甘草鲨烯合酶基因及cDNA的克隆与序列分析

目的:对甘草鲨烯合酶(SQS)基因的cDNA及DNA进行克隆及序列分析.方法:根据已报道的光果甘草SQS1基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR的方法,提取甘草根的RNA然后反转录成cDNA,以cDNA为模板,扩增出SQS基因的cDNA序列,以甘草总DNA为模板,扩增SQS的DNA序列.结果:序列分析表明,克隆获得的甘草SQS1的cDNA编码区为1242 bp,编码413个氨基酸残基,命名为GuSQS1,登录号为GQ266154,与卢虹玉等报道的甘草的2个SQS(SQS1和SQS2)的氨基酸序列一致性为98.55%,88.62%,对应DNA序列全长为4484 bp,含有13个外显子,12个内含子,登录号为GQ180932.结论:甘草SQS的cDNA及DNA序列的获得为进一步研究甘草酸生物合成机制提供了基础.     

唇形科植物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因及其氨基酸序列的生物信息学分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)是二萜类物质合成途径中的一个关键酶。该文采用生物信息学方法对9种唇形科植物的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶的核苷酸及其编码的氨基酸序列的结构、理化性质、信号肽、导肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性和亚细胞定位特征、二级结构、蛋白质功能域、三级结构和进化关系进行了初步预测和分析,并构建了牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶蛋白家族的系统进化树。结果表明,9种唇形科植物的GGPS氨基酸序列理化性质基本一致,主要表现为亲水性蛋白,有叶绿体转运肽,不存在信号肽,没有跨膜结构域;大多数定位于叶绿体,少数定位于线粒体。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,含有多聚异戊二烯基合成酶的活性结构域、2个天冬氨酸富集区结构域、活性位点残基盖结构域和镁离子结合位点结构域。研究结果将为GGPS的酶学特性及二萜类生物合成的分子机制研究提供理论参考。     

甘草粗皮中甘草酸的含量测定

采用HPLC法测定粉甘草加工过程遗弃的粗皮中甘草酸含量。结果表明,甘草粗皮含有至少3种以上粉甘草中不含的未知成分;且含有甘草酸量高于粉甘草。建议利用遗弃的粗皮,提取甘草酸的原料,用于生产添加剂。此外,应进一步研究,粉甘草和带皮甘草的药效差异,以指导临床用药。     

白花丹参鲨烯合酶SQS2的克隆与原核表达分析

该研究根据丹参的转录组数据提供的基因片段设计引物,采用逆转录聚合酶链式反应方法,从白花丹参中克隆鲨烯合酶SQS2的全长cDNA序列,命名为SmSQS2,GenBank注册号KM244731.序列长度为1 597 bp,包含1 245 bp的开放阅读框,推测编码414个氨基酸,含有115 bp的5'UTR和237 bp的3'UTR.利用生物信息学软件对获得的序列进行同源性分析,得出白花丹参SQS2的与紫花丹参SQS2的序列无明显差异.原核表达分析结果表明SmSQS2在大肠杆菌中能表达出与预测蛋白大小相当的目标蛋白,对影响蛋白表达的4个因素,即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度和诱导时宿主菌的吸光度(A600)进行了优化,得出SmSQS2蛋白表达的最佳条件为:IPTG终浓度0.2 mmol· L-1,宿主菌的吸光度(A600)为0.6,温度30℃,诱导时间20 h.这为进一步研究白花丹参鲨烯合酶SQS2在丹参萜类和甾醇类生物合成途径中的作用提供了理论依据.     

丹参转录因子SmWRKY1蛋白的表达和纯化条件优化研究

WRKY转录因子是一类含有高度保守的WRKY结构域的锌指蛋白,是植物所特有的转录因子家族。该研究将已克隆的 SmWRKY1 cDNA构建到原核表达载体pET28a上,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约36 kDa,与预测的蛋白相对分子质量一样,说明该基因在大肠杆菌中成功表达。对影响蛋白表达的4个因素：诱导时间、诱导温度、IPTG浓度及诱导前菌液的浓度进行优化,结果表明在大肠杆菌BL21（DE3）中,当A₆₀₀达到约1.0~1.5时,加入0.2 mol·L^-1的IPTG,在20 ℃诱导培养12 h后SmWRKY1蛋白的表达量较高。原核表达产物SmWRKY1蛋白以包涵体的形式存在,采用尿素提取包涵体蛋白,用Ni²⁺亲和色谱法纯化表达蛋白,纯化后蛋白的质量浓度为2.454 g·L^-1。经蛋白质印迹检测,His-Tag单克隆抗体可以特异性的识别SmWRKY1蛋白,进一步证实丹参SmWRKY1蛋白在大肠杆菌中成功表达。本研究为进一步开展 SmWRKY1 基因的表达与丹参酮类等化合物的生物合成相关研究奠定了工作基础。     

利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体

NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应,利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体,以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能。根据Gateway技术要求,设计含有attB接头的引物,使用NEB的Phusion超保真聚合酶,通过PCR方法,扩增SmNAC1基因的特异性片段。通过BP重组反应,将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上,再通过LR重组反应,利用入门载体上的SmNACi特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上。实验结果表明Gateway载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上,为植物基因转化提供基础。     

乌拉尔甘草HMGR基因cDNA的克隆与序列分析

目的:对乌拉尔甘草3.羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR)的cDNA克隆并进行序列分析.方法:根据NCBI数据库中的豆科其他物种HMGR的cDNA保守区设计引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从甘草根中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开发阅读框,Prosite分析蛋白质的基本结构域,Clustal x比对已有HMGR的氨基酸序列,并构建进化树.结果:得到1个全长为1 842 bp的HMGR的cDNA序列,含有1 722 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码573个氨基酸,具有HMGR家族的特异序列,推测的氨基酸序列与豌豆、蒺藜苜蓿的氨基酸序列一致性分别为84%,76%.结论:对甘草HMGR基因的cDNA进行了克隆,为进一步研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A在甘草酸生物合成途径中的作用提供了理论依据.     

不同采收期金银花的产量和质量研究

目的 研究不同采收期对金银花产量和质量的影响,为金银花的合理采收、批号划分和综合开发利用提供参考。方法 在金银花不同的发育时期、采收时间,采集不同部位的样品,测定其生长指标、产量和绿原酸、木犀草苷量。结果 金银花不同采收期和忍冬不同采收部位的各项生长指标、产量和绿原酸、木犀草苷量差异显著。结论 金银花宜在“二白”至“大白”期采摘;第一茬花产量高、质量好,其次为第二茬花;忍冬枝叶绿原酸和木犀草苷的量较高,可以进行有效成分提取和综合利用。