霍乱弧菌含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体转染检测

[目的 ]研究霍乱毒素基因 (ctx)在霍乱弧菌O1 群埃尔托型、古典型菌株和O1 39群菌株之间的传递现象 ,了解含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体 (CTXΦ)在ctx基因转移中的作用。 [方法 ]从人工构建的供体菌中诱导出带有标记的CTXΦ并转染至受体菌 ,用PCR扩增和Southern杂交等方法检测受体菌、转染子及其质粒的目的基因片段。 [结果 ]从受体菌O395、569B(古典型 )和 80 0 71 (埃尔托型 )的转染子中均检出带有供体菌标记的质粒 ,PCR和Southern杂交结果表明这些质粒是CTXΦ的复制形式。 [结论 ]ctx基因能通过CTXΦ在不同霍乱弧菌间进行传递     

O139群霍乱弧菌16S rRNA基因分型分析

[目的]研究北京市O139群霍乱弧菌的分子生物学特征。[方法]对北京市1998～2000年的30株O139群霍乱弧菌进行PCR霍乱肠毒素（CT）基因检测,以16SrRNA为探针对菌株DNA进行Southern杂交后对图谱进行核糖体基因（RT）分型分析。[结果]对30株霍乱弧菌RT图谱进行分析,共存在5种16SrRNA核糖体基因型,其中CT阳性的O139群霍乱弧菌为RT1型,CT阴性的O139群霍乱弧菌为RT2-RT5型。[结论]北京市不同年份的O139群霍乱弧菌CT阳性菌株核糖体基因型较为单一,CT阴性菌株基因型具有明显的多样性。提示北京市O139群霍乱弧菌CT阳性菌株和CT阴性菌株遗传发生上相距较远。     

112株霍乱弧菌的生物学特性、毒力基因和耐药变迁的研究

目的：了解浙江温岭霍乱弧菌的生物学特性、毒力基因和耐药情况,为霍乱防治提供科学依据.方法：以霍乱弧菌主要毒力因子基因ctx为引物,对112株霍乱弧菌（O1群92株、O139群20株）进行了PCR扩增.采用WHO推荐的改良K-B纸片法,对所有菌株进行了18种抗菌药物的药敏试验.结果：除外环境检出的4株O1群霍乱弧菌菌株外,其余的霍乱菌株均扩增出与阳性对照一致的ctx毒力基因条带.药敏试验结果显示O139群霍乱弧菌的耐药性明显高于O1群霍乱弧菌,不同年份的菌株耐药的程度不一致.结论：从所有病人中分离到的菌株均为产毒株,与致病性和流行强度有关,治疗霍乱病人应结合本地区情况,根据不同菌型选择相应的抗生素药物.     

2009-2012年江西省外环境霍乱弧菌致病力及药敏检测

目的掌握江西省外环境中霍乱弧菌菌型分布、毒力基因、耐药现状,为霍乱防治提供科学依据。方法采用血清学分型法对外环境中分离的霍乱弧菌进行分型,同时以主要毒力基因ctx为引物对检索的霍乱弧菌进行PCR扩增,并应用K-B纸片法对部分菌株进行10种抗生素的药物敏感试验。结果 2009-2012年期间,共从外环境中分离到霍乱菌株156株。毒力实验结果显示37株O139群中15株扩增出与阳性对照一致的毒力基因(ctx)条带,而119株O1群除2株小川型外,其余均未扩增出毒力基因(ctx)条带,与阴性对照一致。药敏结果显示:O139群和O1群对丁胺卡那霉素、诺氟沙星、环丙沙星、头孢噻肟90%以上敏感。结论江西省2009-2012年间外环境中分离到的霍乱弧菌中,O139群与O1群并存,O1群为优势菌;水产品中O139群菌株绝大多数为产毒株,而O1群菌株绝大多数为非产毒株。应重点加强水产品的霍乱监测。药敏结果供霍乱治疗和必要时的预防药物选择提供依据。     

一株非典型O1群霍乱弧菌实验室诊断与分析

目的:一株从腹泻病人分离到的O1群霍乱弧菌的实验室鉴定和毒力基因的检测与分析。方法:细菌的分离和鉴定按照卫生部疾病控制司第五版《霍乱防治手册》进行;用PCR方法对该菌株的ctxA、rtxA、Ace、TcpA、Cri、Zot 6种毒力基因进行检测。结果:经分离培养、生化反应、噬菌体-生物分型,确定该菌株是埃尔托霍乱弧菌5 e型流行株,菌落形态不典型,毒力基因TcpA、rtxA阳性,其它毒力基因均为阴性。结论:尽管该菌株从腹泻病人分离且确定为埃尔托流行株,但其霍乱肠毒素主要控制基因ctxA阴性,且菌落形态不典型,该菌是一株非典型的O1群霍乱弧菌。     

实时荧光PCR法、胶体金法和培养法检测甲鱼中霍乱弧菌

目的优化水产品甲鱼中霍乱弧菌的检测程序,提高甲鱼中霍乱弧菌检出率。方法用实时荧光PCR、常规细菌培养、胶体金法同时对甲鱼中霍乱弧菌进行检测,并用实时荧光PCR法检测标本中霍乱弧菌ctx基因。结果共检测185份甲鱼样品,其中实时荧光PCR法检出28份霍乱弧菌核酸阳性,阳性率为15.14%;6份ctx基因核酸阳性,阳性率21.43%(6/28)。常规细菌培养法分离出2株菌株,一株为O139群霍乱弧菌,一株为小川型霍乱弧菌,用实时荧光PCR检测这两株纯培养菌株或原始标本,霍乱弧菌ctx基因均为阴性;胶体金法未检出阳性标本。结论对于水产品标本,可先用实时荧光PCR法筛检霍乱弧菌,阳性标本再进行传统细菌分离培养,以提高霍乱弧菌菌株的检出率;同时阳性标本进行霍乱弧菌ctx基因核酸检测,如也为阳性,需提高警惕,加强流行病学上的预防控制措施,及时防范霍乱疫情的发生。     

非O1/非O139群霍乱弧菌感染病例分离株分子流行病学分析

目的 分析安徽省马鞍山市连续2个月内监测到的6例具有霍乱疑似症状、感染非O1/非O139群霍乱弧菌的病例,判断疫情的聚集性.方法 对病例分离株进行生化和血清型别鉴定以及溶血试验,药敏试验检测抗生素耐药谱,应用荧光PCR和常规PCR进行霍乱弧菌特异基因、毒力及其相关基因的检测,包括ompW、ctx 、tcpA、toxR、hlyA 、zot、ace、rstR和gⅢCTX,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析其分子型别.结果 生化鉴定和血清学试验鉴别腹泻病例6株菌株为非O1/非O139霍乱弧菌,均产生β溶血;14种药物中有12种属于全部敏感;荧光PCR检测霍乱弧菌特异性基因ompW均为阳性,ctx、tcpA 、zot、ace、rstR和gⅢCTX基因均为阴性,toxR 、hlyA基因有5株菌扩增阳性,1株菌(1001434446)为阴性;PFGE显示6株菌带型均不相同,但有2株非常相似,分离株与霍乱弧菌产毒株相似性很低.结论 6例感染非产毒的非O1/非O139群霍乱弧菌病例发病虽相对集中,但属于散发病例,在局部地区频繁出现,提示其公共卫生意义不可忽视.     

丹东口岸首次从进口冷冻水产品中检出O1群霍乱弧菌

[目的]对丹东口岸入境水产品进行霍乱弧菌监测，防止霍乱弧菌传入我国，引起疫情。[方法]参照《霍乱诊断标准及处理原则》（GB15984—1995）和卫生部1999年出版的《霍乱防治手册》中的检验方法进行检验。[结果]丹东口岸从朝鲜进口冷冻水产品（冻章鱼）中检出霍乱弧菌，经鉴定为O1群小川型霍乱弧菌，为丹东局首次从冷冻水产品中检出该菌，CT毒素基因检测阴性。[结论]从冷冻水产品中检出O1群霍乱弧菌在国内较为少见，往往被人们所忽视。虽然本次检出的O1群霍乱弧菌CT毒素基因检测阴性，但仍应引起高度重视。     

山东省分离的霍乱弧菌毒力基因的研究

目的：了解山东省不同年代、不同地区收集的霍乱菌株携带的毒力基因情况、分布特点和变迁。方法：应用分子杂交、PCR技术对霍乱弧菌的CTX基因元件中的ctxA、zot基因，VPI毒力岛中的tcpA、tcpH、aldA、toxT、acfB基因，TLC因子中的cri、orf2—3基因，RTX基因簇中的rtxA、rtxC，以及toxR基因进行了检测。结果：用原位杂交检测，180株霍乱弧菌中有168株携带CTX遗传单元中的ctxA、zot、RS1基因，阳性率均为93．33％，表现出高度的一致性。用打点杂交检测不同时期的28株01群霍乱弧菌，所有被检菌都具有ToxR、RTX相关基因，在1980～1987年间分离的O1群霍乱弧菌流行株中，有92．86％携带编码TLC因子的基因，而1994～2000年间分离的流行株菌株中编码TLC因子的基因携带率仅有7．14％。Southern杂交结果显示，48株O1群霍乱弧菌可产生大小为9．4kb和6．5kb左右的两条ctxA杂交带，用zot基因探针进行杂交，11株O1群霍乱弧菌可产生与ctxA杂交带同样大小的条带。1株O139霍乱弧菌具有检测的所有毒力基因，但其ctxA（zot）杂交带与O1群霍乱弧菌有差异。结论：目前已知的霍乱弧菌毒力基因在山东省分离到的菌株中有广泛的分布，并且随时间的推移而发生变迁。     

霍乱疫情分离株流行菌型及耐药性分析

目的了解霍乱疫情分离株的流行菌型及其耐药性,为霍乱疫情的快速有效控制和临床治疗提供科学依据。方法对2008年6月海南省某地霍乱疫情采集的6株霍乱弧菌分离株进行血清学分型、噬菌体-生物分型、霍乱毒素基因检测、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型和药物敏感性试验。结果 6株菌均属埃尔托生物型霍乱弧菌,除1株为O1群小川型霍乱弧菌流行株(1c),其余5株均为O1群稻叶型霍乱弧菌流行株(1c);6株菌均具有霍乱毒素基因;PFGE分型为2个型,但聚类图谱分析相似性为100%;6株菌均对链霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑、多粘菌素B耐药;对诺氟沙星、头孢噻肟、头孢噻吩等9种抗生素均敏感;结论该起霍乱疫情的流行菌型为O1群埃尔托霍乱弧菌稻叶型流行株(1c);诺氟沙星、头孢噻肟、头孢噻吩等可作为病例和带菌者治疗的指导用药,链霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑、多粘菌素B则不宜使用。     

霍乱弧菌毒力基因检测与16S rRNA基因分型研究

目的：了解浙江省霍乱弧菌毒力基因携带情况和16SrRNA基因型状况，为霍乱防治提供科学依据。方法：利用16SrRNA基因探针分析了浙江省不同时期分离的88株霍乱弧菌经BglI消化的16SrRNA基因限制性酶谱，以多重PCR法对140株霍乱弧菌进行6种毒力相关基因（ctxA、rtxA、Ace、TcpA、Cri、Zot）检测分析。结果：发现各菌株的杂交片断范围为2～12Kb，每个菌株有6～9条杂交带不等。88株霍乱菌株可分为9个16SrRNA基因型（ribotype，RT），其中埃尔托型霍乱弧菌（el tor vibrio cholerae，EVC）可分为6个RT，0139群霍乱弧菌（vibrio cholerae 0139，VC 0139）分为3个RT；所有VC0139菌株均携带3种以上毒力基因，86．3％的菌株携带全部6种毒力基因，所有EVC流行株均携带2种以上毒力基因，79．1％的菌株携带全部6种毒力基因。结论：认为霍乱流行菌株基因型的变迁可能是引起新一次流行的原因。结合毒素基因检测结果，我们认为VC0139与EVC在遗传特征上有相近的特点，但又有所区别。     

16株霍乱弧菌的23srRNA基因分析

分子杂交技术是现代流行病学的主要研究手段 ,它在追踪菌株的来源以及探讨造成不同地区流行的菌株之间的关系上有重要意义。核糖体 RNA的编码基因检测及多态性分析已广泛应用于分子流行病学的研究中 [1 ,2 ]。我们采用了 2 3sr RNA基因的 Southern杂交技术对不同来源、不同地区分离到的埃尔托霍乱弧菌进行了初步研究 ,以探讨在染色体分型上有无差异 ,报告如下。1　材料与方法1.1　实验菌株　 16株菌由两个省级防疫机构提供 ,菌株表型情况见表 1。1.2　试剂　 d NTPs、地高辛 (Dig)标记、检测试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品 …     

多重PCR检测霍乱弧菌的毒素相关基因

目的 探索建立一种快速、敏感地检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1／非O139群的毒素相关基因的方法。方法 针对霍乱弧菌霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)、小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱肠毒素基因(oce)、霍乱弧菌毒素共调菌毛A基因(tcpA)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)分别设计引物，建立多基因PCR方法；通过一次扩增反应之产物经琼脂糖凝胶电泳，可检测出菌株的毒素相关基因的携带情况。结果 阳性对照菌株：MO45(霍乱弧菌O139群)检出5种毒素相关基因，结果符合设计要求；其他不同来源的霍乱弧菌(O1群、O139群、非O1／非O139群)检出1—5种不等的毒素相关基因；根据毒素相关基因携带情况，可将菌株分为5个基因型，并可区分为产毒株和非产毒株；多重PCR敏感度可达10^2cfu／ml。结论 该方法快速、特异、敏感，具有较大的应用价值。     

霍乱弧菌几肿肠毒素基因的检测研究

目的：了解我省分离的霍乱弧菌中几种主要肠毒素基因的携带情况。方法；以地高辛标记基因探针，对我省历年分离的91株霍乱弧菌（包括EVC和VC O139）作霍乱肠毒素基因探针杂交检测。结果：EVC流行株和VC O139菌株中，普遍ctxAB,Zot,Ace等毒素基因，该3种基因的携带率分别达到100％，98．86％，96．59％，而EVC非流行菌株则均不携带上述3种毒素基因。结论：提示EVC流行株和VC O139菌株具备较强的产毒能力，流行性强，应重点加强监测与研究。从ctxAB原RFLP杂交图谱分析，EVC以流行株和VC O1390在遗传特征上具相近的特点，结果均显示2条阳性杂交带。     

霍乱毒素基因TaqMan实时PCR检测方法建立

霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的一种以急性水样便为特征的烈性肠道传染病[1].霍乱弧菌曾引起了7次全球大流行,以发病急、传播快和波及范围广为特征[2-3].霍乱弧菌的致病因子主要是霍乱肠毒素(cholera toxin,CT),是目前已知的致泻性毒素中最为强烈的毒素,是肠毒素的典型代表[4].因此,快速而特异地检测出霍乱弧菌,尤其是检测出能够产生CT的霍乱弧菌是疾病控制工作中的重要任务.目前对霍乱弧菌的检测方法主要有分离培养、Dot-ELISA和间接ELISA等免疫学方法,也有报道用常规PCR等分子生物学方法[5],但均存在着特异性、灵敏度不高,耗时长等缺点.因此,本研究以霍乱毒素基因( cholera toxin gene,ctx)为靶序列建立实时PCR检测方法,为快速检测产毒型霍乱弧菌提供一个可行的方法.     

福建省非典型埃尔托霍乱弧菌的遗传多样性研究

目的探索福建省非典型埃尔托霍乱弧菌(aEVC)的进化变迁规律,了解aEVC的变异株种类、基因特征,并分析不同类别变异株对霍乱流行趋势的影响。方法运用单基因片段分析技术,选择1962-2005年代表性O1群埃尔托霍乱菌株49株,对ctxB基因扩增产物进行序列测定和比对分析,确定ctxB基因型;同时对毒力因子tcpA和rstR基因分别进行古典型(Cl)和埃尔托型(El)特异的PCR扩增,确定其基因型别。结合ctxB、tcpA、rstR3种基因不同型别的组合形式,确定福建省aEVC菌株的多样性。结果1986年前菌株ctxB基因以埃尔托型B3型为主占92.00%(23/25),而1994年后菌株以古典型B1型为主占95.83%(23/24)。根据ctxB、rstR、tcpA3种基因不同型别的组合形式,1986年前菌株88.00%(22/25)表现为埃尔托型基因特征B3、El、El,1994年后菌株100.00%(24/24)表现为杂合型(Hybrid)变异株基因特征B1、El和(或)Cl、El。结论福建省霍乱菌株存在aEVC进化事件。ctxB、rstR、tcpA基因表现为B1、El和(或)Cl、El的杂合型变异株是福建省aEVC的主要特征型别,此类菌株于1994年后全面取代原来流行的埃尔托霍乱弧菌。不同血清型的aEVC变异株对菌株流行能力的影响不同,稻叶型埃尔托型菌株比杂合型流行时间要长,而小川型杂合型菌株比埃尔托型流行时间要持久。     

广州市水产品监测中霍乱弧菌分离株的分子特征研究

目的　了解广州市水产品监测中霍乱弧菌分离株的毒力特征,对其菌株进行同源性分析,研究其分子特征及流行病学意义。方法　2 0 0 4年6月采集广州市3家较大的水产品交易市场的海、水产品以及广州以往水型霍乱流行沿海地区的河水和珠江入海口海水,采用聚合酶链反应(PCR)方法对样本检出的霍乱弧菌分离株进行霍乱肠毒素基因(ctx)、小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)和毒力协同菌毛蛋白亚单位基因(tcpA)这4种毒力基因的检测,用随机扩增多态性分析(RAPD)结合SPSS软件对以上菌株进行多态性分析,对霍乱弧菌毒力进行快速测定并进行分子分型。结果　共采集海、水产品样本16 0份、水体样本90份,从样本中检出34株霍乱弧菌,其中分离自青蛙12株、虎纹蛙6株、牛蛙5株、养殖水5株、罗氏虾3株,其他3株,根据流行病学调查证实均为海南输入株。毒力基因检测表明,34株霍乱弧菌均未检出ctx和tcpA基因;14株菌(41% )可同时检出ace和zot基因,另有2株菌(6 % )只检出ace基因。所有34株霍乱弧菌的RAPD结果经聚类分析可分为2个聚类群,其中31株属于同一来源,只有3株菌与其他菌株的同源性有差异,但亲缘关系较近。结论　该次水产品监测的霍乱菌株均为非流行株,但仍需加强监测,预防霍乱流行株的出现而导致的霍乱散发和暴发流     

脉冲场凝胶电泳分型方法追溯霍乱传染源

目的　了解四川省 2 0 0 4年霍乱疫情分离菌株与常规监测的外环境和水产品中霍乱弧菌分离株之间的遗传相关性 ,追溯传染源 ,为预测疫情和制定防治措施提供依据。方法　O139群霍乱弧菌编码脂多糖 (LPS)特异性基因引物聚合酶链反应 (PCR)复核菌株 ,霍乱毒素 (CT)基因引物PCR检测霍乱毒力基因 ,脉冲场凝胶电泳 (PFGE)进行菌株的分子分型。结果　 2 5株受试菌株LPS基因 2对引物PCR结果均为阳性。所有 6株河水中分离的菌株均为CT基因阴性 ,其余均具有CT基因。 2 4株菌PFGE可分为 13个型。结论　LPS基因PCR检测结果从分子水平证实受试菌株均为O139群霍乱弧菌。河水中分离的 6株菌是非产毒株 ,其余菌株均具有致病性。环境水分离的O139群非产毒株之间以及产毒株与非产毒株之间遗传相关性较远。产毒株之间具有较高的同源性。四川省从甲鱼分离的O139群霍乱弧菌与同期流行的O139群霍乱弧菌分型的带型一致 ,在国内首次以分子流行病学分析提示甲鱼可能是四川省近年霍乱疫情主要传染来源之一。     

进出口水产品中霍乱弧菌的检测与分析

目的监测并分析进出口水产品中的霍乱弧菌。方法采用传统两步增菌,平板划线,分离可疑单菌落,VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪、普通PCR、实时荧光定量PCR和血清凝集试验确认分离菌株。结果从水产品样品分离的菌株全自动微生物鉴定仪鉴定结果相似度达97%,普通PCR和实时荧光定量PCR检测为霍乱弧菌,ctx毒素基因检测为阴性,血清凝集试验为非O1非O139群霍乱弧菌。结论从水产品中检出霍乱弧菌非流行株,但仍需要加强主动监测,预防疫情的暴发。     

霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立和运用

[目的]建立一种快速检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1非O139群及是否产毒株的方法。[方法]以霍乱弧菌的外膜蛋白基因（ompW）、编码O1群O抗原基因（O1rfb）和编码O139群O抗原基因（O139 rfb）、霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）为目的基因,建立一种多重PCR方法对霍乱弧菌进行检测和分型。[结果]根据相关基因携带情况分为6种型别,并分产毒株和非产毒株。以该法对140株霍乱弧菌分型结果与血清学诊断结果相一致,而其它弧菌和肠杆菌等均未检出相关基因。[结论]该方法快速、特异,可应用于霍乱弧菌的检测和分型。