碱性成纤维细胞生长因子对羊骨髓间充质干细胞体外增殖和分化的影响

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖与分化的影响。方法：体外分离培养的羊原代BMSCs分为实验组和对照组,实验组添加bFGF(2 μg•L^-1)于L-DMED培养液中,对照组使用L-DMED常规培养液。分别测定2组BMSCs生长曲线以及碱性磷酸酶（ALP）活性。应用诱导剂对2组细胞进行成骨、成脂肪诱导,分别在显微镜下观察其分化潜能。 结果：单个核细胞接种大约1周成纤维细胞样集落开始出现,2周后形成的集落数量增加,每个集落的体积变大。当第1代BMSCs细胞生长到汇合期时,实验组细胞数是对照组的2.5倍。于第16天实验组ALP活性比对照组明显降低（P＜0.05）。2组BMSCs经成骨诱导培养3周后,经Von Kossa染色,已经成骨的细胞内均可见钙盐沉积;已经成骨的细胞内油红-“O”染色显示,成脂肪诱导培养2周后,2组BMSCs均能分化形成脂肪细胞,2组每高倍视野下脂肪细胞计数差异无显著性（P>0.05）。 结论：bFGF能提高羊BMSCs集落形成数量及扩增效率,并抑制其ALP活性,同时保持了BMSCs向成骨细胞、脂肪细胞的分化潜能。     

塞来昔布对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化的影响

目的 观察不同浓度的塞来昔布对rBMSCs的增殖、成骨诱导分化的影响,探讨塞来昔布影响rBMSCs成骨诱导分化的可能机制。方法 采用全骨髓贴壁法获得rBMSCs;使用不同浓度的塞来昔布（0、12.5、25、50、100μmol/L）干预培养rBMSCs,检测不同浓度的塞来昔布对rBMSCs增殖的影响;采用较高浓度的塞来昔布（100μmol/l）诱导rBMSCs 成骨分化,进行ALP、茜素红染色,应用real-time PCR扩增ALP、OCN。结果 细胞增殖抑制实验表明100μmol/L塞来昔布对rBMSCs增殖抑制明显（P<0.05）;12.5、25以及50μmol/L塞来昔布对rBMSCs增殖抑制无影响。ALP染色结果表明,成骨诱导3天对照组以及实验组ALP染色均为阴性;诱导7天对照组ALP染色为阳性,而实验组染色为阴性;诱导14天对照组ALP染色为阳性,实验组染色阴性。茜素红染色结果表明,成骨诱导3天、7天对照组以及实验组染色均为阴性;诱导至14天对照组染色阳性,实验组染色呈阴性。荧光定量PCR结果表明,成骨诱导3天对照组以及实验组ALP mRNA、OCN mRNA表达均较低;成骨诱导7天对照组ALP mRNA表达明显升高,实验组ALP mRNA表达升高趋势较弱,对照组OCN mRNA表达与第3天相比基本无差异,实验组OCN mRNA表达下降明显;诱导14天对照组ALP mRNA表达出现明显下降,实验组ALP mRNA 表达与第7天相比无明显差异,对照组OCN mRNA表达进一步升高,实验组OCN mRNA表达与第7天相比基本无变化。结论 本实验发现,高浓度的塞来昔布（100μmol/L）对rBMSCs增殖具有显著抑制效应。高浓度的塞来昔布（100μmol/L）能够抑制rBMSCs成骨诱导分化过程。高浓度的塞来昔布（100μmol/L）能够抑制rBMSCs成骨诱导分化过程中ALP以及OCN mRNA表达,表明较高浓度塞来昔布抑制rBMSCs成骨诱导分化的效应可能通过抑制ALP以及OCN的基因表达实现,提示在应用NSAIDs时应注意剂量等问题,尤其是应避免使用高剂量甚至是超高生理剂量进行药物镇痛治疗。     

RNA干扰Axin2对大鼠骨髓基质干细胞的成骨分化表达的影响

目的 通过对大鼠Axin2基因的RNA干扰(RNAi),探讨Axin2对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化过程的影响.方法 取6周龄雌性SD大鼠双侧股、胫骨骨髓细胞,采用全骨髓培养法进行原代和传代培养.细胞传2代后实验组进行Axin2 mRNA干扰质粒转染,对照组进行阴性干扰质粒转染.转染48 h后换用成骨诱导分化培养基.诱导分化28 d后用 von Kossa方法进行细胞外基质矿化染色.采用适时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)技术检测诱导分化后第7、14天β-catenin、骨钙素(OCN)、frizzled-2、Lef-1、Wnt5a mRNA的表达水平.结果 对照组大鼠BMSCs经体外诱导后分化为具备矿化细胞外基质能力的成熟成骨细胞,而实验组BMSCs成骨分化不全;RQ-PCR检测显示,诱导分化后第7天实验组β-catenin、frizzled-2 mRNA表达水平显著低于对照组,而OCN、Lef-1、Wnt5a mRNA表达水平显著高于对照组;诱导分化后第14天实验组frizzled-2、Lef-1和Wnt5a mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05).结论 对大鼠BMSCs Axin2进行RNAi后,BMSCs向成骨细胞分化晚期细胞外基质矿化能力减弱.     

三七总皂甙通过P38MAPK信号通路促进大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞的增殖、分化

目的:研究P38MAPK信号通路在三七总皂甙调节大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞增殖、分化的作用。方法:分离、纯化大鼠骨髓基质细胞(bonemarrow strowal cells,BMSCs),实验分诱导组、PNS组,SB203580组分别采用成骨诱导液、含100mg/LPNS的成骨诱导液及PNS诱导分化液加10uMSB203580培养,对各组细胞进行形态学观察,采用MTT法、对硝基苯磷酸盐法、茜素红染色方法观察各组细胞增殖、ALP活性、矿化结节的形成。结果:在3、5天各组细胞增殖无显著差异(P>0.05);在7、9天,PNS组细胞增殖明显高于诱导组及SB203580组(P<0.01),SB203580组低于骨诱导组(P<0.05)。PNS组ALP活性及钙结节染色高于骨诱导组和SB203580组(P<0.05～P<0.01),而SB203580组与骨诱导组比较无显著差异(P>0.05)。结论:BMSCs成骨诱导过程中,PNS可促进其成骨分化及增殖,其机制可能与P38MAPK信号通路活化相关。     

腺病毒介导的BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响

目的: 用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响.方法: 用Ad-BMP-2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响.酶标法检测ALP活性;免疫荧光检测骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响.结果: BMP-2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达.流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异.ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质.结论: 在腺病毒载体介导下BMP-2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化.     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

猕猴骨髓间充质干细胞采集、分离培养及生物学特性研究

[目的]体外分离培养猕猴骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),研究其生长增殖特性及其向成骨细胞的诱导分化能力。[方法]采用全骨髓贴壁法纯化猕猴骨髓源BMSCs,观察猕猴BMSCs的生长情况并运用MTT法绘制其生长曲线;对其进行流式细胞技术分析,鉴定BMSCs的生物学特性;在体外应用成骨诱导培养液(含0.1umol·L-1地塞米松、10mmol·L-1β-甘油磷酸钠、10%FBS、50umol·L-1抗坏血酸钠、维生素C 50mg·L-1)定向诱导分化,对分化后的细胞进行ALP、Von Kossa染色以鉴定其向成骨诱导的潜能。[结果]猕猴BMSCs的生长曲线如下:细胞在开始培养时有2d左右的相对静止期,3~6d增殖迅速,呈对数生长,7d后进入平台期,细胞增殖明显减缓。流式细胞仪检测结果显示:CD44和CD105的表达率分别为98.20%和95.01%,均呈强阳性,而CD34和CD45的表达率分别为1.38%和3.30%,呈阴性。未进行成骨诱导的第3代猕猴BMSCs,ALP染色呈阴性,未出现红色颗粒,且不随时间而改变;进行成骨诱导的第3代猕猴BMSCs,ALP染色呈阳性,第7d细胞中央出现散在分布的红色颗粒,并且随着诱导时间延长而增多颜色也逐渐加深,第14d镜下红色颗粒较前增多,且颜色也较前加深,其结果表明BMSCs在定向诱导分化为成骨细胞及骨细胞。未进行成骨诱导的第3代猕猴BMSCs,Von Kossa染色呈阴性,且不随时间而改变;进行成骨诱导的第3代猕猴BMSCs在第7d Von Kossa染色后镜下出现黑色沉积样结节,呈散在分布、大小不一,提示有钙样基质产生,第14d Von Kossa染色后镜下出现明显增大的黑色结节样物质,且数量增多、颜色加深。[结论]通过全骨髓贴壁分离法可以获得纯度较高的猕猴骨髓源BMSCs,体外培养具有较强的增殖能力,在成骨细胞诱导剂培养基里可以诱导其向成骨细胞方向分化,具有良好的成骨分化潜能,是组织工程骨中理想的种子细胞。     

2型糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞中Dickkopf-1蛋白的表达水平及其与成骨活性的关系

目的：检测2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)生长活性及成骨分化能力,以及Dickkopf-1(DKK-1)蛋白在BMSCs诱导成骨过程中的表达水平,探讨T2DM对 BMSCs成骨活性的影响及其与DKK-1表达的关系。方法：提取并分离T2DM造模大鼠BMSCs,进行体外培养与成骨诱 导,并将其分为T2DM组和正常对照组;采用细胞计数试剂盒检测BMSCs增殖活性;采用膜联蛋白V(annexin V)-异硫 氰酸荧光素(fl uorescein isothiocyanate,FITC)/ 碘化吡啶(propidium iodide,PI)双染法检测细胞凋亡率;采用碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)染色及ALP活性检测试剂盒检测BMSCs中ALP表达水平;采用茜素红染色与矿化结节定量法 分析BMSCs成骨分化程度;采用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)法检测大鼠BMSCs中核心结合 因子a1(core binding factor alphal 1,Runx2)和DKK-1的表达。结果：T2DM组大鼠BMSCs增殖活性比正常对照组弱,细 胞凋亡增加(均P<0.01);BMSCs成骨诱导过程中,T2DM组大鼠ALP表达量比正常对照组显著降低,且钙结节形成减 少,Runx2表达下调(均P<0.01);T2DM组BMSCs中DKK-1蛋白和mRNA表达上调,高于正常对照组(均P<0.01);DKK-1 蛋白和mRNA表达与Runx2的表达升高有关(均P<0.01)。结论：T2DM造模大鼠BMSCs的生长活性及成骨分化潜能受 损,这可能与BMSCs中DKK-1表达升高有关。     

PPARδ激动剂GW501516对大鼠骨髓基质干细胞分化的作用

目的：探讨过氧化物酶体增殖激活受体δ( PPAR δ)激动剂GW501516对大鼠骨髓基质干细胞( BMSCs)向成脂和成骨方向分化的作用。方法全骨髓培养法培养大鼠原代BMSCs后采用差速贴壁法纯化,流式细胞仪鉴定其细胞表面标志物,实验分为PPAR δ激动剂组和对照组,分别进行成骨和成脂方向诱导培养,荧光定量PCR检测成骨细胞分化标志物(碱性磷酸酶、骨钙素)和脂肪细胞分化标志物(脂肪酸结合蛋白2、脂连素) mRNA的表达,油红O 染色检测脂肪细胞分化,茜素红染色检测成骨细胞矿化情况。结果与对照组比较,PPAR δ激动剂促进BMSCs向成骨细胞方向分化标志物表达,抑制向脂肪细胞方向分化标志物表达。茜素红染色显示PPAR δ激动剂组细胞矿化结节较对照组增加,油红染色显示PPAR δ激动剂组脂肪小滴明显减少。结论 PPAR δ激动剂促进BMSCs向成骨方向分化,抑制其向成脂方向分化。     

链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化

目的 观察糖尿病大鼠模型骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外增殖、抗凋亡和成骨分化能力。方法 将40只6周龄雌性SD大鼠随机分为2组,每组20只,实验组腹腔注射链脲佐菌素,对照组注射等量的生理盐水。处理10周后,采用贴壁法获得2组大鼠的BMSCs。应用CCK-8检测第2代BMSCs增殖能力,0.3%过氧化氢和血清剥夺诱导的BMSCs凋亡;成骨诱导培养4周后, RT-PCR检测I型胶原蛋白(COL-I)、骨钙素(OCN)和核心结合蛋白因子-2(Runx-2)的mRNA表达水平;应用酶联免疫吸附法定量分析细胞碱性磷酸酶活性;茜素红染色及von Kossa染色分析矿化能力。结果 链脲佐菌素成功诱导制备糖尿病大鼠模型。与对照组比较,实验组BMSCs增殖和抗凋亡能力降低,细胞成骨相关基因表达下降,细胞碱性磷酸酶活性显著降低,细胞成骨分化能力减弱(P<0.01)。结论 糖尿病大鼠来源的BMSCs体外增殖、抗凋亡作用减弱,成骨分化能力显著下降。     

三七总皂甙对大鼠骨髓基质细胞骨形成蛋白-2表达及碱性磷酸酶活性的影响

研究三七总皂甙(PNS)对大鼠骨髓基质细胞骨形成蛋白-2(BMP-2)表达及碱性磷酸酶活性的影响,探讨其在骨髓基质细胞向成骨细胞增殖、分化中的作用机制。方法分离、纯化大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),实验按不同质量浓度PNS分组(0、50、100、150、200mg.L-1),以0mg.L-1为对照组。均采用成骨诱导液培养,MTT法观察细胞增殖,ALP活性测定,Western Blotting检测细胞BMP-2表达。结果在第3、5天各组细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05),在第7、9天,50、100、150mg.L-1组高于对照组(P<0.05);BMP-2表达水平及ALP活性在50、100及150mg.L-1组高于对照组(P<0.05),对照组少量表达BMP-2;200mg.L-1组细胞增殖、BMP-2表达水平及ALP活性与对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论三七总皂甙可通过上调BMP-2的表达水平,增强碱性磷酸酶活性,促进骨髓基质细胞向成骨细胞增殖、分化。     

miR-26a对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的调控作用

 目的 利用小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化模型, 探讨 miR-26a 在成骨分化中的表达趋势及调控作用。方法 提取雌性C57/BL6J小鼠双侧下肢股骨骨髓分离培养BMSCs,诱导分化为成骨细胞,通过实时定量PCR检测miR-26a在BMSCs及其诱导分化细胞中的表达。使用miR-26a的促进物miR-RiboTM microRNA-26a mimics通过siPORTTMNeoFXTMagent转染试剂瞬时转染BMSCs并加入成骨诱导剂培养,并同时设立转染microRNA-26a mimics NC的对照组。培养7 d、14 d后,进行细胞形态、碱性磷酸酶（ALP）染色、钙盐结节（茜素红染色）等项目的检测。另外制造绝经后骨质疏松小鼠模型（OVX组）与假手术动物模型（sham组）,RT-PCR检测OVX组中miR-26a的表达。结果 miR-26a的表达在BMSCs向成骨分化过程中上升约25倍,成骨基因表达也随着诱导时间的增加逐渐升高。转染miR-26a mimics后的BMSCs在培养7d后逐渐由梭形变为多角形,与阴性对照组类似;ALP染色显示阴性对照组培养7 d后为阳性,而实验组在培养7 d时呈强阳性;茜素红染色显示实验组培养14 d后出现数量较多的钙盐沉积结节,而阴性对照组则较少。miR-26a mimics组成骨基因的表达均高于对照组。RT-PCR检测结果显示OVX组中miR-26a的表达低于sham组4倍。结论 miR-26a mimics的转染可以促进BMSCs的成骨分化潜能,在骨质疏松的环境中miR-26a表达下降,间接证实了miR-26a对小鼠BMSCs成骨潜能的促进作用。     

脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 探讨脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields, PEMFs）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖、成骨分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 将培养的第3代大鼠BMSCs分为3组。3个组均以LG-DMEM完全培养基培养1 d,待细胞贴壁后更换新鲜培养基,对照组不做干预处理; PEMFs组进行8 Hz、3.8 mT的PEMFs干预,每天40 min,持续21 d;成骨诱导基(OM)组加入成骨诱导剂,不予磁场干预。采用MTT法测定增殖活性;碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S染色进行成骨分化鉴定;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测Wnt/β-catenin信号通路及成骨分化相关基因的表达。结果 相较对照组,成骨诱导剂在干预第7、14、21 d可提高BMSCs的增殖活性（P<0.05）;PEMFs促增殖作用不明显。在BMSCs分化方面,PEMFs组及OM组ALP、茜素红S染色阳性强度均高于对照组（P<0.05）。定量RT-PCR结果显示,PEMFs组及OM组Wnt1、Wnt3a、LRP5、β-catenin、BMP-2、Runx2、ALP、OC mRNA的表达相较于对照组在相应时间点均有所上调（P<0.05）。PEMFs组各检测结果较OM组低,但趋势基本一致。结论 PEMFs在8 Hz、3.8 mT条件下可促进BMSCs的成骨分化,这可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞

目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法,并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径．方法：抽取成人骨髓,Percoll密度梯度离心法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C,培养15d后,在倒置显微镜观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组化(SABC法)检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达,茜素红染色检测钙结节形成．结果：Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs;诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性率可达81％以上;Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性;茜素红染色见钙结节形成．结论：可以从成人骨髓中培养出MSCs,并可定向诱导分化为成骨细胞,可用作临床骨组织工程种子细胞。     

富血小板纤维蛋白(PRF)对成骨细胞增殖与分化的影响

目的 观察富血小板纤维蛋白(PRF)对成骨细胞增殖与分化的影响。方法 在PRF环境下培养MC3T3-E1成骨细胞,设立空白对照组与之对照。通过扫描电镜观察细胞附着;培养1、4、7 d通过CCK-8细胞增殖检测观察细胞增殖情况以及碱性磷酸酶活性;成骨相关基因OPG的表达。结果 CCK-8细胞增殖检测显示,培育4、7 d,实验组与对照组相比,细胞增殖促进作用明显,其差异具有统计学意义,ALP活性检测显示,培育4、7 d后,实验组与对照组相比促进作用明显,其差异具有统计学意义。 PRF可促进OPG mRNA表达。结论 PRF能促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化以及相关成骨基因OPG mRNA的表达水平。     

诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞和软骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离培养、增殖，以及向成骨细胞和软骨细胞定向诱导分化的条件，为骨、软骨缺损的修复和重建提供种子细胞。方法 抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，经密度梯度离心法及塑料板贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。对第2代MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况。并对第2代MSC进行软骨特定培养液诱导，对诱导细胞进行甲苯胺蓝染色，测定诱导后的软骨细胞表型。结果 MSC为梭型的成纤维细胞样贴壁生长，增殖能力强。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后ALP活性明显提高，并且出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论 在特定诱导条件下，兔骨髓MSC体外定向诱导分化为成骨细胞和软骨细胞，为骨和软骨组织工程的修复和重建提供实验依据。     

蛋白激酶CβⅡ负调控小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

目的观察蛋白激酶C(PKC)各亚型在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化中的作用。方法Western blot检测小鼠BMSCs成骨分化中PKC各亚型的活化情况;利用PKC阻断剂GFX分析PKC在BMSCs体外成骨分化中的作用;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测成骨早期分化指标ALP的活性;茜素红染色检测BMSCs体外矿化能力;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨分化相关基因Runx2、Ⅰ型骨胶原a1(ColⅠa1)和ALP的表达情况。结果小鼠BMSCs成骨分化过程中,仅检测到PKCβⅡ亚型活化,其他亚型均无明显活化。利用PKC阻断剂GFX抑制PKCβⅡ活化后,茜素红染色结果显示BMSCs的成骨分化过程受到促进;PCR结果显示成骨分化相关基因Runx2、ColⅠa1和ALP的mRNA水平均有不同程度增加;ALP活性检测结果也显示BMSCs的成骨分化过程受到促进。结论PKCβⅡ可负调控小鼠BMSCs的成骨分化。     

低氧预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖、凋亡和坏死的影响

 目的 探讨低氧预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、凋亡和坏死的影响及其可能机制。方法 采用全骨髓细胞贴壁法分离培养BMSCs,通过细胞成脂、成骨分化诱导及流式细胞仪检测其表面标志物(CD29、CD90、CD45)鉴定BMSCs;运用siRNA干扰技术沉默低氧诱导因子 1α(hypoxia inducible factor,HIF 1α)基因。将细胞分成6组:正常培养组、正常培养+转染阴性对照组、正常培养+HIF 1α RNA干扰组、低氧预处理组、低氧培养+转染阴性对照组及低氧培养+HIF 1α RNA干扰组,分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪和乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)活力测定等方法,检测各组BMSCs的增殖、凋亡和坏死情况;Western blot和real time PCR 检测各组BMSCs中HIF 1α、葡萄糖转运子 1(glucose transporter,GLUT 1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA和蛋白的表达。 结果 培养的BMSCs具有成脂、成骨等多向分化潜能;流式检测呈现CD29和CD90高表达,CD45低表达;低氧预处理可促进BMSCs增殖,减轻坏死,对细胞凋亡无明显影响;低氧预处理组HIF 1α、GLUT 1及VEGF的蛋白及mRNA表达明显高于常氧培养组(P<0.05);给予低氧预处理组siRNA HIF 1α后其HIF 1α、GLUT 1及VEGF的蛋白及mRNA表达均明显低于未干扰前(P<0.05),且细胞增殖受抑制,细胞凋亡和坏死加重(与未干扰前相比,P<0.05)。 结论 低氧预处理可促进BMSCs的体外增殖,减轻坏死,其机制可能与低氧预处理后HIF 1α表达增加及上调其下游基因GLUT 1和VEGF表达有关。     

成骨生长肽羧基端片段及其衍生物G38I对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的探讨成骨生长肽(OGP)羧基端片段[OGP(10~14)]及其衍生物G38I对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响。方法大鼠颅盖骨成骨细胞体外培养至第3代,分别加入10-15~10-7mol/L的OGP(10~14)或G38I,48h后行细胞计数,并用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖情况。细胞分为实验组[OGP(10~14)组和G38I组]及对照组,实验组给予10-11mol/L的药物干预48h。电镜观察细胞超微结构的变化,测定培养上清液碱性磷酸酶(ALP)含量,用免疫组织化学方法比较细胞中Ⅰ型胶原蛋白含量的变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定细胞中核结合因子a1(Cbfa1)和Ⅰ型胶原mRNA表达水平的变化。结果在较低浓度时,随药物浓度升高,OGP(10~14)和G38I促进细胞数增加、提高细胞活性的作用增强,10-11mol/L药物作用时成骨细胞数分别为37×104/ml和30×104/ml,进一步升高药物浓度反而抑制细胞增殖。电镜下实验组细胞粗面内质网发达,胞质中有大量分泌囊泡。对照组细胞囊泡中可见钙盐结晶。OGP(10~14)组和G38I组与对照组比较,细胞培养上清液ALP含量高(4·47U/g、3·82U/g vs2·21U/g),细胞中Ⅰ型胶原蛋白含量多,Cbfa1和Ⅰ型胶原mRNA表达水平较高,差异均具有统计学意义(P<0·01,P<0·05)。结论OGP(10~14)及其衍生物G38I具有与OGP全长肽相同的促进成骨细胞增殖、提高细胞活性的作用,OGP(10~14)和G38I可上调成骨细胞Cbfa1和Ⅰ型胶原mRNA表达水平,增加细胞中Ⅰ型胶原的合成,促进细胞分化和成骨作用。     

脂肪来源干细胞体外成骨和成脂及成神经的诱导分化研究

目的 探讨脂肪组织来源干细胞 (adipose stem cell,ADSC) 的表面表型及向成骨、成脂和成神经多向分化的生物学特性.方法 取SD大鼠的腹股沟、附睾垫和腹膜后脂肪,Ⅰ型胶原酶消化、分离培养ADSC,检测第3代ADSC的CD29、CD44和CD45的表达情况.将ADSC加入成骨诱导剂,通过茜素红S染色鉴定成骨细胞;成脂诱导剂利用油红O染色鉴定脂肪细胞;神经干培养基诱导,免疫荧光染色鉴定诱导的神经元.结果 ADSC表达CD29(99.07±0.12)%、CD44(95.82±0.68)%和CD45(0.11±0.12)%.其经成骨诱导4周,茜素红S染色显示聚集的细胞团中央形成红色钙化结节,碱性磷酸酶染色可见到细胞的胞质内有紫红色颗粒;成脂诱导1周,油红O染色可见细胞质内有橙红色脂滴;经过神经干培养基诱导6 d后,免疫荧光染色显示诱导的细胞Nestin、NF-200及GFAP阳性表达.结论 ADSC表达间质干细胞的表面表型,体外经诱导培养后可向成骨细胞、脂肪细胞和神经元多向分化,表明 ADSC具有干细胞的多向分化潜能.