg(+)LC-B组(37例)6组.对血清HBsAg定量与血清HBV DNA及患者年龄进行相关性分析.结果:各组间的HBsAg定量值有统计学差异,其中HBeAg(-)、(+)的CHB组间HBsAg水平差异显著.除外非活动性HBsAg携带的HBV感染者的HBV DNA与血清HBsAg定量值呈显著正相关性.HBV感染者的血清HBsAg定量值与其年龄间存在显著负相关性.年龄>40岁的非活动性HBsAg携带者血清HBsAg定量值明显低于同年龄段的HBeAg(-)CHB患者.结论:HBV感染各阶段的血清HBsAg水平各不相同,该水平与患者的年龄及HBV DNA关系密切,是区分年龄超过40岁的非活动性HBsAg携带者与HBeAg(-)CHB患者的一个重要预测指标.     

慢性乙型肝炎与乙肝肝硬化HBV RNA和HBV DNA的差异及相关性分析

目的 探讨慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）与乙肝肝硬化乙型肝炎病毒RNA（HBV RNA）和乙型肝炎病毒DNA（HBV DNA）之间的差异及相关性。方法 选取33例CHB为对照组,25例乙肝肝硬化为观察组,两组患者均持续使用强效核苷及核苷酸类药物（Nucleostide Analogues,NAs）治疗半年以上,比较两组HBV RNA、HBV DNA和乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）阳性率及表达水平。并采用Spearman法对HBV RNA、HBV DNA、HBsAg、肝功指标进行相关性分析,ROC曲线分析各指标在乙肝肝硬化中的诊断价值。结果 观察组HBV RNA、HBV DNA阳性率、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase,AST）的表达水平均高于CHB组,差异均有统计学意义（P<0.05）;其他指标之间均无统计学意义（P>0.05）。相关性分析显示观察组HBV RNA与HBV DNA呈正相关（r=0.715,P<0.01）,与其余肝功指标均无相关性（P>0.05）。ROC曲线分析HBV RNA、HBV DNA与AST对乙肝肝硬化的鉴别诊断曲线下面积AUC分别为0.746（95%CI：0.613~0.880）、0.729（95%CI：0.591~0.866）和0.640（95%CI：0.494~0.786）,HBV RNA联合HBV DNA鉴别诊断乙肝肝硬化的AUC为0.754（95%CI：0.623~0.885）面积最大,诊断价值最高。结论 乙肝肝硬化与CHB的HBV RNA和HBV DNA水平存在明显差异,两者联合在CHB与乙肝肝硬化的鉴别诊断价值更高,HBV RNA可考虑作为常规检测在临床推广。