甘草β-香树酯醇合成酶的编码区克隆与序列分析

目的:对甘草β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)编码区进行克隆及序列分析.方法:根据已报道的光果甘草bAS基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术,以甘草主根总RNA为模板扩增出甘草bAS基因的编码区序列.结果:序列分析表明,所克隆的bAS基因编码区长为2 289 bp,编码762个氨基酸残基,命名为GubAs(GenBank注册号:FJ627179),推测的氨基酸序列与光果甘草、光叶百脉根、豌豆、截形苜蓿、大豆的氨基酸序列同源性最高,分别达99%,92%,90%,90%,89%.结论:首次报道了甘草bAS基因的编码区序列,为进一步研究三萜类化合物的生物合成机制及为甘草优良品种的选育奠定基础.     

化橘红黄酮类生物合成中功能基因的克隆与序列分析

目的:克隆获得广东道地药材化橘红黄酮类化合物生物合成中几个重要功能基因。方法:利用CTAB-LiCl法提取高质量的化橘红总RNA,采用RT-PCR技术克隆基因。结果:克隆获得了化橘红黄酮类生物合成中三个重要功能基因,它们分别为查尔酮合成酶基因,该基因编码区全长1173 bp,编码391个氨基酸,NCBI序列登录号:GQ892059;黄烷酮-3-羟化酶基因,该基因编码区全长1 086 bp,编码362个氨基酸,登录号:GU323284;查尔酮异构酶基因,该基因全长666 bp,编码222个氨基酸,登录号:GU323285。结论:CTAB-LiCl法能提取高质量的化橘红总RNA,克隆获得的三个功能基因都具有开放阅读框。     

乌拉尔甘草HMGR基因cDNA的克隆与序列分析

目的:对乌拉尔甘草3.羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR)的cDNA克隆并进行序列分析.方法:根据NCBI数据库中的豆科其他物种HMGR的cDNA保守区设计引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从甘草根中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开发阅读框,Prosite分析蛋白质的基本结构域,Clustal x比对已有HMGR的氨基酸序列,并构建进化树.结果:得到1个全长为1 842 bp的HMGR的cDNA序列,含有1 722 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码573个氨基酸,具有HMGR家族的特异序列,推测的氨基酸序列与豌豆、蒺藜苜蓿的氨基酸序列一致性分别为84%,76%.结论:对甘草HMGR基因的cDNA进行了克隆,为进一步研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A在甘草酸生物合成途径中的作用提供了理论依据.     

半夏凝集素基因的克隆与氨基酸序列初步分析

目的 克隆半夏凝集素基因并对其氨基酸序列生物信息与已报道相关基因进行对比分析,为抗虫基因利用和转基因育种研究奠定基础.方法 根据已报道的植物凝集素基因序列设计特异引物,以半夏叶片DNA为模板进行PCR扩增,获得特异性片段,将其连接到测序载体上,进行序列测定,用分析软件分析序列信息.结果 克隆1 069 bp的半夏凝集素基因(pta),开放阅读框全长804bp,编码268个氨基酸残基;预测相对分子质量和等电点分别为2.91×104和7.77,功能区完整,具有1条信号肽和3个甘露糖结合区;已在GenBank中登记(登录号AY725425).结论 克隆的半夏凝集素基因序列信息完整,具有典型的甘露糖结合位点,可以作为抗虫基因用于抗虫育种.     

三七法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析

目的对三七法呢基焦磷酸合酶(FPS)进行基因克隆及序列分析。方法采用cDNA末端快速扩增法,以三七根总RNA为模板扩增出三七FPS基因。结果序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长1 409 bp,开放阅读框共编码343个氨基酸残基,推测的氨基酸序列与积雪草、灰白银胶菊、黄花蒿的FPS的氨基酸序列同源性最高,分别达95%、87%、86%。结论首次分离并报道了三七FPS cDNA克隆,为进一步研究三萜皂苷生物合成机制及其在提高植物药用价值方面的应用奠定基础。     

华细辛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与生物信息学分析

目的:克隆华细辛Asarum sieboldii苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(AsPAL),并进行序列特征分析。方法:通过同源克隆的原理,利用RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法,以华细辛叶片总RNA为模板,获得了该基因的c DNA全长,并通过DNAMAN软件和Ex PASy在线分析等对其进行了生物信息学分析。结果:获得AsPAL全长cDNA,Genbank登录号为KY428932,序列分析表明,所克隆的c DNA含有1个2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为78 758 Da,理论等电点为6.24,没有跨膜区,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYVAG,不含信号肽;氨基酸序列多重比较发现,AsPAL与土肉桂、葡萄、当归和杏的同源性达到80%以上。结论:获得了AsPAL c DNA全长序列,对其进行初步生物信息学分析,为进一步探究AsPAL的功能和华细辛甲基丁香酚生物合成的调控机制奠定了必要的基础。     

吴茱萸Cu/Zn-SOD基因全长cDNA克隆与序列分析

目的:克隆获得与吴茱萸抗逆性密切相关的Cu/Zn-SOD基因cDNA全长序列。方法:采用RACE技术获得了该基因的开放阅读框(ORF)和3,5,端非编码区。结果:该基因全长717 bp,ORF区为459 bp,编码152个氨基酸,GenBank登录号为JQ285851。结论:该基因为吴茱萸Cu/Zn-SOD基因cDNA全长序列,与其它植物的Cu/Zn-SOD基因具有较高的同源性。     

颠茄精氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

目的克隆颠茄Atropa belladonna精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase,ADC)基因并进行生物信息学、组织表达谱和诱导谱分析。方法以颠茄总RNA反转录的cDNA为模板,采用RACE技术克隆颠茄ADC基因的全长cDNA序列,利用BLAST和PBIL等在线工具进行生物信息学分析,采用实时定量PCR(q RT-PCR)技术对ADC基因进行组织表达谱和诱导谱分析。结果克隆到2个ADC基因,分别命名为AbADC1(登录号KT802752)和AbADC2(登录号KT802751)。AbADC1基因cDNA全长为2 817 bp,编码712个氨基酸残基;AbADC2基因cDNA全长为2 992 bp,编码715个氨基酸残基。蛋白质序列比对表明,AbADC1与马铃薯Solanum tuberosum ADC的相似性较高,为89%;AbADC2与曼陀罗Datura stramonium ADC的相似性较高,为90%。q RT-PCR检测结果表明,AbADC1在须根中的表达量最高,而AbADC2在主根中的表达量最高;AbADC1和AbADC2均不受盐胁迫响应,AbADC2受低温胁迫响应。结论首次克隆并获得了2条颠茄ADC基因全长序列,为进一步研究颠茄托品烷类生物碱的代谢合成奠定了基础。     

膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析。方法应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法,以膜荚黄芪根总RNA为模板克隆PAL基因。结果所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为AmPAL,Genbank登录号为EF567076。序列分析表明,AmPAL全长为2650bp,含有一个完整的2154bp开放读码框。AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,相对分子质量为7.805×104,等电点为5.96,与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且相似性都大于80%。结论首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础。     

甘草鲨烯合酶基因多态性对其编码酶催化效率影响的研究

目的:分析甘草鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因多态性及其对编码酶催化效率的影响,为揭示优质甘草形成的分子机制奠定基础.方法:提取甘草总RNA; PCR扩增其SQS基因编码序列;测序后分析SQS序列的多态性;将具有明显差异的4个甘草SQS序列(SQS1C,SQS1F,SQS2A,SQS2B)连入表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21;IPTG诱导蛋白表达,纯化后用于体外酶促反应;GC-MS鉴定产物并比较相对含量.结果:甘草SQS1基因存在单核苷酸多态性(single nuclear polymorphisms,SNPs)、插入与缺失多态性(InDel)、选择性剪接(AS)多态性;SQS2基因只存在SNPs.氨基酸序列分析显示,SQS1非保守替换占53.94％,结构域中有2个位点突变;SQS2非保守替换占60％,结构域中有1个位点突变.在4种编码酶的体外酶促反应中,利用GC-MS均能检测到产物生成;SQS1F编码酶积累鲨烯的能力高于其他序列.结论:甘草SQS基因具有丰富的多态性,其编码酶催化效率差异显著,这可能是优质甘草形成的分子基础.     

乌拉尔甘草转鲨烯合成酶基因毛状根系研究

目的:为了研究甘草酸的合成调控途径及提高甘草酸合成水平.方法:将已克隆的乌拉尔甘草鲨烯合成酶基因(GuSQS1,GenBank登录号为:AM182329)通过发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes A4的介导,转化甘草下胚轴并诱导毛状根的形成.建立的毛状根系经0.8 mg·L~(-1)的除草剂(PPT)抗性筛选、PCR和Southern blotting检测分析后,得到的转基因毛状根系经HPLC检测甘草酸(GA)含量.结果与结论:转基因毛状根中甘草酸的最高含量约为野生型毛状根的3.6倍.     

龙骨马尾杉环阿屯醇合成酶(HcCAS1)基因的 克隆和生物信息学分析

目的:对大伸筋草的原植物龙骨马尾杉Huperzia carinata环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)基因HcCAS编码区进行克隆及序列分析。方法:根据本实验室已报道的龙骨马尾杉转录组高通量测序结果分析获得1条具有环氧角鲨烯环化酶保守结构域的CAS基因序列,采用RT-PCR技术,以龙骨马尾杉根、茎、叶混合样品总RNA为模板克隆得到龙骨马尾杉HcCAS基因的编码区序列,并对HcCAS蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。结果:序列分析表明,所克隆的HcCAS基因编码区开放阅读框(open reading frame,ORF)长为2 274 bp,编码757个氨基酸残基,命名为HcCAS1(GenBank登陆号JN790125)。结论:该研究在国内外首次获得龙骨马尾杉HcCAS基因的编码区序列,为进一步研究HcCAS蛋白在石杉科植物甾醇合成途径中的功能及酶活性位点的鉴定奠定基础。     

乌拉尔甘草TIFY基因家族鉴定及调控分析＊

目的 为了探索乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）TIFY基因家族的特征并预测其功能，本研究在全基因组层面，应用生物信息学方法对乌拉尔甘草TIFY基因家族进行鉴定和分析。方法 在乌拉尔甘草全基因组数据基础上，利用NCBI、MEME及TBtools等工具，结合基因保守结构域，对乌拉尔甘草TIFY基因家族的序列特征、分类、系统发育和基因表达模式进行分析。结果 在乌拉尔甘草中鉴定到TIFY家族基因成员18个（GurTIFY1-GurTIFY18），分别属于TIFY、JAZ、PPD、ZML四个亚家族，编码的核苷酸长度为444-1266 bp，氨基酸长度在147-421 aa之间，等电点为4.57-9.68，分子质量为16741.11-44426.5 Da，含有10个保守基序和4个保守结构域。基因表达结果表明GurTIFY基因中GurTIFY15、GurTIFY4、GurTIFY1、GurTIFY11等在乌拉尔甘草叶和根中的表达水平具有显著差异性。结论 本研究为深入理解TIFY基因响应非生物胁迫的调控机制和参与次生代谢物质累积的功能奠定基础，并为乌拉尔甘草优质品种选育提供科学参考。     

氮素供给对甘草根系呼吸动态及生物量积累的影响研究

探究不同氮素供给对甘草根系呼吸及生物量积累的影响规律,揭示通过影响根系呼吸来调控甘草生物量积累的途径。在6月至10月,每7 d对控制环境条件下的甘草播种苗施用氮(N)浓度为0,0.5,1,2,4,8 mmol·L-1的全营养液,每月月底测定甘草不同级别根系呼吸速率及生物量,分析甘草根系生物量与呼吸速率的相关性。研究结果表明,氮素显著影响甘草根系呼吸速率和根系生物量积累,通过相对抑制生长呼吸速率以提高生物量而使两者呈负相关,并在8 mmol·L-1氮浓度处理时有最佳的抑制甘草根呼吸而提高根系生物量的效果。     

我国不同产区野生与栽培甘草的甘草酸含量及其影响因子的初步研究

目的:了解全国野生和栽培甘草的甘草酸含量范围,初步寻找影响甘草酸含量的相关因素。方法:采用HPLC测定收集于全国9省区37个旗县165份野生甘草和1 013份栽培甘草的甘草酸含量,分析产地、药用部位、栽培年限、土壤类型与质地对甘草酸含量的影响。结果与结论:野生甘草的甘草酸质量分数平均为(4.43±1.32)%,而栽培甘草的甘草酸质量分数平均为(1.51±0.49)%,低于2010年版《中国药典》的最低标准。不同产地野生和栽培甘草的甘草酸含量均存在显著差异(P<0.05),野生甘草中,根和根茎的甘草酸含量不存在显著差异,一至四年生阶段栽培甘草的甘草酸含量不存在显著差异,五年生后甘草酸含量快速增高,栽培地土壤类型和质地对甘草酸含量的影响未达到显著水平。     

滇重楼鲨烯合酶基因PpSQS的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆滇重楼鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因(PpSQS),对该基因进行序列分析及原核表达。 方法: 采用同源克隆和RACE技术获得PpSQS的cDNA,并对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET-30b(+)-PpSQS,在大肠杆菌Escherich coli BL21(DE3)中进行诱导表达。 结果: PpSQS基因cDNA全长1 498 bp,包含1个1 212 bp的开放阅读框(ORF),可编码403个氨基酸;PpSQS理论标准分子质量为46.36 kDa,等电点为pI 6.83;SDS-PAGE分析表明,经1 mmol·L^-1 IPTG诱导后,重组PpSQS蛋白在大肠杆菌中获得表达。 结论: 首次获得了滇重楼PpSQS基因cDNA全长序列,该基因编码产物具有植物SQS同源蛋白的典型特征,实现重组PpSQS在大肠杆菌中的表达。     

甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性对其编码酶催化效率的影响

目的:利用GC-MS方法分析甘草不同3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因型表达蛋白的催化效率,为揭示甘草HMGR多态性在优质甘草药材形成中的作用奠定基础.方法:以从甘草中克隆的4种HMGR基因突变型构建表达载体,转化Escherichia coli BL21,进行诱导表达、检测、纯化及体外酶促反应,采用TLC及GC-MS对反应产物进行定性及定量分析.结果:L/V型突变(-HSL,-HSV)催化活性近似,GA插入型突变(GALLV,GALSV)催化活性近似,但插入型突变的催化活性显著高于前者,是前者的2倍左右.结论:甘草功能基因HMGR基因多态性可能是甘草优质药材形成的分子基础.     

干旱胁迫对甘草生长的影响

目的 :研究干旱胁迫对甘草生长的影响及其抗旱性。方法 :采用土壤干旱胁迫处理二年生甘草 60d ,测定地上茎叶和地下根及根茎各生长指标以及生物量。结果 :随干旱胁迫程度的增强 ,甘草地上地下各器官生长均受到抑制 ,但对地上器官的生长抑制更加明显。结论 :干旱胁迫对甘草生长的抑制作用具有明显的器官特异性 ,在土壤相对含水量为 50%的干旱条件下 ,人工种植甘草的产量和质量可兼顾。