腺病毒 rhBMP-2转染兔 BMSCs 复合同种异体脱钙骨基质的生物相容性研究

目的：探讨腺病毒重组人骨形态发生蛋白-2（Ad-rhBMP-2）转染兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合同种异体脱钙骨基质（DBM）的生物相容性。方法参照 Urist 方法制得兔同种异体 DBM 材料,免疫组化观察转染后 BMSCs 内 BMP-2表达情况;转染48 h 后复合同种异体 DBM 上,扫描电镜观察细胞生长、贴附情况,MTT 法检测细胞增殖情况。结果腺病毒转染48 h 后,BMSCs 能够表达 BMP-2,扫描电镜可见转染后的细胞在 DBM 上贴附良好并且大量增殖。MTT 检测结果显示,种植于DBM 上的转染后细胞增殖情况正常,与对照组比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论Ad-BMP-2转染 BMSCs 与同种异体DBM 的生物相容性良好。     

腺病毒介导的BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响

目的: 用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响.方法: 用Ad-BMP-2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响.酶标法检测ALP活性;免疫荧光检测骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响.结果: BMP-2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达.流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异.ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质.结论: 在腺病毒载体介导下BMP-2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化.     

LIM矿化蛋白-1对间充质干细胞成骨分化影响的实验研究

目的：构建LIM矿化蛋白-1（LIM mineralization protein-1,LMP-1）的真核表达质粒,并在兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）内表达,研究LMP-1对体外培养BMSCs成骨分化的影响。方法：RT-PCR克隆hLMP-1和骨形态发生蛋白－２（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）,并构建pIRES2-EGFP-LMP－1及pIRES2-EGFP-BMP－2重组质粒。分离培养BMSCs,脂质体介导下将pIRES2-EGFP-LMP－1、pIRES2-EGFP-BMP－2和pIRES2-EGFP质粒转染BMSCs。7 d后收集细胞,RT-PCR比较hLMP-1、hBMP-2及Ⅰ型胶原的表达,检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,免疫组化染色比较骨钙素表达。结果：pIRES2-EGFP-LMP-1和pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒构建成功。重组质粒成功转染BMSCs,RT-PCR证实表达目的基因,hLMP-1和hBMP-2转染组可以明显促进细胞分泌ALP的活性,诱导Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。结论：LMP-1可以促进BMSCs向成骨细胞分化。     

改良腺病毒AdF35-eGFP转染人 及大鼠骨髓间充质干细胞的效率对比研究

目的：比较改良腺病毒AdF35-增强绿荧光蛋白（eGFP）转染人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）和大鼠骨髓间充质干细胞(rat BMSCs, rBMSCs)的效率。方法：分别从人体、大鼠骨髓中分离出BMSCs,成骨、成脂诱导培养以鉴定BMSCs。构建含eGFP的AdF35重组腺病毒载体AdF35-eGFP,以不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)分别转染BMSCs后,MTT检测AdF35-eGFP对2种BMSCs的毒性作用,荧光显微镜观察eGFP的表达,流式细胞仪检测转染效率,实时定量PCR检测2种BMSCs表达柯萨奇腺病毒受体(CAR)和CD46 mRNA的水平。结果：hBMSCs和rBMSCs从骨髓中分离出来后,分别成功诱导分化成骨和成脂。当MOI为1 000 PFU/mL时,AdF35-EGFP对2种BMSCs的活性均有明显抑制作用（P<0.001）。AdF35-eGFP感染hBMSCs 48 h后,荧光显微镜下可见发强烈绿色荧光的细胞,流式细胞仪检测其转染效率可达(84.8±7.1)％;Ad5-eGFP感染rBMSCs后,荧光显微镜下仅见少量发绿色荧光的细胞,48 h转染效率为(3.1±1.1)％。hBMSCs高表达CD46 mRNA,低表达CAR mRNA;而rBMSCs则高表达CAR mRNA,低表达CD46 mRNA,2种基因的表达差异有统计学意义（P<0.01）。结论：AdF35可作为理想载体携带目的基因转染hBMSCs,但不适合作为转染rBMSCs的载体。     

携载增强型绿色荧光蛋白基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞示踪方法

目的本实验研究旨在研究使用携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP的慢病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cell,BMSCs)的方法,用于解决组织工程骨研究中种子细胞分化、增殖过程中的示踪问题。方法用携带eGFP的慢病毒转染第3代BMSCs,用流式细胞仪检测转染率,获得稳定表达eGFP的BMSCs,并通过描绘生长曲线来判定对BMSCs增殖性能的影响。结果当MOI值为70时,经eGFP慢病毒转染后的BMSCs能够得到活性较好、转染率高的eGFP-BMSCs;转染后各细胞生长曲线呈"S"形,MOI=70与MOI=0时细胞增殖最好,MOI=100会对BMSCs增殖造成影响。结论 MOI=70时携载eGFP基因慢病毒转染BMSC效果最好。     

多孔细菌纤维素-聚乳酸乙醇酸-羟基磷灰石复合支架的制备及性能研究

目的制备多孔细菌纤维素（bacterial Cellulose,BC）-聚乳酸乙醇酸（poly lactic-co-glycolic acid,PLGA）-羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）复合支架并研究其相关性能。方法溶液浇铸/粒子沥滤法制备多孔BC-PLGA-HA复合支架,扫描电镜观测所得支架表面形貌并测定其抗张强度和孔隙率;体外接种成骨样细胞MG-63培养,以细胞培养板作对照组,通过扫描电镜（SEM）、四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法以及碱性磷酸酶（ALP）检测来初步评价支架对MG-63细胞黏附、增殖活性以及ALP活性的影响。结果多孔BC-PLGA-HA支架抗拉强度为（8.923 1±0.901 2）N/mm2,孔隙率为（64.73±5.65）%;扫描电镜、MTT及ALP检测结果显示支架对成骨样细胞MG-63具有较高的增殖活性及ALP活性。结论多孔BC-PLGA-HA复合支架具良好的力学性能、孔隙率和生物相容性,有望作为一种新型组织工程支架材料。     

携带hHCN4基因重组腺病毒载体体外转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建重组腺病毒载体Ad-hHCN4-IRES/eGFP在体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）,检测目的基因在BMSCs中mRNA和蛋白水平是否有表达。方法采用贴壁培养法分离纯化大鼠BMSCs;将携带hHCN4基因的重组腺病毒转染大鼠BMSCs,用荧光显微镜观察转染后BMSCs绿色荧光蛋白的表达,用RT-PCR和Western Blot法检测转染后hHCN4基因mRNA和蛋白水平的表达情况。结果 BMSCs成功贴壁分离传代。转染目的基因24 h后荧光显微镜下即观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测到有hHCN4 mRNA的表达,Western blot法检测到有其蛋白水平的表达。结论重组腺病毒载体转染的BMSCs能够表达hHCN4基因。     

骨形态发生蛋白-7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

目的探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在雷奈酸锶(Strontium ranelate,Sr)促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化中的作用。方法体外分离培养4周龄大鼠BMSCs,取第3~4代,用细胞碱性磷酸酶标法检测不同浓度Sr作用下碱性磷酸酶(ALP)活性的表达;用茜素红染色法检测钙结节的表达;用Western blot测定BMP-7的表达水平。结果在0.1~3.0 mmol/L的浓度范围内,Sr呈浓度依赖性地增加ALP活性,其浓度为3 mmol/L时,ALP活性表达最高,并明显促进钙结节的表达;Sr(0.1~3.0 mmol/L)呈浓度依赖性地上调BMP-7表达,其中浓度为3 mmol/L时,BMP-7表达最高;BMP-7阻断剂(noggin)(100 ng/ml)不仅抑制Sr诱导的BMP-7表达,而且使ALP活性及钙结节的表达明显下降。结论 Sr可通过上调BMP-7表达促进BMSCs向成骨细胞分化。     

人骨形成蛋白9基因修饰的兔骨髓间充质干细胞异位成骨实验研究

目的 探讨人骨形成蛋白9(human bone morphogenetic 9, hBMP-9)基因治疗与骨组织工程技术相结合的可行性.方法 采用阳离子脂质体介导hBMP-9基因转染兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),荧光显微镜观察及流式细胞学检测,碱性磷酸酶(ALP)活性定量测定及Von Kossa's钙结节染色;MSCs与聚乳酸-羟基乙酸(polylactide-co-glycolide, PLGA)支架共培养,荧光显微镜及扫描电镜观察MSCs在PLGA上的黏附、生长情况;将转染与未转染hBMP-9基因的MSCs分别与PLGA支架复合培养,构建组织工程化骨并回植兔肌肉内,组织植入4、8周后进行HE染色观察.结果 流式细胞仪测定质粒转染率为34.15%;转染组MSCs的ALP活性较未转染组明显增高(P<0.01),Von Kossa's钙结节染色比较转染细胞形成的钙结节明显大于未转染组;荧光显微镜及扫描电镜观察见MSCs在PLGA支架上的黏附、生长良好;异位回植术后4、8周组织HE染色见肌肉内有新生骨基质分泌,成骨面积定量分析转染组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 阳离子脂质体介导的质粒能稳定转染MSCs,BMP-9能刺激MSCs的ALP活性增强,诱导钙结节形成;BMP-9基因转染的MSCs作为一种新型的种子细胞,其与PLGA支架复合用于骨缺损的修复具有较强的可行性.     

雷奈酸锶通过骨形态发生蛋白-2/Smad通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）/Smad通路在雷奈酸锶（Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为成骨细胞
过程中的作用。方法体外分离培养大鼠BMSCs,根据实验目的加入不同浓度Sr、BMP-2 的拮抗剂noggin 及Smad1 小干扰
RNA（SiRNA）。酶标法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色检测钙结节,Western blotting法检测磷酸化Smad1/5/8及Runt
相关转录因子-2（Runx2）蛋白的表达。结果应用0.1~10 mmol/L Sr处理BMSCs细胞1 h后,细胞内磷酸化Smad1/5/8表达增
高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h能抑制Sr对磷酸化
Smad1/5/8表达的上调作用;应用0.1~5 mmol/L Sr处理细胞6 h后,细胞内Runx2表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到
高峰;在Sr处理BMSCs前,应用Smad1 SiRNA转染细胞后能下调Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8的表达,并抑制Sr对Runx2表
达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论BMP-2/Smad通路参与了Sr促进BMSCs成骨分化。
     

可长时间缓释骨形态发生蛋白2的聚己内酯复合支架的制备及应用

目的 制备一种可长时间缓释骨形态发生蛋2(BMP-2)的聚己内酯(PCL)复合支架,并通过检测其对人源骨髓间充质于细胞(BMSC)成骨分化的影响探讨其在骨组织工程中的应用.方法 将磷脂(PL)和BMP-2混合形成的BMP-2/PL混合物(B/P)分散在二氯甲烷中,与PCL混合后,采用相分离法制备负载BMP-2的三维PCL-B/P复合支架和PCL-B传统支架,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两种支架的BMP-2缓释效果.将BMSC种植在PCL-B传统支架和PCL-B/P复合支架中,分别采用CCK-8法和实时定量PCR(qPCR)检测两种支架上BMSC的增殖和成骨分化能力.结果 与PCL-B传统支架对比,PCL-B/P复合支架对BMP-2缓释效果更佳,缓释时间更长,可达22 d.在BMSC培养的第7、14和21天,PCL-B/P复合支架上BMSC的增殖能力均优于PCL-B传统支架(P＜0.05),且PCL-B/P复合支架上BMSC中碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原蛋白、骨钙、骨桥蛋白3种成骨基因mRNA的表达均高于PCL-B传统支架(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功地制备出一种可长时间缓释BMP-2的高分子三维PCL-B/P复合支架,其较PCL-B传统支架能更好地诱导BMSC的增殖和成骨分化.     

Antagomir-30d对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨miR-30d拮抗剂（antagomir-30d）正性调控大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的成骨分化作用并确认转染的最佳浓度。方法：BMSCs培养并分组，分为不同浓度的antagomir-30d（antagomir-30d组）、阴性对照（NC组）和未做转染的BMSCs（空白组）；将不同浓度的antagomir-30d及其NC转染至BMSCs后进行成骨诱导。通过RT-PCR技术进行比较，测定成骨基因碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）、Runt相关转录因子2（RUNX2）的mRNA的表达情况，并确定最佳转染浓度及其转染效率。通过ALP染色验证antagomir-30d对成骨分化的调控作用。结果：RT-PCR结果表明，antagomir-30d体外可以促进BMSCs的成骨分化。不同浓度antagomir-30d组的成骨基因表达量随浓度变化而改变，当antagomir-30d转染浓度为150 nmol/L时，ALP、OC、RUNX2的mRNA水平均显著高于空白组和NC组（P＜0.05）。Antagomir-30d的转染最佳浓度为150 nmol/L，此时ALP染色结果显示其活性最高，成骨分化作用好。结论：Antagomir-30d体外正性调控BMSCs的成骨分化，其转染至BMSCs的最佳浓度为150 nmol/L。     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

LncRNA AK051397在BMP-2诱导的C2C12成骨分化中的作用

目的研究骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）诱导后表达上调的LncRNA AK051397在C2C12成骨分化过程中的作用。方法 BMP-2诱导C2C12成骨分化过程,实时定量PCR技术与碱性磷酸酶（ALP）染色检测成骨相关指标。对C2C12细胞在BMP-2诱导下,成骨分化过程中的LncRNAs表达变化进行芯片分析（ArrayStar LncRNA Array）,筛选出表达明显上调的LncRNAs,最后采用siRNA干扰的方法下调LncRNAs表达后分析其对成骨分化过程的影响。结果 BMP-2诱导C2C12成骨分化过程中,成骨指标ALP、SPT增高,成肌指标MYOG降低。芯片结果表明,LncRNA AK051397在BMP2诱导后表达明显上调,处理组与未处理组相比升高4.9倍（P〈0.05）。干扰AK051397后成骨分化指标ALP、SP7表达下降,MYOG表达上升。结论 LncRNA AK051397在C2C12细胞中具有促进成骨分化的作用,同时也具有抑制细胞成肌分化的作用。     

表面修饰对纳米晶胶原基骨细胞相容性的影响

目的:探索纤维蛋白(fibrin,FB)修饰的纳米晶胶原基骨(nanoHydroxyapatite/collagen,nHAC)支架材料上成骨诱导的骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)黏附、增殖及分化的情况。方法:实验分为两组:实验组,纤维蛋白修饰的纳米晶胶原基骨(FB-nHAC);对照组,单纯的纳米晶胶原基骨(nHAC)。将SD大鼠骨髓间充质干细胞定向诱导为成骨细胞,种植于支架材料上,体外复合培养。通过检测支架材料的细胞黏附率、不同时间点(3,7,10,14 d)支架材料中细胞数、碱性磷酸酶表达量以及扫描电镜观察细胞在支架材料上的生长状况,比较分析不同支架材料与细胞生物相容性差异。结果:大鼠MSCs经诱导培养14 d后,I型胶原免疫荧光染色为阳性;实验组支架材料的细胞黏附率显著高于对照组(P<0.05);且相同时间点实验组支架材料中的细胞数及碱性磷酸酶表达量也明显高于对照组(P<0.05);电镜观察发现两组材料上均有细胞生长,但实验组的细胞生长状况明显好于对照组。结论:表面修饰纤维蛋白后的nHAC支架材料具有更好的细胞黏附、增殖及促成骨分化能力。     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

阿仑膦酸钠对骨髓间充质干细胞骨向诱导的实验研究

目的探讨阿仑膦酸钠(ALN)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和骨向分化能力的影响,观察其促BMSCs骨向分化过程中对转化生长因子β1(TGF-β1)及骨形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响,分析可能的作用途径。方法以碱性磷酸酶(ALP)等指标确定干预药物不同浓度梯度中最佳促BMSCs骨向分化剂量;分组实验,通过检测诱导分化过程中ALP和钙化结节等指标的表达,观察其对BMSCs骨向分化能力的影响;ELISA法检测骨向分化过程中TGF-β1、BMP-2的表达。结果 ALN最佳促BMSCs增殖和骨向分化浓度为1×10-8mol/L,该浓度ALN能促进成骨指标的表达和TGF-β1和BMP-2分泌增加;具有促BMSCs骨向分化能力的ALN各诱导组均伴随TGF-β1和BMP-2分泌增加。结论 ALN能促进BMSCs增殖和骨向分化;在BMSCs骨向分化过程中,上调TGF-β1、BMP-2的表达量可能是各干预药物促进MSCs骨向分化的作用机制之一。     

hBMP-4瞬时转染对兔骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的应用兔骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,MSCs)作为基因治疗的靶细胞,体外转染人骨形成蛋白4(humanbonemorphogeneticprotein-4,hBMP-4)基因,观察瞬时转染对兔MSCs生物学行为的影响。方法贴壁法培养兔MSCs,分别在体外转染pEGFP-hBMP-4和pEGFP基因并留置空白对照。检测转染效率及目的基因的转录和表达,观察细胞形态及生长情况,检测碱性磷酸酶、钙结节及骨钙素等成骨细胞表型。结果基因转染效率达到20%～30%,RT-PCR显示MSCs本身有目的基因的少量转录,转染pEGFP-hBMP-4后转录增强。目的基因转染后细胞形态略有变化,生长曲线与对照组相似,碱性磷酸酶阳性染色面积增加(P=0.0016),钙结节增多(P=0.0001),骨钙素表达增强(P=0.03)。结论优化的条件下取得了较高的转染效率,hBMP-4基因转染可以增强目的基因的转录,加速MSCs向成骨细胞表型转化。hBMP-4转染的MSCs可望成为组织工程化骨理想的种子细胞。     

多肽水凝胶复合支架对大鼠脂肪干细胞体外增殖和分化的影响

目的:研究多肽水凝胶复合骼金(nano-hydroxyapatite/collagen, nHAC)对大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外增殖和早期骨向分化的作用?方法:用1%的多肽水凝胶与nHAC制备复合支架,未复合水凝胶的nHAC为对照组,使用扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)和共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)进行表征,将ADSCs接种到两种支架材料上,以CCK-8检测1?3?5?7 d的增殖情况,以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,检测其3?5?7 d 的活性?结果:多肽水凝胶在nHAC表面形成涂层,ADSCs在有涂层的nHAC上黏附?铺展得更好,两种支架上的ADSCs在1?3?5?7 d都持续增殖,其中两组间在1?3 d无差异,5?7 d有差异,实验组增殖更快(P < 0.05);ALP值在3?5?7 d都持续增高,实验组更高,两组间有差异(P < 0.05),但在3?5?7 d时两两比较差异不显著(P > 0.05)?结论:多肽水凝胶复合支架材料能显著促进ADSCs的黏附增殖,对细胞早期骨向分化有一定的促进作用,但不如对细胞增殖的促进作用显著?