骨软骨复合体修复软骨及软骨下骨缺损

目的探讨以诱导的兔骨髓基质细胞与双层PLGA支架构建组织工程骨软骨复合体,修复兔膝关节软骨及软骨下骨缺损的方法及结果。方法健康新西兰兔28只,分为三组。A组为常规培养MSCs(10只),B组为诱导培养MSCs(10只),C组为自体骨软骨块移植(8只)。密度梯度离心法获得骨髓基质干细胞(marrow-derivedstromalcells,MSCs),分别使用常规培养液和成软骨诱导条件培养液进行体外扩增传代。提取MSCs及关节软骨细胞总RNA,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。扫描电镜观察MSCs在PLGA双层支架上的复合与分布情况。A、B组MSCs分别与PLGA双层支架构建直径3.5mm、高3.0mm的骨软骨复合体,植入股骨髁髌骨滑车同比例骨软骨缺损区,术后第4、8、16、24周取材,进行大体观察、组织学检查和评分。结果RT-PCR见常规培养MSCs表达Ⅰ型胶原,无Ⅱ型胶原表达;诱导后MSCs表达Ⅰ、Ⅱ型胶原。扫描电镜观察MSCs在PLGA支架黏附生长良好,孔隙深处可见细胞分布。B组标本术后24周大体观察与正常软骨无明显差别,组织学检查为成熟的类透明软骨组织(4/6),优于A组(1/4)。结论MSCs具有成骨和成软骨潜能,可在基于细胞的软骨修复中作为种子细胞与双层PLGA构建组织工程骨软骨复合体,该复合体在实验动物模型中可修复关节软骨和软骨下骨缺损。     

基于永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞的工程化软骨形成的实验研究

目的 :探讨hTERT转染的永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞 (MSCs)裸鼠体内形成软骨的能力。方法 :通过真核表达载体 ,把人端粒酶逆转录酶基因转入兔髁状突软骨细胞 ,筛选并挑选阳性克隆进行扩增培养 ;取兔骨髓 ,密度梯度离心和培养 ,经诱导、扩增后与支架材料 β 磷酸三钙 (β TCP)复合 ,构建细胞 β TCP复合体 ,体外培育 1～ 2d后 ,植入裸鼠体内。通过粘多糖 (GAG)含量和Ⅱ型胶原的表达来检测 3和 6个月复合体软骨形成情况。结果 :两种细胞和 β TCP复合体在裸鼠体内均能形成软骨样组织 ;6个月 ,工程化软骨GAG含量和Ⅱ型胶原的表达均低于正常软骨组织 ,但无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :hTERT转染的永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞均具有良好的软骨形成能力 ,在软骨组织工程修复软骨缺损方面具有重要的应用前景。     

软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体修复兔膝关节骨软骨损伤

目的探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导的软骨细胞与聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)-Ⅱ型胶原支架通过管帽结构复合构建组织工程软骨复合体修复兔膝关节骨软骨损伤的效果及各界面耦合情况。方法BMSCs经软骨诱导液诱导成软骨细胞后接种于PLGA-Ⅱ型胶原支架的底层,支架表层戴管帽。将该细胞-支架复合物置入软骨条件培养液中培养2周,扫描电镜观察。将45只新西兰大白兔随机分为A、B、C 3组,每组15只,并于股骨髁处造模。分别于缺损处植入戴管帽结构复合的软骨支架复合体(A组)、PLGA-Ⅱ型胶原支架(B组)、不植入任何材料(C组)。于第4周和第12周取材行大体观察和组织学分析。结果 A组和B组缺损处均有软骨生成;C组缺损明显,只有纤维组织生长。A组软骨缺损部分软骨细胞修复,成骨区部分骨样细胞修复;两者耦合处犬牙交错,修复缺损程度及成骨区和成软骨区界面耦合情况明显优于B、C组。软骨组织学评分A组优于B、C组(P0.05)。结论 BMSCs诱导分化成的软骨细胞与PLGA-Ⅱ型胶原支架经过管帽结构构建成的软骨PLGA-Ⅱ型胶原支架复合体可有效修复兔膝关节骨软骨损伤,新生软骨、骨与宿主软骨、骨及新生软骨与软骨下骨各界面耦合良好。     

Ⅰ型胶原负载骨髓基质细胞修复兔膝关节软骨缺损

目的探讨同种异体骨髓基质细胞(MSCs)-Ⅰ型胶原复合移植修复关节软骨缺损的疗效。方法构建Ⅰ型胶原支架,将体外培养的兔MSCs吸附于该支架上培养,检测支架对MSCs的吸附及增殖的影响,再移植于兔膝关节全层软骨缺损处,分批取材,进行大体、组织学观察。结果MSCs在Ⅰ型胶原支架内贴附良好,分泌胞外基质,MSCs-胶原复合移植组软骨缺损处在术后12周为透明软骨样修复,空白对照组为纤维瘢痕样修复。结论Ⅰ型胶原支架与MSCs相容性良好,MSCs-胶原复合移植可达到透明软骨样修复软骨缺损。     

骨髓基质细胞体外增殖后移植修复关节软骨缺损的实验研究

目的 :用组织工程的方法将骨髓基质细胞体外培养增殖后植入软骨缺损 ,观察关节软骨缺损的修复效果。方法 :抽取兔骨髓基质细胞体外培养增殖后 ,将其与Ⅱ型胶原凝胶相结合 ,植入到兔膝关节实验性关节软骨缺损中 ,对照组的缺损分别置入与髓腔血混合的Ⅱ型胶原凝胶、单纯Ⅱ型胶原凝胶或不作任何处理 ,术后 4、8、12周取材观察及组织学检查。结果 :术后 4周 ,实验组的缺损由透明样软骨样组织充填 ,术后 12周 ,软骨及软骨下骨组织基本修复 ;在对照组缺损 ,软骨下骨在术后 12周亦基本修复 ,但表层软骨主要由纤维组织修复。结论 :骨髓基质细胞来源丰富 ,采集方便 ,经体外培养增殖后 ,足量的未分化细胞与Ⅱ型胶原凝胶载体相结合 ,修复关节软骨缺损的效果较好。     

细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷修复软骨缺损的实验研究

[目的]通过将骨髓间充质干细胞（MCSc）诱导的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞接种到三维多孔β-磷酸三钙（β-TCP）生物陶瓷支架材料上，体外构建骨软骨复合体，探讨以β-TCP为载体建造组织工程化软骨修复骨软骨缺损的可行性。[方法]将β-TCP多孔陶瓷加工成圆柱状，并将其作为构建人工软骨的细胞支架。在支架材料上分别接种从犬骨髓干细胞培养成的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞，将细胞-支架复合体共同培养1周后，移植到犬关节软骨缺损处。植入后12、16周末取材，进行大体观察、组织学及组织化学等观察。[结果]复合体体内移植后，在犬关节软骨缺损处有新生软骨形成，形成的软骨基本保持了支架材料原有形态。[结论]β-TCP多孔陶瓷可作为支架材料，复合细胞后具有修复软骨缺损的作用。     

骨形成蛋白-2转染兔骨髓基质细胞修复软骨缺损的研究

目的 观察骨形成蛋白-2(BMP-2)基因转染兔骨髓基质细胞(MSCs)复合藻酸钙修复兔膝关节软骨缺损的效果.方法 取4周龄的新西兰兔骨髓细胞,体外培养得到MSCs.选用24只成年新西兰兔,在两侧股骨髁非负重区造成全层软骨缺损模型,A组(实验组)植入BMP-2转染的MSCs+藻酸钙,B组(对照组Ⅰ)植入空质粒转染的MSCs+藻酸钙,C组(对照组Ⅱ)植入不含MSCs的藻酸钙,D组(对照组Ⅲ)旷置.12周后,观察软骨缺损修复情况及组织学评价.结果 实验组修复组织基本光滑,有大量Ⅱ型胶原蛋白表达,3个对照组修复组织Ⅱ型胶原蛋白表达量少,仍有明显缺损.实验组和3个对照组组织学评分差异有统计学意义(P＜0.05).结论 BMP-2转染兔MSCs修复软骨缺损效果优于其他对照组.     

兔骨髓间充质干细胞修复膝关节软骨缺损的实验研究

目的研究由同种异体兔骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化的软骨细胞和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)双层支架构建复合体对兔软骨缺损的修复作用。方法用密度梯度离心法和贴壁培养法获得5月龄兔骨髓来源间充质干细胞,在体外培养并进行分化诱导后作为种子细胞复合双层PLGA构建成复合体。36只兔在股骨髁间制造骨软骨缺损模型,分成三组,A组植入复合体,B组植入单纯双层PLGA支架,C组植入自体骨软骨。第24周取材进行大体观察、组织学检查和Wakitani评分。结果 A组及C组植入物愈合良好,组织学检查见Ⅰ、Ⅱ型胶原纤维形成。A组可见透明软骨修复。Wakitani评分A组2.75,B组7.00,C组1.98,A、C组与B组间统计学分析单项指标得分差异有统计学意义(P0.05),A组与C组间差异无统计学意义(P0.05)。结论诱导兔MSCs+PLGA双层支架能较好地修复兔膝关节骨软骨损伤。     

骨髓基质干细胞复合Ⅰ型胶原修复兔膝关节软骨缺损的研究

目的 探讨骨髓基质干细胞复合Ⅰ型胶原海绵对兔膝关节浅层大面积软骨缺损的修复作用;观察3H-TdR对骨髓基质干细胞的示踪作用.方法 骨髓基质干细胞复合组织工程支架Ⅰ型胶原海绵,植入修复兔膝关节大面积浅层软骨缺损模型,分别于术后4、12、24周取材,观察修复效果;运用3H-TdR标记骨髓基质干细胞,同法植入软骨缺损区,分别于术后4、12、16及24周取材,液体闪烁计数定量分析、乳胶封片、4周后显影定性分析.结果 实验组术后4周缺损表面未见明显的新生软骨形成;12周,缺损表面有少量的新生软骨形成;24周,缺损表面的新生软骨较4、12周的新生软骨明显,仍存在部分缺损尚未修复.对照组则均未见明显的修复.修复组织的细胞核内均有放射活性,与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05),提示修复组织的细胞来源为体外移植的细胞,而非自体细胞,至术后24周,植入的细胞仍然存活.结论 该方法对兔膝关节软骨缺损具有修复作用,但不能完全修复;所修复组织的细胞来源为植入的骨髓基质干细胞;3H-TdR标记对骨髓基质干细胞具有较好的长期示踪作用.     

软骨脱细胞基质-Ⅱ型胶原纳米支架复合BMSC修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的 观察软骨脱细胞基质(Cartilage acellular extracellular matrix,CAEM)-Ⅱ型胶原(CollagenⅡ,COLⅡ)纳米支架,复合骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)修复兔关节软骨缺损的效果。方法 CAEM和COLⅡ按质量比1∶1混合,通过静电纺丝技术制备组织工程纳米支架。将第二代BMSCs种植到该支架上,培养箱内静置2 h。12只日本大耳白兔随机分为实验组和对照组,将细胞支架复合物植入实验组兔膝关节软骨缺损处,对照组仅行膝关节软骨缺损建模。12周后实验动物取材,大体观察修复效果,并行HE染色、Ⅱ型胶原染色观察。结果 大体观察见实验组软骨缺损修复良好,对照组软骨缺损处由肉芽样组织充填。HE染色显示,实验组关节软骨缺损处可见软骨陷窝形成,对照组关节软骨缺损处仅有纤维组织充填。实验组修复区Ⅱ型胶原染色为阳性,对照组为阴性。结论 CAEM-COLⅡ纳米支架复合BMSC,对兔关节软骨缺损具有较好的修复能力,具有潜在的临床应用价值。     

一期获取自体脂肪干细胞复合可缓释诱导因子支架修复猪膝关节软骨缺损的初步研究

目的 探讨可缓释诱导因子支架的制备及一期获取自体脂肪来源干细胞(ADSCs)修复猪膝关节软骨缺损的可行性.方法 利用冷冻干燥技术制备冻干缓释支架,应用Elisa方法检测支架缓释诱导因子[转化生长因子- TGF-β2 (TGF-β2)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)]的浓度.采用密度梯度离心法分离获取猪ADSCs,取2个细胞支架复合体,体外培养3周后观察细胞在支架内的分布情况及软骨外基质的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的分泌情况.制备猪膝关节7 mm×7 mm正方形软骨缺损,同时一期获取足量ADSCs并与支架复合后一期植入缺损部位,观察软骨缺损的修复效果(实验组);以猪膝关节微骨折处理作为对照组,每组3只猪.实验动物于术后2、4个月取材,行大体观察及组织学观察.结果 冻干缓释支架在体外可以缓慢释放诱导因子,释放浓度未呈现迅速下降趋势.体外培养3周后ADSCs在支架内分布广泛、均匀,软骨特异性指标Ⅱ型胶原及蛋白聚糖呈阳性表达.实验组术后2个月有部分透明软骨修复,术后4个月缺损区被软骨组织样填充修复;HE染色显示有典型的透明软骨结构,但细胞密度较正常软骨组织高.对照组关节软骨缺损未能修复,表面充填纤维组织.结论 一期可获取足量用于移植的ADSCs,ADSCs复合在具有诱导分化功能的支架上后可以向软骨细胞分化,从而修复猪膝关节软骨缺损.     

骨髓间质干细胞复合生物陶瓷构建组织工程化人工软骨

目的 探索以多孔β-磷酸三钙(β-TCP)生物陶瓷材料为支架，经体外诱导的骨髓间质干细胞(MSCs)为种子细胞，构建组织工程化软骨修复羊关节软骨缺损的可行性。方法将28只中国美利奴绵羊分为三组。实验组(n＝12)：分离培养羊自体第7代MSCs，经转化生长因子-β诱导后接种到顶制的β-TCP多孔生物陶瓷材料上，细胞—材料复合体经体外孵育后，无菌条件下植入预制的羊单例肋骨近端关节面缺损处；单纯材料组(n＝12)：采用单纯β-TCP材料修复羊关节软骨缺损；空白对照组(n＝4)：制备的羊关节软骨缺损区未做任何修复。术后12周和24周分别取材，进行组织学、组织化学和免疫组织化学分折。结果 实验组术后12周羊关节软骨缺损处肉眼可见透明软骨祥组织形成，组织学检查发现，材料降解明显，未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生软骨组织，软骨细胞外基质丰富，Ⅱ型胶原染色阳性；术后24周，支架材料几乎完全降解，缺损区被新生软骨组织所取代。单纯材料组术后12周，缺损区边缘有新生软骨组织向支架材料内长入，支架材料吸收明显；术后24周，见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生软骨组织逐渐增多，但材料的中心部位未发现新生软骨形成。空白对照组至术后24周，仅见少量软骨组织从缺损区边缘向缺损区内长入，缺损中央大部分区域仍未得到修复。结论 以β-TCP多孔生物陶瓷作为支架材料，以自体MSCs作为种子细胞构建组织工程化软骨修复关节软骨缺损是可行的。     

三种不同方式构建组织工程软骨修复犬膝关节骨软骨缺损对比的实验研究

[目的]通过对比三种不同方式构建的骨软骨复合体修复比格犬膝关节骨软骨缺损的修复情况,探讨构建组织工程化软骨的最佳可行性方案.[方法]本研究分别采用体外单体培养、分体培养、生物反应器内分体培养体内构建三种方式构建骨软骨复合体,模仿马赛克移植术植入比格犬膝关节骨软骨缺损处,通过大体观察、组织学分析观察其修复情况.[结果]术后3个月,3种方式构建的骨软骨复合体均不同程度修复了犬关节软骨缺损,采用生物反应器内分体培养体内构建方式修复骨软骨缺损效果优于前两种方式.[结论]灌注型生物反应器使软骨和成骨细胞在三维载体内存活并增殖,提高细胞在载体内的复合效率,软骨修复情况优于前两种方法.     

骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的研究以多聚乙醇酸(PGA)为支架的骨髓基质干细胞(BMSCs)复合物修复兔膝关节软骨缺损的情况。方法体外培养扩增的自体BMSCs种植于PGA支架并培养72h,然后将支架-细胞复合物植入兔关节软骨缺损模型。术后12周处死动物,标本行大体观察、组织学检查及Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果BMSCs-PGA复合物植入后形成丰富的透明软骨样修复组织,新生软骨无明显退变。对照组主要为纤维组织及软骨下骨修复。结论BMSCs-PGA复合物可修复关节软骨缺损。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的:探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据.方法:抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[转化生长因子(TGF-β2)10ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C 50μmol/L],经7、14、21 d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.将诱导细胞与软骨支架材料--聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPP/PLLA)复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况.结果:诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21 d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀.诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长.结论:体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞.     

组织工程骨软骨复合体修复犬膝关节负重区骨软骨缺损的实验研究

目的 观察以骨软骨支架复合骨髓基质干细胞(bone-fflarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)修复犬膝关节负重区骨软骨缺损的疗效.方法 利用软骨细胞外基质作为软骨支架部分,以脱细胞骨作为骨支架部分,采用相分离技术制备骨软骨双相支架,将成软骨诱导的BMSCs种植到双相支架上构建组织工程骨软骨复合体,并以此复合体修复犬膝关节股骨髁负重区骨软骨缺损,分为细胞-双相支架组(实验组)和单纯支架组(对照组).分别在术后3和6个月时取材,根据大体、组织学、Micro-CT等检测结果进行半定量或定量评估.结果 大体及组织学评价表明:同一时间点实验组的修复效果优于对照组,且实验组在术后6个月时的修复效果优于其术后3个月时,两项差异均有统计学意义;而对照组小同时间点修复效果的差异无统计学意义.Micro-CT检测结果表明实验组与对照组软骨下骨均得到重建,两者的差异尤统计学意义.结论 骨软骨双相支架复合成软骨诱导的BMSCs能成功修复犬膝关节负重区的骨软骨缺损,其修复效果明显优于单纯支架植入组.     

聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸软骨支架复合自体骨髓间充质干细胞构建组织工程化人工关节软骨

目的：应用组织工程学技术,体外初步构建组织工程化人工关节软骨。方法：制备三维多孔软骨支架材料CPP／PLLA,体外诱导兔MSCs向软骨细胞表型分化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,将诱导细胞与软骨支架材料CPP／PLLA复合,体外培养构建人工关节软骨,1周后终止培养,扫描电镜观察组织工程化人工软骨的微观结构;同时将构建人工软骨移植于兔大腿皮下,3周后处死动物,甲苯胺蓝染色观察。结果：扫描电镜观察可见该复合材料CPP／PLLA为高孔隙率的网状、连通、微孔结构,微孔分布均匀,孔径大小为300～400μm之间;兔MSCs经体外软骨表型定向诱导后,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。诱导后的MSCs可在支架材料内良好贴附生长,细胞被分泌的胶原基质包裹;从体内获取的培养物组织切片观察可见大量的软骨细胞生成,甲苯胺蓝染色阳性。结论：经软骨起源诱导后的MSCs与CPP／PLLA复合培养可以构建自体软骨移植的替代物,为应用软骨组织工程方法修复关节软骨缺损和功能重建提供一种新材料,具有较大的潜在应用价值。     

骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶修复大面积关节软骨缺损

目的 :用自体骨髓间充质干细胞 (MSCs)复合纤维蛋白修复关节软骨缺损。方法 :抽取兔自体骨髓并分离和培养MSCs ,扩增足够数量后与同种异体纤维蛋白复合在一起 ,植入股骨关节面上 5mm× 10mm的骨软骨缺损区 ,对侧缺损区只植入单纯纤维蛋白或留作空白对照。结果 :术后 12周时 ,植入复合物的缺损区再生出典型的透明软骨样结构 ,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原基因表达检测均为阳性。对侧缺损区表面仅为纤维组织。结论 :自体骨髓间充质干细胞与纤维蛋白复合物可用于修复关节软骨缺损 ,但长远期疗效尚需做进一步研究。     

聚磷酸钙纤维和左旋聚乳酸软骨支架复合自体骨髓间充质干细胞构建组织工程化人工关节软骨

目的应用组织工程学技术，体外初步构建组织工程化人工关节软骨。方法制备三维多孔软骨支架材料CPP／PLLA，体外诱导兔MSCs向软骨细胞表型分化，免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达，将诱导细胞与软骨支架材料CPP／PLLA复合，体外培养构建人工关节软骨，1周后终止培养，扫描电镜观察组织工程化人工软骨的微观结构；同时将构建人工软骨移植于兔大腿皮下，3周后处死动物，甲苯胺蓝染色观察。结果扫描电镜观察可见该复合材料CPP／PLLA为高孔隙率的网状、连通、微孔结构，微孔分布均匀，孔径大小为300～400Ⅳn之间；兔MSCs经体外软骨表型定向诱导后，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。诱导后的MSCs可在支架材料内良好贴附生长，细胞被分泌的胶原基质包裹；从体内获取的培养物组织切片观察可见大量的软骨细胞生成，甲苯胺蓝染色阳性。结论经软骨起源诱导后的MSCs与CPP／PLLA复合培养可以构建自体软骨移植的替代物，为应用软骨组织工程方法修复关节软骨缺损和功能重建提供一种新材料，具有较大的潜在应用价值。     

体内构建骨软骨复合体修复骨软骨缺损的实验研究

[目的]探讨软骨组织工程方法修复骨软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。[方法]体外诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞定向分化，分别与PLGA支架复合培养，并模仿马赛克骨软骨移植术在犬关节骨软骨缺损深层置入MSC-支架复合体，浅层置入诱导培养后的MSC-支架复合体，紧密压配，体内构建骨软骨复合体，观察其修复的情况。[结果]16周实验组缺损区完全由透明软骨修复，与周围正常软骨完全融合，组织观察显示以软骨细胞修复为主，软骨下骨形成，潮线基本恢复；阴性对照组缺损区主要由纤维组织修复，部分由透明软骨修复，组织观察显示以纤维细胞修复为主，混有部分软骨细胞；空白对照组完全由纤维组织修复。[结论]MSCs经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料，通过紧密压配方式与MSCs-PLGA支架在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。