人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化

目的 通过成人脂肪体外分离培养脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）研究其生理特性及在特定培养条件下向成骨分化,探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景.方法 从成人脂肪中利用胶原酶消化法分离并体外培养干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,P3代脂肪干细胞通过成骨诱导液诱导向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶（AKP）,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OP）表达变化.结果 成人脂肪间质来源的ADSCs,能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞检测证实其特异表达相关干细胞表面标记物;成骨诱导后表现出呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性,茜素红染色阳性,诱导培养0、3、7、14、21、28天后RT-PCR定量检测证实细胞中ALP、OP阳性表达.结论 成人脂肪中可分离得到ADSCs,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向骨细胞分化,阳性表达OP、ALP,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源.     

犬脂肪干细胞膜片的构建及其复合富血小板纤维蛋白后的成骨能力

目的 初步研究犬脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSCs)膜片的构建及其生物学特性对膜片复合富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)后成骨能力的影响.方法 取犬腹股沟处的脂肪进行消化,分离培养成脂肪干细胞进行相关检测.将P3代细胞加入含抗坏血酸的成膜培养液培养2周以上,构建脂肪干细胞膜片,采用HE染色及扫描电镜对膜片进行形态学检测.提取静脉血PRF,分为细胞膜片复合PRF的实验组和膜片对照组,2组分别成骨诱导后进行ALP染色和茜素红染色,并于诱导后第3、5天,采用RT-PCR检测成骨相关基因ALP、Runx2的表达.结果 体外分离培养脂肪干细胞,成功构建干细胞膜片.光镜下可见细胞极性排列紧密,细胞外基质分泌.扫描电镜可见膜片表面光滑,细胞紧密排列.HE染色可见蓝染细胞紧密相连,细胞外大量基质.成骨诱导后,ADSCs膜片复合PRF的实验组ALP表达及茜素红染色钙结节形成量明显优于ADSCs膜片对照组,实验组ALP、Runx2基因mRNA表达高于对照组.结论 成功构建犬脂肪干细胞膜片,膜片复合PRF后具有更强的成骨能力.     

小鼠、大鼠、食蟹猴与人的脂肪干细胞分离培养方法和生物学特性的比较分析

目的比较分析实验动物脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)与人脂肪间充质干细胞的分离培养方法和生物学特性的差异,为自体脂肪干细胞移植治疗人类疾病的临床前研究提供临床前的实验数据和方法。方法将临床患者、食蟹猴、C57小鼠和SD大鼠的皮下脂肪组织进行分离培养后得到人脂肪间充质干细胞(h ADSCs)、食蟹猴脂肪间充质干细胞(cynomolgus monkey adipose-derived mesenchymal stem cells,c ADSCs)、小鼠脂肪间充质干细胞(mouse adipose-derived mesenchymal stem cells,m ADSCs)和大鼠脂肪间充质干细胞(rat adipose-derived mesenchymal stem cells,r ADSCs);采用流式细胞术鉴定ADSCs表面标记物;细胞成脂、成骨诱导分化,于诱导后21 d和28 d固定染色,鉴定ADSCs的成脂成骨分化能力。结果 h ADSCs、c ADSCs、m ADSCs和r ADSCs的分离培养方法类似,贴壁培养后均呈成纤维细胞样生长;流式检测显示,不同物种ADSCs间充质干细胞表面标记物CD90、CD29为阳性,少量表达造血干细胞标记物CD34,血管内皮细胞标记物CD31为阴性。成脂和成骨分化能力检测显示,h ADSCs、c ADSCs、m ADSCs和r ADSCs和均具有成脂成骨分化能力,但其成脂成骨分化的时间略有差异。结论实验动物ADSCs与h ADSCs采用相同的分离培养方法,有类似的表面标记物表达及成脂成骨分化潜能,生物学特性具有一致性,是自体脂肪干细胞移植临床前研究的良好模型。     

曲古抑菌素A对大鼠脂肪干细胞在二维及三维培养下早期骨向分化的影响

目的:研究曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在二维培养板(TCP)和三维复合纳米羟基磷灰石/胶原(nano-hydroxyapatite/collagen,nHAC)支架上早期骨向分化的影响?方法:处理组分别在含75 nmol/L TSA的二维培养板和三维 nHAC上培养ADSCs(TCPT组和nHACT组),未添加TSA的两组(TCP组和nHAC组)为对照组?使用扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)对接种ADSCs 1?3 d后nHAC和nHACT组细胞的生长情况进行表征,以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,分别检测3?5?7 d时的ALP活性,用Western blot检测成骨指标Runx2?骨桥蛋白(OPN)?骨形态发生蛋白2(BMP2)的表达?结果:ADSCs在三维培养中均表现出良好的粘附?铺展,其中经TSA诱导的细胞对支架的黏附?铺展更好;ALP值在3?5?7 d持续增高,其中以nHACT组最高,组间差异显著(P < 0.05);Western blot结果显示Runx2?OPN?BMP2在 nHACT组表达最高,与ALP结果一致?结论:TSA对ADSCs早期骨向分化有促进作用,复合三维支架共培养后促进作用显著?     

低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响

目的 研究低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响。方法 采用组织块法分离培养兔脂肪间充质干细胞。用倒置显微镜观察原代细胞的细胞形态,流式细胞仪检测兔脂肪间充质干细胞的免疫表型。取第3代兔脂肪间充质干细胞置于-196℃液氮保存半年,37℃复苏并传至第7代。实验分为两组,实验组为冻存复苏后传至第7代的兔脂肪间充质干细胞,对照组为未冻存的第7代兔脂肪间充质干细胞,用MTT绘制其生长曲线;添加成脂、成骨诱导液进行诱导,油红O、茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测分别进行鉴定。结果 体外培养的兔脂肪间充质干细胞呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛。流式细胞仪检测显示,第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD44、CD90,阴性表达造血细胞相关的表面标志CD45。两组细胞生长曲线呈典型的“S”形,无统计学差异（P>0.05）;成脂诱导14 d后,油红O染色呈阳性;成骨诱导2周时茜素红染色阳性,ALP表达活性随成骨诱导时间延长不断增加且无统计学差异（P>0.05）。结论 冻存后的兔脂肪间充质干细胞体外生长及多向分化潜能未发生显著变化。     

兔不同部位脂肪间充质干细胞成骨能力的差异

目的观察兔不同部位来源的脂肪间充质干细胞（ADSCs）分化成骨的能力。方法分别从一只新西兰兔的腹股沟、腹膜后、颈背部取出脂肪组织并提取脂肪间充质干细胞,体外培养传至第5代,加入诱导剂分别进行成骨诱导,不加入诱导剂的为对照组。观察通过钙钴染色、茜素红染色、碱性磷酸酶活性检测细胞成骨能力。结果经钙钴染色及茜素红染色后,诱导组大部分细胞呈阳性反应,以腹股沟部脂肪间充质干细胞的结节体积最大,对照组未见明显阳性细胞。细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性检测表明诱导组比对照组ALP活性明显升高（P〈0.05）;腹股沟部脂肪间充质干细胞ALP活性较颈背部及腹膜后高,差异有统计学意义（P〈0.05）;颈背部与腹膜后相比较无明显差异（P〉0.05）。结论兔ADSCs经过体外诱导后,具有成骨能力;腹股沟部脂肪可作为骨组织工程种子细胞来源的较佳取材部位。     

同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨材料修复兔尺骨缺损

目的：探讨同种异体脂肪干细胞（adipose—derivedstemcells,ADSCs）组织工程骨修复兔管状骨缺损的可行性。方法：获取新西兰大白兔的肩胛部脂肪,分离培养具有多向分化潜能的ADSCs;第三代兔ADSCs与脱钙骨复合后,体外成骨诱导培养（LG—DMEM）设为对照。制造兔两侧尺骨临界大小（长度15mm）的缺损,分别植入兔ADSCs一脱钙骨复合物（实验侧）和单纯脱钙骨材料（对照侧）;12周后取样本,三维CT和组织学检测观察成骨情况。结果：细胞一材料复合物植入12周后,三维CT显示实验侧有新生骨基质长成,对照侧未见骨组织生成;组织学检测显示实验侧缺损区被典型的骨组织取代,可见新生骨小梁附着于脱钙骨表面,而对照侧只有少量的骨组织和纤维组织充填。结论：兔ADSCs能在脱钙骨上很好的黏附和生长,兔ADSCs-脱钙骨材料复合物植人体内能成功修复临界大小的管状骨缺损。     

脂肪来源的干细胞复合壳聚糖支架促进大鼠颅骨缺损修复的实验研究

目的：探讨以脂肪来源的干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）为基础构建组织工程生物材料修复大鼠颅骨缺损的效果。方法：分离、培养ADSCs,并进行成骨、成脂、成软骨三系分化。制备壳聚糖多孔支架,扫描电镜观察接种ADSCs前后的微结构变化,以细胞活力试剂盒测试ADSCs接种于壳聚糖多孔支架后的细胞活力。取15只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠予手术制备颅骨缺损模型,将缺损留空或植入壳聚糖支架,壳聚糖支架表面预先种植低密度（2.5×105）或高密度（1×106）ADSCs。术后8周收集样品用于微型计算机断层扫描分析,随后脱钙,石蜡包埋切片后行苏木素-伊红染色和免疫组化染色观察成骨指标骨涎蛋白。结果：ADSCs可以成功诱导成骨、成软骨和成脂肪分化;扫描电镜和细胞活力测试结果提示壳聚糖支架呈现多孔结构,ADSCs可黏附于支架并增殖,增殖效果与普通培养板相比无统计学差异。在大鼠颅骨缺损模型中,高密度ADSCs/壳聚糖支架组骨组织体积百分数分别比空白对照组和低密度ADSCs/壳聚糖支架组升高140.8%（P=0.014）和37.4%（P=0.036）。与空白缺损对照组相比,低密度ADSCs/壳聚糖支架组和高密度ADSCs/壳聚糖支架组骨密度分别升高29.4%（P=0.123）和64.1%（P=0.022）。组织学结果表明,骨缺损区新生骨组织的分布和数量与微型计算机断层扫描分析结果一致。成骨分化指标骨涎蛋白在高密度组表达有增高趋势。结论：高密度ADSCs复合壳聚糖支架可有效修复大鼠的颅骨缺损。     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7（BMP-7）的骨髓基质干细胞（BMSCs）,并与纳米羟基磷灰石胶原（nHAC）材料复合培养体外构建组织工程骨。方法用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养。荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;以四唑盐（MTT）实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶（ALP）活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况。结果慢病毒24h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异（P〉0.05）;RT-PCR检测到BMP-7表达,在1300bp处出现特异性条带;ELISA检测24hBMP-7蛋白含量为（150.2±18.3）pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好。结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨。     

利福平对兔脂肪干细胞增殖、成骨及黏附支架的影响

目的探讨利福平（rifampicin,RFP）对兔脂肪干细胞（rabbitadipose-derivedstemcells,rADSCs）增殖、成骨及黏附支架的影响,为后期RFP缓释系统与rADSCs的复合奠定实验基础。方法分离培养rADSCs,检测细胞周期及表面抗原CD44,成骨、成脂诱导后分别行茜素红及油红O染色。用利福平生长液干预rADSCs,按浓度分为0、10、20及30μg／ml4组,分别绘制细胞生长曲线、检测细胞凋亡率及碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）含量。制备同种异体脱钙骨支架,并复合各组rADSCs,计算细胞黏附率,扫描电子显微镜观察复合情况。结果rADSCs呈长梭形生长,G0／G1期占78．3％±4．2％,表面抗原CD44阳性表达。成骨诱导后茜素红染色及成脂诱导后油红O染色均为阳性。生长曲线示30μg／ml组第4-11天增殖能力较其他3组弱（P〈0．01）,细胞凋亡示30μg／ml组凋亡率高于其他3组（P〈0．01）,ALP检测示成骨诱导后第14天30μg／ml组ALP含量较其他3组少（P〈0．01）,细胞黏附率示30μg／ml组较其他3组低（P〈0．01）。扫描电镜观察30μg／ml组黏附的细胞数量少,形态松散。结论不影响rADSCs增殖、成骨及黏附支架的RFP临界浓度约为20μg／ml。     

兔脂肪干细胞(ADSCs)与聚羟基乙酸/壳聚糖(PLGA/CS)支架材料生物相容性研究

 目的  探讨兔脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为种子细胞复合新型聚羟基乙酸(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)/壳聚糖(chitosan,CS)支架材料的生物相容性,为进一步构建组织工程化脂肪组织提供实验依据。方法  取雄性新西兰大白兔腹股沟脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化分离出ADSCs进行培养,贴壁细胞至3~5代,评价其多向分化能力。将干细胞收集重悬后,以l×107/mL的密度接种于多孔PLGA/CS支架,形成细胞 支架材料复合物。培养7天后,扫描电子显微镜观察细胞在支架材料上的黏附生长和基质分泌情况,评价细胞与支架材料的生物相容性;Dil荧光标记检测细胞在支架材料上的分布;Hochest 33258检测细胞在支架上的生长情况。接种1和7天后,分别对细胞 材料复合物行Annexin V/PI双染色法检测材料对细胞的毒性作用。用成脂诱导条件培养基诱导分化ADSCs及ADSCs支架材料复合物,7天后,尼罗红荧光染色液检测ADSCs在不同环境下的成脂分化能力。结果  原代培养的ADSCs呈成纤维细胞样外观,在相应诱导条件下能够分化为脂肪细胞和骨细胞。细胞接种于PLGA/CS支架材料上第8天分裂增殖达到高峰,扫描电子显微镜下提示ADSCs在支架表面贴附生长良好,并向孔隙内壁充分延伸,细胞周围形成丰富的基质成分。活死双染结合共聚焦显微镜显示材料对细胞活性无影响,尼罗红染色可见成脂诱导后的ADSCs细胞质内有红色脂滴颗粒形成。结论  多孔PLGA/CS支架与兔ADSCs具有良好的生物相容性,可作为构建组织工程脂肪组织的支架材料。     

矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原的实验研究

目的观察矿化诱导培养能否促进冻存骨髓基质细胞（BMSCs）在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原,为牙周组织工程中选择适宜的种子细胞的保存和培养条件提供参考。方法体外分离培养Beagle犬BMSCs,经冻存12个月后,在矿化诱导培养液（矿化诱导组）或基础培养液（非矿化诱导组）中形成BMSCs-胶原膜支架复合物,将矿化诱导培养液处理的单纯胶原膜支架（空白对照组）、2种BMSCs-胶原膜复合物分别植入裸鼠背部皮下组织中,术后第4周行组织病理学和免疫组织化学观察,分析各组标本中的Ⅰ型胶原形成量。结果空白对照组植入胶原膜后,新生胶原分布很少;非矿化诱导组胶原分布明显增多;矿化诱导组中见大量新生的胶原形成。免疫组织化学光密度测量显示,矿化诱导组（0.1963±0.0126）〉非矿化诱导组（0.1489±0.0037）〉空白对照组（0.0775±0.0058）（P〈0.05）。结论矿化诱导培养能够促进冻存的BMSCs在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原。     

经微弧氧化/碱处理并加载RGD肽涂层多孔钛合金支架的制备及其生物学特性

目的 通过3D打印技术打印多孔钛合金支架,研究其表面微弧氧化（MAO）/碱处理并加载精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽涂层对前成骨细胞生物学行为的影响。 方法 设计并打印3D多孔钛合金支架,对其进行不同表面处理后分为MAO组、MAO/碱处理（MN）组、MAO/碱处理加载RGD肽（MNR）组,另设空白对照组。检测各组多孔钛合金支架的弹性模量,扫描电子显微镜（SEM）观察各组多孔钛合金支架表面微观结构,能谱分析仪（EDS）检测各组多孔钛合金支架表面元素构成,接触角测量仪检测各组多孔钛合金支架表面水滴接触角大小。将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1细胞）与各组支架共培养,CCK-8法检测各组多孔钛合金支架表面细胞增殖活性,Live/Dead细胞染色法检测各组多孔钛合金支架的生物相容性,细胞黏附实验观察各组细胞在多孔钛合金支架表面黏附情况,采用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测各组细胞ALP活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中Runt相关转录因子2（Runx2）、骨桥素（OPN）和骨钙素（OCN）mRNA表达水平。 结果 3D打印多孔钛合金支架的弹性模量为（1.17±0.62） GPa。SEM观察,MAO处理后的多孔钛合金支架表面呈现火山口样形貌,碱处理后出现细小裂纹并呈现纳米级鱼鳞结构,加载RGD肽涂层的多孔钛合金支架表面观察到散在的RGD颗粒。EDS检测,MNR组支架表面RGD涂层成功加载。接触角测量仪检测,多孔钛合金支架表面接触角MAO组>MN组>MNR组。CCK-8法,培养第1、3和5 天时3组细胞增殖活性均呈增长趋势,培养第3和5 天时各组细胞增殖活性组间比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。Live/Dead细胞染色,3组支架均具备良好的体外相容性。细胞黏附实验,共培养48 h后,MNR组细胞数量和形态伸展均优于MAO组和MN组。培养第7天时,与MAO组比较,MNR组细胞ALP活性明显升高（P<0.01）,培养第14天时3组细胞ALP活性组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。RT-qPCR法检测,培养第7天时,与空白对照组和MAO组比较,MN组和MNR组细胞中Runx2和OPN mRNA表达水平均明显升高（P<0.01）,MNR组细胞中OCN mRNA表达水平明显升高（P<0.05）;培养第14天时,MAO组、MN组和MNR组细胞中Runx2和OPN mRNA表达水平组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,与空白对照组比较,MAO组、MN组和MNR组细胞中OCN mRNA表达水平均明显升高（P<0.01）。 结论 3D打印多孔钛合金支架具有与人体骨组织匹配的弹性模量,支架表面MAO/碱处理并加载RGD肽涂层对MC3T3-E1细胞无毒性且对其成骨分化有促进作用。     

间介中胚层样细胞在肾脏再生中的应用

目的 体外诱导脂肪干细胞分化为间介中胚层样细胞,对肾脏脱细胞支架进行再细胞化,经共培养构建有部分肾脏结构的组织工程肾脏。方法 手术获取Wistar大鼠腹股沟脂肪垫,从中分离、培养原代脂肪干细胞后对其进行干细胞特性鉴定。经过在不同阶段添加糖原合成酶激酶3抑制剂(CHIR99021)和成纤维生长因子9(FGF9),诱导脂肪干细胞分化为间介中胚层样细胞,并于诱导7 d后进行间介中胚层相关蛋白鉴定。将诱导成功的间介中胚层样细胞结合制备好的肾脏脱细胞支架进行共培养,10 d后获取再细胞化的组织工程肾脏,并对其进行肾脏分化的鉴定。结果 获取的脂肪干细胞具有成骨成脂及成软骨分化的能力,能表达脂肪干细胞表面标志物。体外诱导7 d后得到的间介中胚层样细胞经过免疫荧光鉴定可以观察到锌指蛋白转录因子和配对盒基因-2的阳性表达,Western blot验证可得到同样的阳性结果。结合肾脏脱细胞支架后培养10 d,通过免疫荧光鉴定可以观察到Wilms肿瘤基因1、GATA连接蛋白-3和E-钙黏素的阳性表达。结论 脂肪干细胞可被诱导分化为间介中胚层样细胞,诱导后的间介中胚层样细胞结合肾脏脱细胞支架可以观察到肾系分化的现象。     

骨髓间充质干细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚复合物支架修复组织损伤的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚复合物（PLGA）的构建及对损伤组织的修复效果。方法 （1）分离培养新西兰幼兔骨髓间充质干细胞（MSC）,4,6联脒-2苯基吲哚（DAPI）标记后接种于PLGA支架上。扫描电镜和免疫荧光显微镜观察不同时间段MSC在支架上的生长情况。（2）分别将MSC-PLGA复合物及PLGA支架移植于新西兰大白兔背部皮肤创面。术后观察创面愈合情况,5周后取移植物行HE染色、VG染色及细胞角蛋白AE1／AE3免疫荧光组化检测。结果 MSC在支架上生长良好,细胞数量随时间增长而逐渐增加,第10天细胞达到90％融合。MSC-PLGA复合物所修复创面,随着聚合材料的降解,逐渐形成新生皮肤,HE染色及VG染色示新生皮肤与正常皮肤结构相似,且荧光显微镜下可见胞核呈蓝色荧光的角化层细胞及毛囊细胞,其胞浆同时表达角蛋白。PLGA支架所修复创面则新生皮肤仅见少量毛囊,并见增厚的纤维瘢痕。结论 骨髓间充质干细胞复合PLGA聚合物是良好的移植替代物。     

丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石骨组织工程支架材料的体外细胞毒性评价

目的 探讨丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架与兔骨髓间充质干细胞的体外细胞毒性.方法 采用丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的生物支架与兔骨髓间充质干细胞体外共培养,用材料的细胞毒性、细胞黏附率、细胞增殖活力指标以MTT法、倒置显微镜及电镜观察来评价.结果 细胞在支架材料上黏附、生长良好,分裂增殖活跃,细胞毒性检测CTG均为0级,实验组与时照组细胞黏附率比较无统计学差异（P＞0.05）,实验组与对照组细胞增殖活力随着时间增加,细胞在支架增殖速度增快.第1、3、5、7天实验组与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）.扫描电镜观察发现细胞培养7天后生长良好,分裂正常,与支架材料黏附紧密.结论 支架材料对细胞无毒性,具有很好的细胞相容性.     

软骨形态发生蛋白1诱导SD仔鼠脂肪干细胞修复兔膝关节软骨缺损的研究

目的:应用软骨形态发生蛋白1(CDMP1),以诱导SD仔鼠脂肪干细胞(ADSCs)以修复兔膝关节软骨缺损,探讨异种细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法:自SD仔鼠腹股沟脂肪组织分离、培养ADSCs,复合于自制牛松质骨支架上,经CDMP1诱导,体外继续培养2周,免疫组化鉴定后备用。建立兔双侧髌骨关节缺损模型。左侧缺损处植入ADSCs-支架复合物,为实验侧;右侧缺损处植入空支架,为对照侧。术后8、16、24和48周各处死9只兔子,缺损处行H-E染色和番红O染色。结果:实验侧8周时可见缺损周围表面充填有薄层白色半透明组织,与周围软骨的界线清楚;16周时缺损表面界限连接较8周时模糊,但仍可辨,24周时,修复良好,修复区新生软骨细胞与周围正常软骨细胞形态相近,呈球形,可见软骨陷窝,H-E染色和番红O染色阳性;48周时,能较容易分清缺损处与修复区的界限,修复效果不及24周时。对照侧8、16、24和48周4个时期标本基本相同,软骨缺损处与周围正常组织边界清楚,缺损处凹陷空洞,被肉芽组织填充,新生细胞呈长梭形,H-E染色和番红O染色阴性。结论:利用CDMP1诱导SD仔鼠ADSCs复合自制牛松质骨支架可较好修复兔膝关节软...     

碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对许旺细胞在小肠粘膜下层增殖活性的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）缓释微球对许旺细胞（SC）在小肠粘膜下层（SIS）上增殖影响。方法运用双酶两步消化法对 SC 进行体外分离、培养、纯化,将 bFGF-PLGA 缓释微球（bFGF-PLGA-MS）与 SC 及 SIS进行体外复合培养,并以游离 bFGF 组及单纯培养液组进行对比,观察 bFGF-PLGA 缓释微球对 SC 在 SIS 上增殖影响。结果运用双酶两步消化的体外原代培养方法获取的许旺细胞数量较多,细胞纯度可达90%以上。细胞的体外增殖活性良好,细胞增殖周期约为6～7d,培养后2～7d 为对数生长期,第7d 后进入生长平台期; bFGF 缓释微球能持续地促进许旺细胞在 SIS 上的增殖;细胞增殖周期缩短,细胞能较稳定地保持着良好的活性;提高了细胞增殖指数,并使 SIS 上的 SC持续保持较高的增殖活性;细胞数量与 bFGF 含量的相关系数为0.988（P =0.02）,表明两者间有明显正相关关系。结论bFGF-PLGA 微球的药物缓释促进了SC 在SIS 上持续而稳定的增殖,为以SC 复合SIS 构建人工神经提供了有利条件。