光果甘草CHS基因的克隆与多态性分析

目的:克隆光果甘草Glycyrrhiza glabra查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因并分析其基因多态性。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从光果甘草主根中扩增得到CHS c DNA序列,测序并运用生物信息学软件对测序结果进行分析。结果:克隆得到19条长度为1 175 bp的光果甘草CHS c DNA序列,测序结果显示其一致性99.10%,存在81个变异位点,可分为17种单倍型;氨基酸序列分析显示,这19条c DNA序列共编码14种氨基酸序列类型,一致性99.34%,存在25个变异位点。生物信息学分析表明光果甘草CHS c DNA序列编码蛋白为稳定性亲水蛋白,平均相对分子质量42.6 k Da,等电点5.75~6.21,不含信号肽,无跨膜区,保守结构域包含1个查尔酮合酶超家族结构域,二级结构以α螺旋和无规卷曲为主。同源性分析显示,光果甘草CHS c DNA序列与乌拉尔甘草G.uralensis以及胀果甘草G.inflata在进化关系上最近,与小立碗藓Physcomitrella patens在进化关系上最远。结论:成功克隆并得到了光果甘草CHS c DNA序列,且这些序列编码区具有丰富的多态性。     

光果甘草GgUGE基因的克隆和序列分析

目的:通过克隆光果甘草Glycyrrhiza glabra UDP-葡萄糖4-差向异构酶(UDP-glucose 4-epimerase,UGE)基因并进行生物信息学分析,探究光果甘草UGE基因与甘草酸生物合成分子调控之间的潜在关系。方法:从光果甘草主根中提取RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆得到UGE基因c DNA序列,测序并进行序列分析。结果:成功克隆得到一条长度为1 121 bp的光果甘草UGE基因(Gg UGE) c DNA序列,包含1个长度为1 053 bp的开放阅读框(ORF),共编码350个氨基酸残基,在Gen Bank上对所得c DNA序列进行注册,序列注册号为MK638908。序列分析表明Gg UGE基因编码蛋白为不稳定亲水蛋白,理论相对分子质量为39. 02 k Da,等电点为6. 13,不含信号肽,无跨膜区,二级结构以α-螺旋为主,保守结构域含有葡萄糖4-差向异构酶基因家族结构域。Gg UGE基因的c DNA序列和氨基酸序列聚类分析结果表明其与豆科植物亲缘关系最近,而与杨柳科植物亲缘关系较远。结论:首次克隆得到了光果甘草Gg UGE c DNA序列,对其进行了生物信息学分析,为后续Gg UGE基因的功能研究以及甘草酸生物合成分子调控机制的解析提供参考。     

甘草鲨烯合酶基因及cDNA的克隆与序列分析

目的:对甘草鲨烯合酶(SQS)基因的cDNA及DNA进行克隆及序列分析.方法:根据已报道的光果甘草SQS1基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR的方法,提取甘草根的RNA然后反转录成cDNA,以cDNA为模板,扩增出SQS基因的cDNA序列,以甘草总DNA为模板,扩增SQS的DNA序列.结果:序列分析表明,克隆获得的甘草SQS1的cDNA编码区为1242 bp,编码413个氨基酸残基,命名为GuSQS1,登录号为GQ266154,与卢虹玉等报道的甘草的2个SQS(SQS1和SQS2)的氨基酸序列一致性为98.55%,88.62%,对应DNA序列全长为4484 bp,含有13个外显子,12个内含子,登录号为GQ180932.结论:甘草SQS的cDNA及DNA序列的获得为进一步研究甘草酸生物合成机制提供了基础.     

甘草β-香树酯醇合成酶的编码区克隆与序列分析

目的:对甘草β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)编码区进行克隆及序列分析.方法:根据已报道的光果甘草bAS基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术,以甘草主根总RNA为模板扩增出甘草bAS基因的编码区序列.结果:序列分析表明,所克隆的bAS基因编码区长为2 289 bp,编码762个氨基酸残基,命名为GubAs(GenBank注册号:FJ627179),推测的氨基酸序列与光果甘草、光叶百脉根、豌豆、截形苜蓿、大豆的氨基酸序列同源性最高,分别达99%,92%,90%,90%,89%.结论:首次报道了甘草bAS基因的编码区序列,为进一步研究三萜类化合物的生物合成机制及为甘草优良品种的选育奠定基础.     

建泽泻鲨烯合酶基因克隆及其生物信息学分析

目的 对建泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成关键酶鲨烯合酶(squalene synthase,SS)进行基因全长的克隆和生物信息学分析.方法 以建泽泻总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆建泽泻SS基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件及ExPASy在线分析等方法对其进行生物信息学研究.结果 获得建泽泻SS基因全长cDNA,GenBank注册号为JX866770,序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长为1577bp,包含一个长1230bp的开放阅读框架,编码409个氨基酸的蛋白,与其他药用植物具有较高的同源性.预测该蛋白的相对分子质量为4.68×104,等电点为5.97,无信号肽,包含2个富含天冬氨酸(DXXDD)的保守功能域.结论 首次克隆获得建泽泻SS基因的全长cDNA,为泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据.     

甘草中新NADPH细胞色素P450还原酶基因的克隆与相关生物信息学分析

目的从甘草Glycyrrhiza uralensis中克隆1个新的NADPH细胞色素P450还原酶基因(Gu CPR,登录号:MH401048)并进行生物信息学分析。方法提取甘草根部总RNA后逆转录为cDNA,通过转录组数据库筛选得到Gu CPR基因全长,利用NCBI ORF finder得到其开放阅读框并翻译得氨基酸序列,设计引物进行PCR扩增,构建克隆重组质粒。利用生物信息分析预测蛋白性质、结构等及模拟蛋白三级结构,并构建同源系统进化树。结果克隆得到Gu CPR基因cDNA全长2 118bp,编码705个氨基酸残基,相对分子质量78 450,等电点(pI)5.19。Gu CPR蛋白为非分泌蛋白,不具有信号识别功能。跨膜预测结果显示蛋白的第44~64位氨基酸为跨膜区,同时,亚细胞定位预测结果显示蛋白位于内质网上。结论克隆得到一个新的Gu CPR,并进行了生物信息学分析,为进一步研究提供了理论基础。     

大花红景天尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因组DNA的克隆及分析

目的 克隆大花红景天Rhodiola crenulata尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因组DNA,并利用生物信息学对其编码区与启动子进行分析.方法 以大花红景天为样品,采用优化的CTAB法提取大花红景天基因组DNA,并利用hiTAIR-PCR 技术经过3次步移获得大花红景天UDPGT (RcUDPGT)基因DNA序列,并利用生物信息学对其进行分析.结果 克隆得到RcUDPGT基因的DNA序列2 977 bp,其中包含1 499 bp的编码区域(包括82 bp的内含子序列)和1500 bp的编码区5,上游侧翼域序列(包括启动子区域).生物信息学分析证明该序列为UDPGT基因且与其他植物UDPGT同源,具有亲水性且定位于细胞质中,三级结构预测表明该基因编码的蛋白具有UDPGT功能结合位点.启动子分析表明其存在光响应、厌氧响应、热响应、低温响应、压力与防御响应和花色素苷合成响应元件等.结论 克隆的RcUDPGT基因结构完整,具有典型的功能结合位点,为红景天分子生物学与代谢工程研究提供参考.     

三七3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的克隆和生物信息学分析

目的克隆三七总皂苷甲羟戊酸合成途径中的1个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,HMGR)基因,为进一步研究HMGR蛋白的功能及开展三七皂苷的合成生物学研究奠定基础。方法根据NCBI上已公布的同属人参的HMGR基因全长序列(登录号GU565097.1)设计特异性引物。利用RT-PCR技术,以三七愈伤组织总RNA反转录的cDNA为模板扩增基因片段;并对其编码的蛋白进行生物信息学预测和基因表达分析。结果序列分析表明,获得的三七HMGR(命名为PnHMGR)基因的cDNA序列大小为1 893 bp,该序列与人参、刺五加和杜仲中HMGR基因的一致性分别达到98%、93%、80%,且含有大小为1 725 bp的开放阅读框,经Genbank查询为一新的cDNA。生物信息学预测PnHMGR基因编码蛋白包含2个跨膜区,不含信号肽,具有HMGR催化作用的活性中心结构域。实时荧光定量PCR检测到PnHMGR基因在三七细胞生长30 d表达量最高。结论首次从药用植物三七中克隆得到HMGR基因的编码区序列,为进一步鉴定PnHMGR的功能和开展三七皂苷的合成生物学研究奠定了基础。     

山茱萸萜类甲羟戊酸合成途径关键酶CoHMGS基因的克隆与分析

目的克隆得到山茱萸Cornusofficinalis萜类合成途径的关键酶CoHMGS基因的cDNA序列,并进行相应的生物信息学分析,为深入研究CoHMGS基因的功能奠定基础。方法以山茱萸转录组筛选出的c102453_g2序列为参考序列设计特异引物,以山茱萸叶片总RNA,通过RT-PCR扩增获得CoHMGS基因序列,序列纯化回收后连接到pTOPO-T载体上,转化至大肠杆菌DH10B,选取阳性克隆测序。利用生物信息学软件预测CoHMGS基因及其编码蛋白质的功能。结果克隆得到长度为1645 bp的CoHMGS序列,包含1413 bp的完整开放阅读框,编码470个氨基酸。蛋白整体带负电荷,为不稳定亲水性蛋白,定位于细胞质内,不含跨膜结构。结论首次克隆得到山茱萸CoHMGS基因,对其编码蛋白质进行了初步的分析和预测,为深入揭示CoHMGS基因在山茱萸萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、 生物信息学及表达分析

目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达最具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.     

黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究.方法 根据黄花蒿MCS (AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列.将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a (+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白.半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况.结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子.构建pET-21a (+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a (+)-MCS原核表达体系.AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低.结论 克隆了AaMCS基因,建立pET-2 1a (+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础.     

黑三棱苯丙氨酸解氨酶基因克隆与序列分析

目的 对连接黑三棱初生代谢及次生代谢途径的关键酶苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase,PAL）进行基因全长的克隆和生物学信息分析。方法 以黑三棱总RNA为模板,采用同源克隆法和RACE技术克隆黑三棱PAL基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件和ExPASy在线分析等方法对其生物信息学进行分析。结果 获得黑三棱PAL基因全长cDNA,GenBank注册号为KF633470,序列分析表明,所克隆的cDNA全长为2 413 bp,包含一个2 151 bp的开放阅读框架,编码716个氨基酸的蛋白。预测该蛋白的相对分子质量为1.98×10⁵,等电点为4.84,无信号肽,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYIAG。结论 首次克隆并获得黑三棱PAL基因全长cDNA,为黑三棱药效成分生源合成途径的阐明和改善中药材品质提供科学依据。     

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究.方法 采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性.结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性.结论 首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达.     

铁皮石斛中性/碱性转化酶(DoNI2)基因的克隆和表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase,NI)家族基因成员,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用转录组测序和RACE技术相结合克隆NI基因的cDNA序列,利用生物信息学工具对其进行分析,并采用实时荧光定量PCR方法检测NI基因在铁皮石斛根、茎和叶中的表达情况。结果克隆获得1个新的铁皮石斛NI基因,命名为DoNI2(Gen Bank登录号KY794404),全长2 397 bp,开放阅读框(ORF)为1 836 bp,编码611个氨基酸。DoNI2蛋白预测的理论相对分子质量和等电点分别为69 050和6.38,不稳定系数为42.95,疏水性系数为-0.232。DoNI2基因在铁皮石斛根、茎和叶中均有表达,其中在茎中表达量最高,根中最低。不同生长年限茎中DoNI2基因表达量与NI酶活性呈显著正相关。结论克隆了线粒体型的DoNI2基因的全长c DNA序列,为进一步阐明该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中的重要作用奠定基础。     

刺五加MDD基因启动子的克隆与生物信息学分析

目的克隆并分析刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的启动子序列。方法根据刺五加MDD基因的c DNA序列,采用PCR扩增和热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术,克隆MDD基因5’端的DNA序列及启动子序列。利用Plant CARE等软件对其进行生物信息学分析。结果克隆得到长1 423 bp的刺五加MDD基因启动子序列及长1 024 bp的5’端DNA序列。该启动子序列含有49个TATA-box、25个CAAT-box。还含有脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、胚乳表达必须顺式作用元件、干旱胁迫响应元件、光响应元件等多种顺式作用元件,以及2个MYBHv1与2个MBY结合位点。结论首次克隆并分析了刺五加MDD基因的启动子序列,为该基因的表达调控奠定了基础。     

荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆及生物信息学分析

目的克隆荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,StDXS)基因,并进行生物信息学分析。方法根据荆芥转录组数据获得的StDXS基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术获得StDXS基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析。结果荆芥StDXS基因全长2177 bp,包含一个长度为2157 bp的开放阅读框,编码718个氨基酸,其理论相对分子质量为77240,等电点为6.32,定位于叶绿体,不存在跨膜区及信号肽,为非分泌蛋白。同源系统进化树分析表明,该序列与同科植物鼠尾草的DXS基因进化关系较近,均属于DXS1亚家族。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以A/T结尾的密码子,具有28个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论成功克隆荆芥StDXS基因并进行生物信息学分析,为从分子水平调控荆芥的生长发育和改善药材产量和品质提供理论基础。     

丹参晚期胚胎富集蛋白基因的克隆及表达模式分析

目的克隆丹参晚期胚胎富集蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)基因,并进行生物信息学和表达模式分析。方法对丹参转录组数据库进行BLAST同源性比对,发现一条新的与LEA基因家族同源性较高的序列,命名为Sm LEA2,Gen Bank登录号为HQ676610。进一步利用PCR和RT-PCR技术从丹参g DNA以及c DNA水平克隆得到了Sm LEA2基因全长。采用软件分析蛋白质结构性质和系统进化关系。利用实时荧光定量PCR的方法对不同部位、不同发育时期以及不同处理丹参的Sm LEA2表达量进行检测。结果获得Sm LEA2 g DNA长1 961 bp,由1个外显子和1个内含子组成,并且内含子位于ATG的上游;开放阅读框长为960 bp,共编码319个氨基酸。生物信息学分析显示,Sm LEA2是存在于细胞质中的亲水蛋白,无跨膜结构域和信号肽,其相对分子质量为35 340,等电点为4.77。该基因在丹参的根、茎、叶中均有表达,并且在茎中的表达量最高。随着花的成熟和种子的发育,该基因表达量逐渐升高,并且该基因的表达受茉莉酸甲酯(Me JA)以及脱落酸(ABA)的诱导作用影响。结论克隆得到的丹参Sm LEA2可能参与种子发育过程,并在丹参防御反应中发挥作用。     

丹参转录因子SmbHLH93的克隆及表达模式分析

目的 克隆丹参碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类转录因子SmbHLH93,并初步探究该基因的功能.方法 采用PCR和RT-PCR技术分别从DNA和cDNA水平克隆得到了SmbHLH93基因,进一步通过BD Walking获得了该基因的5'启动子区.生物信息学分析SmbHLH93蛋白的理化性质、结构特点和系统进化关系.结合启动子区分析软件和qPCR,研究SmbHLH93在丹参不同部位和环境诱导下的表达模式.结果 获得SmbHLH93基因序列954 bp和5'启动子区1 583 bp,其中开放阅读框(ORF)657 bp,有3个内含子和4个外显子,编码218个氨基酸,含有bHLH和ACT_UUR-ACR-like结构域,无跨膜区域,可能定位于细胞核.表达模式分析结果显示该基因的表达量在根中最高,茎中最低,且随着花的形成逐渐降低.光和低温诱导SmbHLH93的高表达,而水杨酸(SA)抑制其表达.结论 克隆得到丹参bHLH类转录因子新成员SmbHLH93,初步预测其参与了丹参花的发育过程和丹参次生代谢途径的调控.     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。