黑逍遥散干预APP/PSI双转基因小鼠海马区Aβ降解相关基因和蛋白表达效应的研究

目的观察黑逍遥散对阿尔茨海默症(Alzheimer disease,AD)小鼠海马区β淀粉样蛋白前体(Amyloid beta precursorprotein,APP)、β淀粉样多肽1-42(β-amyloid1-42 Peptide,Aβ1-42)、糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、脑啡肽酶(Neprilysin,NEP)、胰岛素抵抗酶(Insulin-degrading enzyme,IDE)基因和蛋白表达的影响。方法 42只APP/PS1双转基因雄性小鼠称重后,按随机原则分为模型组(10只)、阳性对照组(10只)、黑逍遥散高剂量组(11只)、黑逍遥散低剂量组(11只)。10只同月龄、同种系的野生型C57BL/6雄性小鼠为空白组。连续灌胃3个月后,采用Morris水迷宫进行行为学检测,采用qRT-PCR和Western Bloting分别检测小鼠海马区APP(Aβ1-42)、GSK-3β、NEP、IDE基因和蛋白的表达。结果干预3个月后,小鼠逃避潜伏期:模型组较空白组显著延长,用药各组较模型组显著缩短,差异具有统计学意义(P<0.01);小鼠跨原平台次数:模型组较空白组显著减少,用药各组较模型组显著增多,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与空白组相比,模型组小鼠海马区APP基因和Aβ1-42蛋白,以及GSK-3β基因和蛋白相对表达量显著升高,NEP与IDE基因和蛋白相对表达量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05);与模型组相比,各用药组小鼠海马区APP基因和Aβ1-42蛋白以及GSK-3β基因和蛋白相对表达量显著降低,NEP与IDE基因和蛋白相对表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论黑逍遥可通过调节Aβ在海马区的异常代谢等作用,减缓AD小鼠认知能力的损伤。     

黑逍遥散对APP/PS1双转基因小鼠海马和脑皮层CaMKⅡα蛋白及其磷酸化表达的影响

目的:观察黑逍遥散对阿尔茨海默症(AD)小鼠海马和脑皮层钙调蛋白依赖性激酶2α(CaMKⅡα)及其磷酸化表达水平的干预效应。方法:30只APP/PS1双转基因雄性小鼠称体质量并按随机原则分为模型组、盐酸多奈哌齐组、黑逍遥散组,每组10只。同月龄、同种系的野生型C57BL/6雄性小鼠10只为空白组。盐酸多奈哌齐组(6 g·kg~(-1))、黑逍遥散组(3. 25 mg·kg~(-1))分别连续给药90 d后,Morris水迷宫检测行为学变化,免疫组化和蛋白免疫印迹法检测小鼠海马区和脑皮层CaMKⅡα蛋白及其磷酸化的表达。结果:干预90 d后,与空白组比较,AD模型组小鼠,逃避潜伏期显著延长,跨原平台和有效区域次数显著减少(P 0. 01),小鼠海马区及脑皮层Ca MKⅡα蛋白表达显著减弱或降低,而p-CaMKⅡα蛋白表达显著升高(P 0. 05,P 0. 01);与模型组比较,盐酸多奈哌齐和黑逍遥散组小鼠的逃避潜伏期均显著缩短、跨原平台次数均显著增加(P 0. 01),小鼠海马区及脑皮层Ca MKⅡα蛋白显著增强或升高,p-CaMKⅡα蛋白表达显著降低(P 0. 05,P 0. 01)。结论:黑逍遥散通过调节AD小鼠不同脑区参与细胞记忆形成机制的关键蛋白Ca MKⅡα及其磷酸化表达,进而发挥改善AD小鼠的学习记忆能力。     

黄精丸对阿尔茨海默病大鼠大脑的抗氧化作用及Aβ1-42，APP蛋白表达的影响

目的:探讨黄精丸药方(Huangjingwan,HW)对阿尔茨海默病(AD)大鼠大脑的抗氧化作用及β-淀粉样多肽1-42(Aβ_(1-42)),淀粉样前体蛋白(APP)表达的影响。方法:SD大鼠随机分成正常组,假手术组,AD模型组,HW低、中、高剂量组(相当药丸剂量1,3,9 g·kg~(-1)·d~(-1)组)。给大鼠腹腔注射1. 25%D-半乳糖液(120 mg·kg~(-1)·d~(-1),连续6周)后,再右侧脑室一次性注射Aβ_(1-42)10μg,制作大鼠AD模型;造模2周后各药物组大鼠灌胃相应剂量试验药物,假手术组及AD模型组大鼠灌胃给生理盐水1 m L,每天1次。灌胃持续8周。采用跳台实验评价各大鼠的学习记忆能力;体质量10%的负荷游泳实验测试各大鼠的体能耐力变化;比色法检测各大鼠大脑组织超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽还原酶(GR),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)抗氧化酶系活性,谷胱甘肽(GSH)与丙二醛(MDA)含量变化;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各大鼠大脑组织白细胞介素-1β(IL-1β),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),Aβ_(1-42)与APP蛋白含量变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各大鼠大脑APP蛋白表达变化。结果:与正常组比较,AD模型组大鼠表现出明显的痴呆状态,少动易呆卧,学习反应时间延长,学习记忆错误次数显著增多,体能衰减明显,大脑内抗氧化酶(SOD,GR,GSH-Px)活性及抗炎因子GSH水平显著降低,炎症因子MDA,IL-1β,TNF-α水平显著升高,Aβ_(1-42)蛋白含量显著升高,APP蛋白含量显著下降(P 0. 01)。与AD模型组比较,HW低、中、高剂量均可改善AD大鼠的痴呆症状,提高学习记忆成绩,改善机体虚弱、提高体能,升高大脑内SOD,GR,GSH-Px活性及抗炎因子GSH水平,降低MDA,IL-1β,TNF-α水平,并能降低大脑内Aβ_(1-42)及升高APP蛋白水平(P 0. 05,P 0. 01);且1～9 g·kg~(-1)·d~(-1)剂量范围内的HW,随剂量增加,药效作用越明显。结论:HW有防治AD的功能,这一作用与HW可以增强脑内抗氧化系统功能、降低神经炎症反应、降低氧化应激引发的Aβ_(1-42)沉积、维持APP蛋白表达水平等有关。     

贯叶金丝桃素对AD模型小鼠学习记忆能力及海马组织中Aβ_(1-42),βAPP及BACE1蛋白表达的影响

该文研究贯叶金丝桃素(HF)对5月龄APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力及海马组织中β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)、β淀粉样前体蛋白(βAPP)及β位点剪切酶1(BACE1)蛋白表达的影响,并初步探讨其作用机制。将5月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、罗格列酮组(12 mg·kg-1·d-1)及HF高、中、低剂量组(600,300,150 mg·kg~(-1)·d~(-1)),每组15只;另选15只同周龄同背景C57BL/6J小鼠设为正常对照组。药物使用前均稀释相同体积,采用灌胃给药,正常组及模型组给予同体积蒸馏水,每日1次,连续给药7个月。Morris水迷宫法检测AD模型小鼠学习记忆能力的变化,免疫组织化学方法和Western blot技术测定Aβ1-42,βAPP及BACE1的蛋白表达水平。Morris水迷宫结果提示,与正常组相比,模型组小鼠的学习记忆能力显著下降(P0.01);与模型组相比,HF各组及罗格列酮组小鼠学习记忆能力均有提高(P0.01或P0.05);免疫组织化学和Western blot技术检测结果表明,与正常组相比,模型组小鼠海马CA1区Aβ_(1-42),βAPP及BACE1蛋白表达均明显增加(P0.01);与模型组相比,HF各组及罗格列酮组小鼠海马CA1区Aβ_(1-42),βAPP及BACE1蛋白表达均有减少(P0.01或P0.05)。HF改善AD模型小鼠学习记忆能力的机制可能是通过抑制脑内βAPP及BACE1蛋白的表达,从而减少AD模型小鼠脑内Aβ_(1-42)蛋白的生成及淀粉样斑块沉积。     

复方苦参注射液对放射性肺损伤的肺保护作用

目的:观察复方苦参注射液对放射性肺损伤模型模型小鼠转化生长因子-β_1(TGF-β_1),Smad3蛋白(Smad3),糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β),β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响,并探讨其作用机制。方法:使用美国XStrahl小动物精准放疗辐照研究平台(SARRP),实施单次20 Gy双侧肺野照射建立放射性肺损伤小鼠模型,将32只小鼠随机分为正常组、模型组、复方苦参注射液组(5 g·kg~(-1)),地塞米松注射液组(0.5 mg·kg~(-1))。正常组和模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液,连续腹腔注射4周。苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理;免疫组化(IHC)检测小鼠肺组织E-钙粘蛋白(E-cadheren),波形蛋白(Vimentin)表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测组小鼠肺组织中TGF-β_1,Smad3,GSK-3β和β-catenin mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测组小鼠肺组织中TGF-β_1,Smad3,GSK-3β和β-catenin通道蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠肺系数显著升高(P0.01),且小鼠肺脏出现炎症细胞浸润,肺间质水肿、充血,肺泡结构破坏,部分肺泡萎缩。与模型组比较,复方苦参注射液组小鼠肺脏炎症细胞浸润及肺间质病变减轻,小鼠肺组织E-cadheren的水平显著升高(P0.01),小鼠肺组织Vimentin的水平显著降低(P0.01),TGF-β_1,Smad3,GSK-3β和β-catenin表达水平显著降低(P0.01)。与地塞米松注射液组比较,复方苦参注射液小鼠肺部病理形态学改变相仿,E-cadheren,Vimentin,TGF-β_1,Smad3,GSK-3β和β-catenin表达水平未见明显差异。结论:复方苦参注射液能够改善放射性肺损伤模型小鼠肺纤维化,其机制可能与抑制上皮间质转化(EMT)相关的TGF-β_1,Smad3,GSK-3β和β-catenin mRNA及通道蛋白表达,进而促进E-cadheren表达、抑制Vimentin蛋白表达,最终抑制EMT的发生有关。     

三七皂苷对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响

目的:研究三七皂苷(PNS)对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导的大鼠肾小管细胞上皮-间充质转化(EMT)的干预作用,并从沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)/TGF-β_1/Smad通路分析其可能机制。方法:在DMEM培养基中,用10%胎牛血清培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),分为正常组,TGF-β_1组(5μg·L~(-1)),白藜芦醇组(50 mg·L~(-1)),SIRT1阻断剂EX527组(10μmol·L~(-1)),PNS组(100 mg·L~(-1)),EX527+PNS组(EX527 10μmol·L~(-1),PNS 100 mg·L~(-1)),48 h后收集细胞;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测SIRT1,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),E-钙黏附蛋白(E-cadherin),TGF-β_1,Smad3,Smad4 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测SIRT1,α-SMA,E-cadherin,TGF-β_1蛋白表达。结果:与正常组比较,TGF-β_1组α-SMA mRNA及蛋白表达明显增多(P 0. 05),E-cadherin表达显著减少(P 0. 01);与TGF-β_1组比较,PNS,白藜芦醇组,E-cadherin mRNA及蛋白表达均显著增加(P 0. 01),α-SMA表达显著减少(P 0. 01),EMT发生被抑制,同时,SIRT1表达显著增加(P 0. 01),TGF-β_1,Smad3,Smad4表达显著降低(P 0. 01)。在SIRT1阻断剂EX527的干预下,PNS则不能发挥明显抑制作用。结论:PNS可以阻止TGF-β_1诱导的肾小管上皮细胞EMT的发生,其机制可能是通过激活SIRT1进而抑制TGF-β_1/Smad通路实现的。     

地黄饮子调节PERK/elF2α通路抑制能量代谢障碍AD小鼠脑内β淀粉样蛋白累积的作用机制

目的:以能量代谢障碍淀粉样前体蛋白(APP)/早老素基因1(PS1)转基因小鼠为阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型,探讨地黄饮子通过调控蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase r-like endoplasmic reticulum kinase,PERK),真核细胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eI F2α)通路抑制内质网应激导致的β-淀粉样蛋白(Aβ)累积的作用机制。方法:4月龄APP/PS1转基因小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药(安理申)组、地黄饮子低、中、高剂量组。除正常组小鼠腹腔注射无菌生理盐水外,其余各组小鼠均腹腔注射100 mg·kg-13-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NP) 1次。小鼠造模后,立即给药。灌胃给药1周后,Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力,高效液相色谱法检测小鼠脑内三磷酸腺苷(ATP),二磷酸腺苷(ADP),一磷酸腺苷(AMP)含量,并计算脑能荷(energy charge,EC)。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠脑内PERK,eI F2α磷酸化水平,β-淀粉样前体蛋白水解酶1(BACE1)表达水平。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测BACE1 mRNA表达水平。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠脑内Aβ含量。结果:与正常组比较,Morris水迷宫实验结果显示,在定位巡航实验中,地黄饮子可以明显缩短模型小鼠的逃避潜伏期(P 0. 05,P 0. 01);空间探索实验中,地黄饮子可以增加模型小鼠穿越目标区域的次数(P 0. 05,P 0. 01)和在目标象限的停留时间(P 0. 01),减少相对象限的停留时间(P 0. 05,P 0. 01)。地黄饮子可以显著降低AMP水平,明显升高ATP,ADP水平,显著提高模型小鼠脑内EC水平(P 0. 05,P 0. 01),抑制PERK,eI F2α的磷酸化(P 0. 01)和BACE1的蛋白水平(P 0. 01),但对BACE1 mRNA转录没有显著影响。地黄饮子能够减少模型小鼠脑内Aβ的含量(P 0. 01)。结论:地黄饮子可以通过阻止能量代谢障碍导致的内质网应激通路PERK/eI F2α激活,抑制BACE1的翻译,从而减少能量代谢障碍APP/PS1小鼠脑内Aβ的累积。     

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨大补元煎促进APP/PS1双转基因阿尔茨海默病小鼠海马神经发生的作用机制

目的:通过研究大补元煎对淀粉样前体蛋白/早老素1(APP/PS1)小鼠海马Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的作用,探讨大补元煎促进神经发生的可能机制。方法:5月龄APP/PS1小鼠30只和野生鼠10只,分为正常组、模型组、奈哌齐组(6.5×10~(-4)g·kg~(-1)·d~(-1))和大补元煎组(13.2 g·kg~(-1)·d~(-1)),灌胃30 d,正常组和模型组给予等体积生理盐水。应用水迷宫评价小鼠学习记忆力;应用苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠海马神经元病理形态变化;应用免疫组化(IHC)检测5-溴脱氧尿苷(Brdu),肾上腺皮质激素(Dcx)和神经元核抗原(Neu N)的阳性细胞数;应用实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠海马中β-catenin,糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)mRNA和蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠平台潜伏期和游泳总路程显著升高(P0.01),而穿越平台次数和目标象限时间显著降低(P0.01);与模型组比较,多奈哌齐组和大补元煎组小鼠平台潜伏期和游泳总路程降低(P0.05,P0.01),而穿越平台次数和目标象限时间升高(P0.05)。与正常组比较,模型组小鼠海马齿状回(DG)区神经元层次和数量减少,可见明显坏死的神经元;与模型组比较,多奈哌齐组和大补元煎组小鼠海马DG区神经元层次和数量增多,坏死神经元数量减少。与正常组比较,模型组小鼠海马DG区Brdu,Dcx和Neu N标记的阳性细胞数明显降低(P0.01);与模型组比较,多奈哌齐组和大补元煎组小鼠海马DG区Brdu,Dcx和Neu N标记的阳性细胞数增加(P0.05,P0.01)。与正常组比较,模型组小鼠海马中β-catenin mRNA和蛋白表达水平显著下降(P0.01),而GSK-3β的基因和蛋白表达水平显著升高(P0.01);与模型组比较,多奈哌齐组和大补元煎组小鼠海马β-catenin mRNA和蛋白表达水平升高(P0.05,P0.01),而GSK-3βmRNA和蛋白表达水平下降(P0.05,P0.01)。结论:大补元煎通过调节Wnt/β-catenin信号通路促进APP/PS1双转基因小鼠海马神经发生。     

补肾填精法对肾虚阿尔茨海默小鼠海马自噬的干预作用

目的:通过研究六味地黄丸对肾虚阿尔茨海默病(AD)小鼠海马神经元自噬水平的改善作用及部分机制,探讨补肾填精法对AD的部分治疗机制。方法:健康雄性C57-B6小鼠分为正常组,AD组,肾虚AD组,六味地黄丸组(1. 08 g·kg~(-1))。正常组与AD组每日皮下注射生理盐水(15 m L·kg~(-1)),肾虚AD组和六味地黄丸组每日皮下注射氢化可的松注射液(15 m L·kg~(-1)),连续注射20 d。第21天除正常组侧脑室注射无菌生理盐水外,其余3组侧脑室注射β淀粉样蛋白25-35(Aβ_(25-35)),6μg/只。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组小鼠血清皮质醇、睾酮水平;透射电镜观察海马神经元细胞形态变化;免疫荧光检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测选择性自噬接头蛋白(p62)的蛋白表达。结果:与正常组比较,AD组和肾虚AD组小鼠的血清皮质醇、睾酮水平显著降低(P 0. 01),小鼠海马LC3表达显著减少(P 0. 01),小鼠海马p62蛋白表达显著增加(P 0. 01);与AD组比较,肾虚AD组小鼠的血清皮质醇、睾酮水平明显降低(P 0. 05,P 0. 01),小鼠海马p62蛋白表达显著增加(P 0. 01);与AD组和肾虚AD组比较,六味地黄丸组小鼠的血清皮质醇、睾酮水平显著升高(P 0. 01),小鼠海马LC3表达显著增多(P 0. 01),p62蛋白表达显著减少(P 0. 01)。正常组和六味地黄丸组小鼠神经元细胞内可见自噬小体,AD组和肾虚AD组小鼠神经元细胞内自噬小体鲜见。结论:补肾填精法能保护海马神经元细胞,增加海马神经元中LC3表达,降低p62表达水平,提高海马神经元自噬水平,对肾虚阿尔茨海默病具有一定的治疗作用。     

葛根素通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路调节HepG2细胞胰岛素抵抗

目的:观察葛根素对胰岛素抵抗Hep G2细胞内磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),蛋白激酶B(Akt),糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)信号分子的影响。方法:通过0.5 mmol·L~(-1)棕榈酸联合9×10~(-4)U·L~(-1)胰岛素孵育24 h诱导Hep G2胰岛素抵抗细胞模型,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率以确定葛根素给药浓度。实验设正常组、模型组和葛根素各剂量组(40,80,160,320μg·L~(-1))。葡萄糖检测试剂盒检测细胞培养液上清葡萄糖的含量,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞培养液上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6)的含量,肝糖原测定试剂盒测定Hep G2细胞内肝糖原含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞内PI3K,Akt,磷酸化(p)-Akt,GSK-3β,p-GSK-3β的蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组Hep G2细胞葡萄糖消耗率明显下调(P0.05),细胞内糖原含量减少(P0.05),细胞培养液上清中TNF-α和IL-6的含量增加(P0.05),PI3K和p-Akt蛋白表达下降(P0.05),GSK-3β蛋白表达增加(P0.05);与模型组比较,葛根素可呈剂量依赖性增加细胞葡萄糖消耗率(P0.05),增加细胞内肝糖原含量(P0.05),降低细胞培养液上清中TNF-α和IL-6的含量(P0.05),增加PI3K蛋白表达,上调Akt蛋白磷酸活化水平(P0.05),下调GSK-3β蛋白表达并增强其磷酸失活水平(P0.05)。结论:葛根素可通过增强PI3K/Akt/GSK-3β信号转导过程,增加肝细胞内糖原含量从而改善Hep G2细胞的胰岛素抵抗状态。     

二苯乙烯苷调控CREB/BDNF信号通路对Aβ25-35损伤的小鼠神经元突触的保护作用

目的:研究中药何首乌有效成分二苯乙烯苷(TSG)对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)损伤的小鼠海马神经元的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法:小鼠海马神经元细胞分离自新生48 h内胎鼠大脑海马,培养9 d待神经元成熟后,采用免疫荧光法对其进行鉴定。将培养成熟的神经元细胞分为正常组、模型组(Aβ25-35孵育造模)和TSG组(Aβ25-35孵育造模后,分别加入TSG 6.25,12.5,25,50,100μmol·L~(-1))。细胞增殖毒性检测(CCK-8)试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)法检测各组细胞活性,免疫荧光法检测突触素-1(SYN-1)蛋白的表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测突触后膜致密蛋白-95(PSD-95)和突触体素(SYP)的含量,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)和脑源性神经营养因子(BDNF) mRNA的表达,免疫荧光法和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CREB,磷酸化CREB(p-CREB)和BDNF蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组细胞存活率显著降低,LDH释放量显著增高(P0.01),SYN-1,PSD-95和SYP的含量明显降低(P0.05,P0.01),p-CREB和BDNF mRNA及蛋白的表达明显下调(P0.05,P0.01);与模型组比较,不同浓度TSG均可提高细胞存活率,降低LDH释放量(P0.05,P0.01),TSG对Aβ25-35造模的小鼠海马神经元细胞的最适治疗浓度为25μmol·L~(-1); 25μmol·L~(-1)TSG能够显著增强SYN-1的表达量(P0.01),明显提高PSD-95和SYP的含量(P0.05);上调p-CREB和BDNF mRNA及蛋白的表达(P0.05,P0.01),但对CREB mRNA及蛋白的表达无显著影响。结论:TSG对Aβ25-35损伤的小鼠海马神经元突触具有保护作用,其机制可能与促进CREB的磷酸化使p-CREB表达增多,并促进神经营养因子BDNF的释放有关。     

基于PP2A与GSK-3β探讨丹栀逍遥散对阿尔茨海默病模型大鼠tau蛋白磷酸化水平的作用机制

目的：研究丹栀逍遥散对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马中tau蛋白磷酸化水平与糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、磷酸丝氨酰/磷酸苏安酰蛋白磷酸酶2A(PP2A)不同位点的影响及作用机制。方法：选用90只SPF级Wistar雄性大鼠,用双侧海马区注射冈田酸的方式建立AD大鼠模型。筛选出造模成功的大鼠,随机分为模型组,安理申组(0.5 mg·kg^-1),丹栀逍遥散高、中、低剂量组(17.55、8.77、4.38 g·kg^-1),连续灌胃42 d,1次/d。Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,尼氏染色观察海马区神经元形态结构,实时荧光定量聚合链式反应(Real-time PCR)检测tau蛋白、GSK-3β、PP2A mRNA表达情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测tau蛋白、GSK-3β、PP2A及相关蛋白的表达。结果：与空白组比较,模型组大鼠学习记忆能力显著降低(P<0.01),海马CA3区细胞结构异常,排列杂乱,数量减少,GSK-3β mRNA、GSK-3β、p-GSK-3β-Tyr216、p-PP2A、p-tau表达...     

当归芍药散对AD细胞模型铜离子介导的Aβ聚集的影响

目的:以β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)和铜离子(Cu~(2+))络合物作用的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞为阿尔茨海默病(AD)模型,探讨Cu~(2+)对Aβ聚集方式和神经毒性的影响及当归芍药散对Cu~(2+)介导的Aβ毒性的AD细胞模型的影响。方法:将Aβ1-42(20μmol·L~(-1))与不同浓度硫酸铜(Cu SO4,20,40μmol·L~(-1))反应后用硫黄素T(Th T)染色法检测Aβ聚集状态,再进行Aβ1-42-Cu~(2+)组(20+20μmol·L~(-1)),当归芍药散组(1. 6,3. 2,6. 4 mg·L~(-1)) Th T染色检测Aβ聚集状态。培养SH-SY5Y细胞,分别孵育不同浓度的Aβ1-42(1. 25,2. 5,5,10,20,40μmol·L~(-1))及当归芍药散(1. 6,3. 2,6. 4,12. 8 mg·L~(-1)),24 h后行噻唑蓝(MTT)比色法确定Aβ1-42损伤浓度和当归芍药散保护浓度。随后将SH-SY5Y细胞分为空白组,Aβ1-42-Cu~(2+)组(20+20μmol·L~(-1)),当归芍药散组(20μmol·L~(-1)+20μmol·L~(-1)+1. 6 mg·L~(-1)),空白组加入培养基,共作用24 h后行MTT比色法检测细胞生存率,显微镜拍摄细胞形态,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胞内胞外Aβ1-42聚集状况。结果:与Aβ1-42组比较,Cu~(2+)和Aβ1-42结合成更多更大的Aβ聚集物。与正常组比较,模型组细胞活力明显降低(P 0. 05,P 0. 01),增加细胞内外Aβ1-42聚集(P 0. 05,P 0. 01);与模型组比较,当归芍药散能提高Aβ1-42-Cu~(2+)损伤的SH-SY5Y的细胞生存率(P 0. 05,P 0. 01),减少胞外Aβ1-42蛋白(P 0. 05,P 0. 01)。结论:Cu~(2+)能够增加Aβ的聚集及毒性;当归芍药散能明显减轻Cu~(2+)介导的Aβ聚集导致的SH-SY5Y细胞损伤,使Aβ内吞,减少胞外Aβ聚集,提高细胞生存率。     

黄精丸对D-半乳糖和冈田酸所致学习记忆障碍小鼠海马Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

目的 探讨黄精丸对D-半乳糖和冈田酸所致学习记忆障碍造模的阿尔茨海默病（AD）小鼠海马Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路相关蛋白表达的影响,探讨其相关的作用机制。方法 采用小鼠颈背部皮下注射1.0% D-半乳糖液（0.14 g·kg^-1·d^-1,连续4周）后,再右侧脑室一次性注射冈田酸2 μL（75 ng）,制作小鼠AD模型,经Morris水迷宫检测挑选造模成功的AD小鼠,再随机分为AD模型组,美金刚组（1.3×10^-3 g·kg^-1·d^-1）,黄精丸组（2.5 g·kg^-1·d^-1）,另设假手术组和正常组;同时点给假手术组的小鼠右侧脑室一次性注射生理盐水2 μL处置作造模对照。造模2周后给两实验药物组小鼠灌胃相应剂量的试验药物,持续4周;另外,AD造模2周后,同时给假手术组及AD模型组小鼠每天灌胃等量生理盐水,持续4周;正常组小鼠无特殊处理。灌胃结束后,采用穿梭实验检测各组小鼠学习、记忆水平的区别;免疫组化检测各组小鼠海马CA1区β-catenin及糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）阳性神经元数量改变;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测各组小鼠海马GSK-3β,β-catenin,细胞周期蛋白D₁（CyclinD₁） mRNA表达差异;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组小鼠海马总GSK-3β（t-GSK-3β）,Ser9位磷酸化GSK-3β（p-Ser9-GSK-3β）,Tyr216位磷酸化GSK-3β（p-Tyr216-GSK-3β）,总β-catenin（t-β-catenin）,磷酸化β-catenin（p-β-catenin）和CyclinD₁蛋白表达变化。结果 与正常组比较,AD模型组小鼠痴呆症状较明显,学习与记忆成绩明显降低,海马CA1区β-catenin免疫阳性神经元数量、海马t-β-catenin与CyclinD₁ mRNA及蛋白表达水平,p-Ser9-GSK-3β蛋白水平,p-Ser9-GSK-3β/t-GSK-3β及p-Tyr216-GSK-3β/t-GSK-3β值显著降低（P<0.01）,海马CA1区GSK-3β免疫阳性神经元数量、海马t-GSK-3β mRNA及蛋白表达水平,p-Tyr216-GSK-3β及p-β-catenin蛋白水平,p-β-catenin/t-β-catenin值均显著升高（P<0.01）。与AD模型组比较,黄精丸组小鼠痴呆症状显著改善,学习与记忆成绩明显提高,海马CA1区β-catenin免疫阳性神经元数量、海马t-β-catenin,CyclinD₁ mRNA及蛋白表达水平,p-Ser9-GSK-3β蛋白水平,p-Ser9-GSK-3β/t-GSK-3β值均显著升高（P<0.01）,海马CA1区GSK-3β免疫阳性神经元数量、海马t-GSK-3β的mRNA及蛋白表达水平,p-Tyr216-GSK-3β及p-β-catenin蛋白水平,p-β-catenin/t-β-catenin值均显著下降（P<0.01）,但p-Tyr216-GSK-3β/t-GSK-3β值无明显统计学差异。结论 黄精丸可下调AD小鼠海马t-GSK-3β表达并降低其蛋白活性,上调t-β-catenin表达并增加其蛋白活性,进而使下游CyclinD₁表达增强,促进目的基因转录,发挥治疗AD作用,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨黑逍遥散对AD模型大鼠神经炎症的影响

目的 研究黑逍遥散是否可以通过调控激活Wnt β-连环蛋白（β-catenin）信号通路抑制阿尔茨海默病（AD）大鼠海马区炎症反应，改善AD大鼠认知和记忆功能障碍。方法 90只雄性Wistar大鼠先随机分别选择12只作为空白组和假手术组，剩余大鼠在左右两侧海马区注射β淀粉样蛋白₄₂（Aβ₄₂）制造AD模型大鼠，随机分为模型组、黑逍遥散低、中、高剂量组和多奈哌齐组，每组12只，并连续42 d给予相应剂量黑逍遥散和多奈哌齐灌胃。尼氏染色观察海马CA1区病理形态学变化；Morris水迷宫实验检测1~5 d大鼠逃避潜伏期的变化，第6天的空间探索能力。酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠海马组织和血清中白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测检测海马中海马区糖原合成激酶-3β（GSK-3β）、β-catenin、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的蛋白表达水平；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测大鼠GSK-3β、β-catenin、PPARγ mRNA的水平。结果 与空白组比较，模型组大鼠海马CA1区神经元数量明显减少，排布不均，细胞体损坏比较明显，尼式小体不清；模型组大鼠第3~5天的逃避潜伏期均相比治疗组显著延长（P<0.01），跨台次数显著减少（P<0.01）；模型组大鼠血清和海马组织中IL-10水平显著降低，IL-6、TNF-α水平显著升高（P<0.01）；模型组GSK-3β蛋白和mRNA显著升高，β-catenin、PPARγ蛋白表达显著降低（P<0.01），差异较为明显；与模型组比较，黑逍遥散中、高剂量组和盐酸多奈哌齐组大鼠神经元细胞数量分布较多，排列整齐，结构完整，尼式小体清晰明确；黑逍遥散中、高剂量组和多奈哌齐组的第3~5天逃避潜伏期显著缩短（P<0.01），跨越平台次数显著增多（P<0.01）；大鼠海马组织和血清中IL-10的表达水平明显升高，IL-6和TNF-α显著降低（P<0.01）；大鼠海马中GSK-3β蛋白和GSK-3β mRNA表达明显降低，β-catenin、PPARγ蛋白和β-catenin、PPARγ mRNA表达水平显著升高（P<0.01）。盐酸多奈哌齐组与黑逍遥散高剂量组之间各指标比较，差异无统计学意义。结论 黑逍遥散可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制AD大鼠海马区炎症反应，改善AD模型大鼠认知和记忆障碍。     

归芪聪志汤对VD模型大鼠海马神经元Claudin-1,TGF-β表达的影响

目的:研究归芪聪志汤对血管性痴呆(varscular dementia,VD)模型大鼠学习记忆和海马神经元紧密连接蛋白1(Claudin-1)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)表达的影响。方法:Wistar雄性大鼠120只,按随机数字表选10只大鼠作为假手术组,其余大鼠制备VD模型,选成功模型大鼠随机分为5组,分别为模型组、阳性组和归芪聪志汤低、中、高剂量组。归芪聪志汤低、中、高剂量组给药量分别为9.9,19.8,39.6 g·kg-1·d-1。阳性组给予脑复康吡拉西坦胶囊0.3 g·kg-1·d-1。假手术组、模型组给予等量水。每日1次。连续灌胃治疗28 d后,Morris水迷宫予以行为学检测,实时荧光定量PCR(Real-time PCR),免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)与蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组海马组织Claudin-1,TGF-β基因和蛋白表达。结果:灌胃治疗28 d后,与假手术组比较,VD模型组大鼠的平均逃避潜伏期明显延长、跨原平台次数明显减少(P0.01),大鼠海马的Claudin-1 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P0.05),大鼠海马的TGF-βmRNA及蛋白表达水平明显降低(P0.05);与模型组比较,各治疗组大鼠逃逸潜伏期均缩短,跨原平台次数均增多(P0.01),大鼠海马的Claudin-1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P0.05),大鼠海马的TGF-βmRNA及蛋白表达水平明显升高(P0.05),归芪聪志汤中剂量组与脑复康吡拉西坦胶囊组优于其他组(P0.05)。结论:归芪聪志汤能够显著改善VD大鼠的学习记忆能力,可能与调节脑组织细胞间黏附作用、抑制炎性因子表达等有关。     

抗纤灵方对肾纤维化大鼠TGF-β1/Smad信号通路表达的影响

目的:研究抗纤灵方对5/6肾切除所致肾纤维化大鼠的治疗效果,并探讨其分子作用机制。方法:将50只SD大鼠随机分为正常组(n=10),假手术组(n=10),5/6肾切除肾纤维化造模组(n=30)。将造模成功的大鼠随机分为模型组、抗纤灵组、氯沙坦钾组。氯沙坦钾组、抗纤灵方组每日分别给予氯沙坦钾(33. 3 g·kg-1)及抗纤灵方(21 g·kg-1)灌胃治疗,其余组都用等体积的生理盐水。持续8周灌胃后处死,检测各组大鼠血肌酐(SCr),尿素氮(BUN),24 h尿蛋白(24 h-Pro);苏木素-伊红(HE)染色观察肾脏组织病理学改变;马松(Masson)染色观察肾脏纤维化程度;蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分别检测肾脏转化生长因子-β_1(TGF-β_1),Smad2,Smad3,Smad7蛋白和mRNA在肾脏组织中的表达。结果:与正常组和假手术组比较,模型组大鼠的SCr,BUN,24 h-Pro上升,纤维化面积和肾脏损伤评分增加,TGF-β_1,Smad2,Smad3 mRNA与蛋白表达升高,Smad7 mRNA与蛋白表达显著下降(P 0. 01)。与模型组相比,氯沙坦钾组、抗纤灵方组可减少纤维化面积,降低肾脏损伤评分,SCr,BUN,24 h-Pro,TGF-β_1,Smad2,Smad3 mRNA与蛋白的表达水平,Smad7mRNA与蛋白表达显著上调(P 0. 01),但低于正常组与假手术组的水平。结论:中药抗纤灵方可通过抑制TGF-β_1/Smad通路来延缓肾纤维化。     

金丝桃苷对Aβ1-42介导的血脑屏障体外模型损伤的影响

目的:探讨金丝桃苷(hyperoside,Hyp)对淀粉样蛋白(Aβ_(1-42))介导的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)体外模型损伤的影响。方法:本研究以Hyp干预纤维状Aβ_(1-42)介导的b End.3细胞与原代星形胶质细胞(astrocytes,As)BBB体外共培养模型的损伤,通过检测各培养组荧光素钠的通透性,比较各组BBB渗透性的变化,评价Hyp对Aβ_(1-42)介导的BBB的通透性的影响;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测Hyp对Aβ_(1-42)介导的b End.3细胞损伤的细胞活力影响;再以蛋白免疫印迹法(Western blot)检测相关凋亡蛋白,初步探索其保护机制。结果:与模型组比较,Hyp低、中、高浓度组均能降低BBB的通透性(P0.05,P0.01);Hyp中、高浓度组能显著提高b End.3细胞活性(P0.05);Western blot结果显示,经Hyp预处理的组别中,Bax/Bcl-2,cleaved半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)/Caspase-3的及细胞色素-C(Cyt-C)的表达量均明显下降,且差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:Hyp通过保护脑微血管内皮细胞抑制纤维状Aβ_(1-42)诱导的BBB通透性增加。     

黄精丸抑制D-半乳糖和冈田酸所致学习记忆障碍小鼠海马神经元tau蛋白过磷酸化的作用机制

目的 探讨黄精丸对D-半乳糖和冈田酸所致学习记忆障碍造模的阿尔茨海默病（AD）小鼠大脑海马神经元糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）,蛋白磷酸酶2A（PP2A）活性的影响及其抑制tau蛋白过磷酸化机制。方法 采用小鼠颈背部皮下注射1.0% D-半乳糖液（0.14 g·kg^-1·d^-1,连续4周）后,再右侧脑室一次性注射（75 ng）冈田酸2 μL,制作小鼠AD模型,经Morris水迷宫检测挑选造模成功的AD小鼠,再随机分为AD模型组,美金刚组（1.3×10^-3 g·kg^-1·d^-1）,黄精丸组（2.5 g·kg^-1·d^-1）,另设假手术组和正常组;同时点给假手术组的小鼠右侧脑室一次性注射生理盐水2 μL处置作造模对照。造模2周后给两实验药物组小鼠灌胃相应剂量实验药物,持续4周。另外,AD造模2周后,同时给假手术组及AD模型组小鼠每天灌胃等量生理盐水,持续4周;正常组小鼠仅日常饲养。灌胃结束后,采用旷场实验及跳台实验评价各小鼠的探索活动能力、焦虑水平及学习记忆能力差异;尼氏染色检测各组小鼠海马CA1,CA3区神经元数量差异;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测各组小鼠海马GSK-3β,PP2A mRNA表达变化,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组小鼠海马GSK-3β,PP2A,磷酸化tau（p-tau）与总tau（t-tau）蛋白的表达变化。结果 与正常组比较,AD模型组小鼠自发活动能力与探索行为能力低、焦虑水平高,表现出较明显的痴呆状态,少动且易呆卧躲藏,学习反应时间要长,学习记忆错误次数明显增多,海马CA1与CA3区神经元数量均减少,PP2A mRNA及蛋白表达显著下降,GSK-3β mRNA及其蛋白表达,p-tau蛋白水平及p-tau/t-au值均显著升高（P<0.01）,t-tau蛋白表达水平有所降低但差异无统计学意义。与AD模型组比较,黄精丸组小鼠自发活动能力与探索行为能力强、焦虑水平低、学习与记忆成绩明显提高,海马CA1与CA3区神经元数量增多,PP2A mRNA及蛋白表达显著升高,GSK-3β mRNA及蛋白表达,p-tau蛋白水平及p-tau/t-tau值均显著降低（P<0.01）,但t-tau蛋白表达水平差异无统计学意义。结论 黄精丸可抑制AD小鼠海马神经元tau蛋白过磷酸化,恢复tau蛋白功能,保护海马神经,进而发挥抗AD作用,其机制可能与调控海马神经元GSK-3β与PP2A活性平衡有关。     

姜黄素对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠Aβ42及其降解酶NEP表达的影响

目的:观察姜黄素对APPswe/PS1 dE9双转基因小鼠Aβ42及其降解酶NEP表达的影响.方法:将3月龄的APP-swe/PS1dE9双转基因小鼠随机分为模型组、阳性对照组、姜黄素高、中、低剂量组.灌胃3个月后,应用Morris水迷宫、免疫组织化学、Western blot等方法进行检测.结果:行为学检测,治疗组与模型组相比定位航行实验和空间探索实验存在不同程度的差异(P＜0.0l或P＜0.05).Aβ2及其降解酶NEP表达,模型组小鼠大脑海马CA1区较正常对照组Aβ42阳性细胞明显增加(P＜0.01).结论:姜黄素能通过增加Aβ42降解酶NEP表达、降低Aβ42蛋白,进而改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的学习记忆能力.