人参内生菌的研究进展

内生菌由细菌、真菌、古菌和原生生物组成，它们生活在植物的活体组织中，具有丰富的次级代谢产物多样性。人参内生菌在人参的生长发育、次级代谢产物的生成和环境适应等方面均有重要的促进作用，对人参的产量和品质有较大影响。随着人们在微生物领域研究的深入，高通量测序技术已经成为研究植物内生菌的重要方法。文章主要从人参内生菌分离与鉴定研究方法、人参内生菌的多样性、人参内生菌及其次级代谢产物的活性、人参内生菌对宿主的影响等4个方面对人参内生菌近年来的研究进展进行讨论，并对其发展方向提出展望，以期为药用植物内生菌研究和品质改良提供新思路、新方法。     

山茱萸萜类甲羟戊酸合成途径关键酶CoHMGS基因的克隆与分析

目的克隆得到山茱萸Cornusofficinalis萜类合成途径的关键酶CoHMGS基因的cDNA序列,并进行相应的生物信息学分析,为深入研究CoHMGS基因的功能奠定基础。方法以山茱萸转录组筛选出的c102453_g2序列为参考序列设计特异引物,以山茱萸叶片总RNA,通过RT-PCR扩增获得CoHMGS基因序列,序列纯化回收后连接到pTOPO-T载体上,转化至大肠杆菌DH10B,选取阳性克隆测序。利用生物信息学软件预测CoHMGS基因及其编码蛋白质的功能。结果克隆得到长度为1645 bp的CoHMGS序列,包含1413 bp的完整开放阅读框,编码470个氨基酸。蛋白整体带负电荷,为不稳定亲水性蛋白,定位于细胞质内,不含跨膜结构。结论首次克隆得到山茱萸CoHMGS基因,对其编码蛋白质进行了初步的分析和预测,为深入揭示CoHMGS基因在山茱萸萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

参与连翘苯丙烷合成途径的WRKY转录因子的筛选与鉴定

目的 筛选出参与连翘Forsythia suspensa苯丙烷合成途径的WRKY转录因子并进行生物信息学分析。方法 通过对从连翘转录组数据中筛选出的62条连翘WRKY基因序列进行鉴定;通过采用蛋白理化性质和基序分析、蛋白结构分析、系统进化分析、功能注释、蛋白互作分析、外源激素处理后实时荧光定量分析等方式进行相关分析。结果 最终筛选出52条具有WRKY结构域的连翘WRKY转录因子。WRKY转录因子编码蛋白的氨基酸数目在105～728,相对分子质量在12277.95～80 321.99。蛋白基序分析显示其均有WRKY结构域,与拟南芥WRKY转录因子构建系统进化树将连翘52个WRKY转录因子进一步分为3大类;筛选出5个可能参与连翘苯丙烷合成途径的连翘WRKY转录因子,并推测其可能以被MAPK级联反应所调控的方式介导连翘中苯丙烷合成途径。结论 通过分析转录组测序结果,从52个连翘WRKY转录因子中筛选出5个可能参与连翘苯丙烷合成途径的转录因子,其表现出组织特异性表达,且对不同浓度茉莉酸甲脂表现出不同的响应,为进一步研究其作用机制提供研究方向。     

山茱萸药材及其混伪品的ITS／ITS2序列鉴定研究

利用DNA条形码技术准确快速鉴定山茱萸药材及其混伪品。方法：提取山莱萸及其混伪品的基因组DNA,利用PCR技术扩增它们的ITS序列。所得序列经双向测序后用CodonCode AlignerV3．5．4软件进行拼接和质量评估,用MEGAV5．0计算种内、种间的遗传距离,构建NJ（邻接）树鉴定山茱萸药材及其混伪品。结果：山茱萸药材的ITS序列长度均为659bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为O．005,远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离0．357。不同来源的山茱萸药材ITS2序列无变异,长度均为250bp,其与混伪品的种间平均K2P遗传距离为0．571。ITS／ITS2序列的NJ系统聚类树和BLAST比对结果均可明显区分山茱萸药材及其混伪品,表现出良好的单系性。结论：ITS／ITS2序列可准确有效鉴定山茱萸药材,为临床安全用药奠定了基础,也为其它药材的分子鉴定提供了新的思路。     

优质山茱萸栽培技术探讨

山茱萸作为一种常用大宗中药材，其市场需求量较大。然而管理不善及滥用化肥农药等问题导致山茱萸药材质量参差不齐。为生产优质山茱萸药材，本文在常规山茱萸栽培技术基础上，对其栽培选地、优良种质选育、种植管理、合理施肥及病虫害防治技术进行了探讨，提出了山茱萸适宜生态因子及潜在种植产区，汇总了山茱萸优良品种，系统总结了山茱萸科学施肥及种植方法，并提出了“预防为主，综合防治”的植保方针，构建了山茱萸无公害病虫害的综合防治技术体系，研究结果以期为优质山茱萸药材的生产提供参考。     

基于ITS2序列鉴别前胡和紫花前胡药材及其混伪品

为应用ITS2序列对前胡、紫花前胡药材及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究,该文依据国家药典委员会公布的《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》,PCR扩增前胡、紫花前胡及其混伪品的ITS2序列并进行双向测序。经CodonCode Aligner V 3.7.1对测序峰图进行校对拼接,采用MEGA5.0软件分析相关数据。结果表明:前胡药材的ITS2序列长度为229~230 bp,种内变异较小,平均K2P遗传距离为0.005。紫花前胡药材的ITS2序列长度为227 bp,种内无变异。前胡、紫花前胡药材与其混伪品的种间平均K2P遗传距离分别为0.044,0.065。紫花前胡的种间最小K2P遗传距离明显大于其种内的最大K2P遗传距离。最小距离法和NJ树鉴定结果表明前胡、紫花前胡均能与其混伪品明显区分。因此,ITS2序列可有效鉴别前胡、紫花前胡药材及其混伪品。     

党参药材及其混伪品的ITS/ITS2条形码鉴定研究

为简便有效地鉴定党参药材及其混伪品并验证ITS/ITS2 序列作为DNA 条形码鉴定药材的稳定性和准确性,本研究选用党参药材及其混伪品作为研究对象,对33 份药材样本提取基因组DNA,通过PCR 扩增ITS 序列,采用比对法、最小距离法对序列鉴定能力进行评估。通过序列比对,分析变异位点信息确定不同的单倍型并计算种内和种间K2P 距离。ITS2 序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer（Hidden Markov Model）注释方法获得。结果表明,党参药材3 个基原物种ITS 序列长度为654-655 bp,ITS2 序列长度均为239 bp,ITS/ITS2 序列种内平均K2P 遗传距离均远小于其与混伪品的种间平均K2P 遗传距离,因此ITS/ITS2 序列作为DNA 条形码能稳定、准确鉴别党参药材及其混伪品,为其鉴定提供新的技术手段。     

山茱萸CoHMGR基因的亚细胞定位和表达分析

目的 研究山茱萸Cornus officinalis CoHMGR基因编码蛋白质的亚细胞定位以及不同浓度的外源激素对CoHMGR基因表达和活性成分含量的影响。方法 农杆菌菌液侵染烟草叶片,激光共聚焦倒置显微镜观察CoHMGR蛋白的亚细胞定位。不同浓度的茉莉酸甲酯和乙烯利喷施山茱萸2年生幼苗,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)测定不同时期CoHMGR基因表达水平,高效液相色谱(HPLC)检测莫诺苷、马钱苷含量。结果 激光共聚焦显微镜下观察到CoHMGR蛋白定位于内质网中。qPCR和HPLC结果显示200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利对目的基因表达水平和活性成分含量都有正向诱导效应。结论 CoHMGR蛋白定位于内质网,外源喷施200 μmol/L茉莉酸甲酯和250 mg/L乙烯利能显著提高CoHMGR基因表达量和莫诺苷、马钱苷含量,为深入解析CoHMGR基因功能奠定基础。     

山茱萸bHLH2基因的克隆与分析

目的:获得山茱萸转录因子CobHLH2的cDNA序列。方法:以山茱萸转录组测序数据中的c101916_g1序列为参考,利用Primer Premier 5.0软件在其开放阅读框两端设计特异性引物,把山茱萸果实总RNA反转录获得的cDNA作模板,通过PCR扩增、纯化回收和克隆测序,获得CobHLH2序列,并经生物信息学分析初步了解其基本结构与功能。结果:CobHLH2的ORF长度为795 bp,共编码264个氨基酸,为亲水性蛋白。CobHLH2蛋白的二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,有少量的β-转角和延伸链。多序列比对和系统进化树分析结果表明,CobHLH2的氨基酸序列与猕猴桃和茶树的bHLH类转录因子同源性较高。结论:首次获得山茱萸CobHLH2转录因子的cDNA序列,并进行了生物信息学分析,为深入研究bHLH类转录因子的结构和功能奠定基础。