优化酶消化法体外培养及鉴定SD大鼠的成骨细胞

背景:体外成骨细胞的培养技术已经有了很大的发展.但是,在培养过程中,如果胰蛋白酶的消化时间过长,成骨细胞膜便易受到损伤;同时,传统的培养方法存在所获得的成骨细胞数量少、纯度不高等不足.因此,有必要探求一种新的体外培养成骨细胞的方法.目的:优化成骨细胞在体外条件下的培养方法并对其进行鉴定.设计:观察性实验.单位:暨南大学附属第一医院骨科.材料:实验于2007-03/05在暨南大学附属第一医院骨科完成.选用出生24h的SD大鼠8只,由南方医科大学实验动物中心提供,雌雄不拘.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验用Ⅱ型胶原酶由美国Sigma公司分装,胰蛋白酶为Sigma公司产品,碱性磷酸酶试剂盒由南京建成生物制品公司生产,SABC-1021试剂盒由武汉博士德公司进口分装.方法:挑选24h之内的新生SD乳鼠麻醉后处死,无菌条件下取出颅骨,剔除附着的结缔组织及骨膜,D-Hank's液冲洗3次.不强调对颅骨内、外膜,骨缝连接处等附着的结缔组织及颅顶的透明软骨结节等进行反复多次的剔除,避免操作时间过长影响细胞的存活率.结合0.1%Ⅱ型胶原酶来消化SD乳鼠颅骨,减少并严格控制胰蛋白酶的消化时间.组织块经0.25%胰蛋白酶消化20 min,继以0.1%Ⅱ型胶原酶消化60 min,收集上清离心,所得成骨细胞接种于培养瓶中并行"多次贴壁法"纯化.主要观察指标:应用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、扫描电子显微镜观察成骨细胞形态特点.采用碱件磷酸酶Gomori钙钴法染色、钙结节茜素红法染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色方法进行鉴定成骨细胞生物学特性.结果:原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,细胞呈多角形或梭形,具有多个突起可互相连接,细胞核较幼稚,细胞器丰富,具有典型的成骨细胞形态特征.体外培养的成骨细胞可分泌碱性磷酸酶,改良钙钴法染色阳性率可达90%,并可形成钙结节,Ⅰ型胶原染色阳性,具有成骨细胞的生物学功能.结论:实验用优化后的酶消化法分离、培养的SD大鼠成骨细胞具有典型的成骨细胞生物学特征.     

纳米壳聚糖-胶原纤维支架的生物相容性

背景:新型仿生纳米壳聚糖-胶原支架在纳米水平上与细胞外基质结构相似,其是否可促进骨髓间充质干细胞的黏附及生长,并显示良好的相容性?目的:评价新型纳米壳聚糖-胶原支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性.设计:单一样本观察.单位:暨南大学附属第一医院骨科.材料:实验于2007-03/2007-07在暨南大学附属第一医院实验中心完成.选取10只4周龄雌性SD大鼠,SPF级,体质量200 g,由广东省实验动物中心提供(许可证号为SCXK(粤)2003-0002).实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.纳米壳聚糖-胶原纤维支架由理工学院生物材料研究室提供.方法:①分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测.②聚电解质共凝聚技术制作纳米壳聚糖-胶原纤维支架.③取生长良好的P3代,与纳米壳聚糖-胶原纤维支架体外联合诱导培养,以单纯纳米壳聚糖支架材料为对照,通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力及周期、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性. 主要观察指标:①骨髓间充质干细胞分离培养后进行流式细胞表面抗原标志鉴定.②纳米材料及细胞复合2,4,8 d后扫描电镜观察细胞与材料相容情况.③细胞对材料黏附率的测定.④细胞与材料复合5 d检测细胞周期及活力.结果:①细胞表面抗原标志检测结果:CD29表达为90.86%,CD106表达为73.38%,CD44表达为82.61%,CD34表达为0.76%,CD45表达为0.60%.②细胞与材料相容情况:扫描电镜可见纳米壳聚糖-胶原纤维支架为多孔的三维立体结构,材料内部形成大小不一的大孔和互连的小孔,彼此相互交通.应用质量法测得的孔隙率为85%～90%,孔径为50～300 μm,平均150 μm.骨髓基质干细胞复合到纳米壳聚糖-胶原纤维支架后2 d,细胞呈球形散在分布;4 d后细胞呈梭形,延展爬行且有伪足与材料表面锚靠;8 d时细胞增殖,相互间融合,并有大量的细胞外基质分泌,大部分材料颗粒被覆盖.③细胞对材料黏附率:细胞-支架复合物共培养2及6 h,骨髓基质干细胞在纳米壳聚糖-胶原纤维支架的黏附率均高于单纯纳米壳聚糖支架.④纳米壳聚糖-胶原纤维支架与单纯纳米壳聚糖支架的细胞、细胞周期特点比较:纳米壳聚糖-胶原纤维支架细胞活力为96.67%,细胞周期G0-G1为90.81%,G2-M为0.52%,S为8.66%,G2/G1为1.81.单纯纳米壳聚糖支架细胞活力为95.27%,细胞周期G0-G1为87.14%,G2-M为9.69%,S为4.16%,G2/G1为1.80.结论:纳米壳聚糖-胶原支架与骨髓基质干细胞有良好的组织相容性,可用来做组织工程生物材料.     

改进 Blair 术治疗终末期踝关节炎的临床观察

目的 探讨运用改进Blair术治疗终末期踝关节炎临床疗效.方法 2009 年11月-2012年6月,采用改进Blair术治疗28例保守治疗无效的终末期踝关节炎患者.男13例,女15例;年龄23～67 岁,平均49.4岁.11例有明显足内翻畸形,17例外观大致正常.主要临床症状为踝关节肿胀、疼痛,活动受限.采用美国足踝外科协会（AOFAS）踝与后足评分及视觉模拟评分（VAS）评价术前及术后1年随访时足踝关节功能.结果 28例患者均获得随访,随访时间为1～2年,平均19.8个月.术后出现3例切口浅表感染,经清创后愈合.其余患者切口均Ⅰ期愈合,无早期并发症发生.术后1年随访时踝关节均融合,患者关节疼痛完全缓解,无内固定失败、畸形愈合等并发症发生.AOFAS评分平均为（83.13±3.76）分,与术前（45.38±3.21）分比较,差异有统计学意义（P＜0.01）;VAS评分平均为（2.31±1.05）分,与术前（8.01±0.63）分比较,差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 运用改进Blair术治疗终末期踝关节炎,手术操作简便,经济,固定强度可靠,可明显缓解疼痛.     

清水鼻饲对脑损伤合并高钠血症的疗效分析

41例重型颅脑外伤及脑卒中合并高钠血症患者,治疗组11例,男9例,女2例,年龄9-65岁,平均47岁;对照组30例,男22例,女8例,年龄14-76岁,平均45岁。昏迷程度评分低于8分,血钠超过148 mmol/L。     

大收肌肌腱转移重建内侧髌股韧带治疗青少年髌骨脱位

目的 探讨自体大收肌肌腱转移重建内侧髌股韧带治疗青少年髌骨脱位的疗效.方法 回顾性分析2008年1月至2010年11月收治的12例青少年髌骨脱位患者资料,男5例,女7例;年龄11～ 17岁,平均14.3岁.10例为复发性脱位,髌骨脱位次数为2～5次,平均3.2次;2例为初次脱位.12例患者均采用自体大收肌肌腱转移重建内侧髌股韧带.结果 12例患者术后获12 ～42个月(平均24.2个月)随访.所有患者术后切口均一期愈合,髌骨运行轨迹正常,3～6个月内膝关节屈曲O～135°,恐惧试验阴性.所有患者未发生再脱位,膝关节无疼痛,无严重并发症发生.末次随访时Lysholm评分由术前平均52分提高至术后94分.髌股外侧角由原来的向内侧开口转变为向外侧开口.结论 自体大收肌肌腱转移重建内侧髌股韧带能提供髌骨静态稳定的张力,且不损伤骨骺,避免了使用永久性内置物,是治疗青少年髌骨脱位的一种较好选择.     

Reiter综合征误诊为强直性脊柱炎一例

目的 探讨Reiter综合征的临床特征,并提出防范误诊的措施.方法 对我院1例Reiter综合征的诊治经过进行回顾分析.结果 本例为男性患者,以腰骶部疼痛伴关节肿痛入院.查血红细胞沉降率60 mm/h,C-反应蛋白110 mg/L,组织相溶抗原阳性,类风湿因子(RF)、抗链球菌溶血素O(ASO)均阴性.摄X线骨片示双侧骶髂关节增宽,关节面模糊,符合骶髂关节炎表现；摄跟骨侧位片示跟骨、跟腱附着处侵蚀性改变；摄腰椎正侧位片未见明显异常.按强直性脊柱炎予吲哚美辛治疗后症状无缓解.追问病史,患者近期有尿路感染和眼部感染史,确诊为Reiter综合征,予小剂量泼尼松及柳氮磺胺嘧啶治疗后症状及局部体征均好转.随访3个月,症状完全消失.结论 Reiter综合征临床少见,表现具有多样性,易误诊,提示临床接诊关节炎及腰骶部疼痛者,应警惕本病的可能,及时完善相关检查.     

股骨近端Z形短缩截骨全髋置换术治疗成人CroweⅣ型发育性髋关节脱位

目的 探讨股骨近端Z形短缩截骨全髋置换术治疗CroweⅣ型成人髋关节发育不良的手术方法和临床疗效.方法 2000年7月至2006年2月,对13例CroweⅣ型成人发育性髋关节脱位继发骨关节炎患者行全髋关节置换术,同时采用股骨近端Z形短缩截骨.回顾性分析13例患者的临床资料,其中左髋9例,右髋4例.术前Harris评分36.9分.结果 所有患者均获得随访,随访时间4～55个月,平均32个月.Harris评分术后增加至84.1分.患者均能自行下地行走,步态明显改善,髋关节功能良好.结论 股骨近端Z形短缩截骨及全髋关节置换术是治疗Crowe Ⅳ型成人髋关节发育不良继发骨关节炎的有效方法,但手术难度大.其后期疗效有待进一步随访观察.     

两种椎间融合器治疗腰椎滑脱症的早期疗效分析

目的 探讨经椎间孔入路两种融合器腰椎体间融合术(TLIF)的适应证及疗效.方法 24例腰椎滑脱症患者,膨胀型融合器加钉棒内固定15例(A组),入路型融合器加钉棒内固定9例(B组),均行椎间植骨.比较二者的手术时间、失血量、并发症以及手术前后的JOA评分和融合率.结果 24例均获随访,时间4～30(16.6±3.2)个月,两组疗效、JOA评分及融合率差异无统计学意义(P＞0.05).A组手术时间、失血量及并发症明显多于B组(P<0.01),但椎间隙撑开效果好于B组.结论 两组方法均可达到理想的治疗效果,但应根据滑脱类型、程度及患者的临床表现选择适应证.     

通腑疗法预防脑卒中相关性肺炎的临床研究

目的：观察通腑疗法对脑卒中相关性肺炎的预防作用。方法：90例急性脑卒中患者随机分为通腑预防组和对照组;两组均给予常规西医治疗,通腑预防组在此基础上加用通腑疗法治疗,对比两组脑卒中相关性肺炎发生率,分析疗效;对两组治疗前后NIHSS评分、hs-CRP水平进行检测。结果：观察入组第21天对照组卒中相关性肺炎发生率为37.8%,通腑预防组为13.3%,经统计学分析有显著性差异（P=0.000〈0.01）;通腑预防组治疗后神经功能缺损评分（NIHSS评分）明显低于对照组（P=0.000〈0.01）,有显著性差异;通腑预防组治疗后hs-CRP水平明显低于对照组（P=0.002〈0.01）,有显著性差异。结论：急性脑卒中患者及早应用通腑疗法可以降低卒中相关性肺炎的发生率,促进神经功能的恢复,降低致残率,改善机体炎症反应。     

纳米壳聚糖-胶原纤维支架的生物相容性

背景：新型仿生纳米壳聚糖-胶原支架在纳米水平上与细胞外基质结构相似，其是否可促进骨髓间充质干细胞的黏附及生长，并显示良好的相容性？ 目的：评价新型纳米壳聚糖-胶原支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性。 设计：单一样本观察。 单位：暨南大学附属第一医院骨科。 材料：实验于2007-03/2007-07在暨南大学附属第一医院实验中心完成。选取10只4周龄雌性SD大鼠， SPF级，体质量200 g，由广东省实验动物中心提供(许可证号为SCXK(粤)2003-0002)。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。纳米壳聚糖-胶原纤维支架由理工学院生物材料研究室提供。 方法：①分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞，流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测。②聚电解质共凝聚技术制作纳米壳聚糖-胶原纤维支架。③取生长良好的P3代，与纳米壳聚糖-胶原纤维支架体外联合诱导培养，以单纯纳米壳聚糖支架材料为对照，通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力及周期、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞分离培养后进行流式细胞表面抗原标志鉴定。②纳米材料及细胞复合2，4，8 d后扫描电镜观察细胞与材料相容情况。③细胞对材料黏附率的测定。④细胞与材料复合5 d检测细胞周期及活力。 结果：①细胞表面抗原标志检测结果：CD29表达为90.86%，CD106表达为73.38%，CD44表达为82.61%，CD34表达为0.76%，CD45表达为0.60%。②细胞与材料相容情况：扫描电镜可见纳米壳聚糖-胶原纤维支架为多孔的三维立体结构，材料内部形成大小不一的大孔和互连的小孔，彼此相互交通。应用质量法测得的孔隙率为85%~90%，孔径为50~300 μm，平均150 μm。骨髓基质干细胞复合到纳米壳聚糖-胶原纤维支架后2 d，细胞呈球形散在分布；4 d 后细胞呈梭形，延展爬行且有伪足与材料表面锚靠；8 d 时细胞增殖，相互间融合，并有大量的细胞外基质分泌，大部分材料颗粒被覆盖。③细胞对材料黏附率：细胞-支架复合物共培养2及6 h，骨髓基质干细胞在纳米壳聚糖-胶原纤维支架的黏附率均高于单纯纳米壳聚糖支架。④纳米壳聚糖-胶原纤维支架与单纯纳米壳聚糖支架的细胞、细胞周期特点比较：纳米壳聚糖-胶原纤维支架细胞活力为96.67%，细胞周期G0-G1为90.81%，G2-M为0.52%，S为8.66%，G2/G1为1.81。单纯纳米壳聚糖支架细胞活力为95.27%，细胞周期G0-G1为87.14%，G2-M为9.69%，S为4.16%，G2/G1为1.80。 结论：纳米壳聚糖-胶原支架与骨髓基质干细胞有良好的组织相容性，可用来做组织工程生物材料。