大鼠骨髓和外周血早晚期内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：旨在从大鼠外周血及骨髓中提取内皮祖细胞,培养晚期内皮祖细胞,为干细胞移植治疗或通过内皮祖细胞联合基因治疗使内皮祖细胞高表达血管新生诱导因子,达到促进缺血性脑血管病血管新生的目的。目的：从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞并对其进行鉴定。方法：使用密度梯度离心及贴壁筛选法从大鼠骨髓和外周血中分离获得单个核细胞,进行诱导培养,观察并记录贴壁细胞的生物学特征;选取内皮祖细胞特异性表面标志CDl33、CD34、KDR对原代细胞进行免疫荧光检测,利用流式细胞学技术检测KDR、CD34表达,并通过吞噬功能实验进～步鉴定培养细胞。结果与结论：大鼠骨髓和外周血能够分离获得早晚期内皮祖细胞;贴壁细胞免疫荧光检测CD34、CDl33、KDR表达阳性;流式细胞学检测CD34、KDR表达阳性;贴壁细胞能够吞噬ac—LDL,结合UEA-1。实验成功从大鼠骨髓及外周血中分离出内皮祖细胞;并获得了增殖活性强的晚期内皮祖细胞,找到了更好的成血管干细胞的种子来源。     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CDl33、CD34、FIk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

正常成人粒细胞集落刺激因子动员外周血内皮祖细胞的生物学特性

背景：内皮祖细胞具有很好的临床应用前景,特别是作为种子细胞参与组织工程血管构建及疾病治疗。目的：观察粒细胞集落刺激因子动员的外周血中内皮祖细胞的生物学特性。方法：获取粒细胞集落刺激因子动员正常人的外周血单个核细胞,同时获取8例正常成人外周血单个核细胞作为对照。将获取的细胞接种在预铺纤维连接蛋白的培养皿中进行体外培养。FACS和免疫组化法检测获取细胞的免疫表型;采用MTT比色法和黏附能力测定实验检测内皮祖细胞的增殖和黏附能力;实时定量PCR检测血管形成相关细胞因子的表达;荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）吞噬实验鉴定内皮功能;将获取的细胞接种在含有血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的基底膜胶中诱导血管生成。结果与结论：动员后外周血和未动员外周血内皮祖细胞具有相似的细胞形态和免疫表型,FACS和免疫组化检测结果显示上述两种内皮祖细胞都表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、FLK-1、ve-Cadherin、vWF和CD133。内皮细胞生长因子和基质细胞衍生因子1在动员后外周血内皮祖细胞中的表达水平增加;两种来源的内皮祖细胞都具有吞噬Dil-acLDL和在体外诱导血管生成的能力。但是,动员的外周血中内皮祖细胞的数量和增殖能力明显强于未动员外周血中的内皮祖细胞。结果可见动员后的外周血中可以分离出具有内皮祖细胞特性的细胞群体,该群体具有体外诱导血管生成的能力;与未动员的外周血内皮祖细胞相比,动员后外周血内皮祖细胞数量明显增加并具有更好的增殖能力。     

人外周血内皮祖细胞的诱导、分化与鉴定

目的:研究人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为自体外周血内皮祖细胞移植、促进血管新生提供一条治疗新途径。方法:采集健康志愿者外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中培养和扩增,培养第7天,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达,流式细胞仪检测其阳性率。结果:人外周血单个核细胞经体外诱导分化,表达内皮祖细胞的表面标志KDR、CD133和CD34,流式细胞仪检测其阳性率分别为75%、21%和69%。结论:外周血来源的单个核细胞能在一定的培养条件下分化为内皮祖细胞。     

外周血内皮祖细胞移植对肢体缺血的改善作用

背景:内皮祖细胞移植为肢体缺血的治疗提供了新的选择。目的:研究人外周血来源内皮祖细胞移植对改善肢体缺血的作用。方法:采用Ficoll密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞,体外诱导扩增6d后,检测其内皮祖细胞特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果。结果与结论:从人外周血单个核细胞诱导出的贴壁细胞可表达内皮祖细胞特异性标志物CD133、CD34和血管内皮生长因子受体2,说明从人外周血单个核细胞中可诱导出内皮祖细胞。移植内皮祖细胞后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均明显改善(P<0.05);在缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色荧光标记的内皮祖细胞的掺入。表明移植的内皮祖细胞可以定向整合到缺血局部,改善裸鼠的后肢缺血。     

人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定

背景:传统免疫磁珠法分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用大,细胞获得率较低,且内皮祖细胞的增生及分化受限.目的:尝试改良人脐带血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为实现内皮祖细胞移植、改善血管功能提供足量细胞来源.方法:采用密度梯度离心方法获得人带血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,通过免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源的内皮祖细胞进行鉴定.结果与结论:脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;在细胞培养至第7天,免疫组织化学显示:CD31、vWF在体外培养过程中的表达阳性;免疫荧光染色表明:(83.0±4.3)%的贴壁细胞双染呈阳性,并且DiI-acLDL标记的内皮祖细胞红色荧光在体外可以持续6周以上;第7天贴壁细胞流式细胞仪分析显示:CD34、CD133和KDR分别为(17.8±3.7)%、(22.1±4.4)%、(81.5±5.0)%.结果提示,实验成功从脐带血单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞,在其体外可扩增并向为内皮细胞方向分化.     

巴曲酶可影响人外周血内皮祖细胞定向分化及增殖能力

背景：近年来内皮祖细胞促进机体血管新生方面的重要作用已形成共识,但内皮祖细胞的定向分化和扩增的问题是影响其疗效和广泛开展的主要原因。目的：观察人外周血内皮祖细胞体外分离、纯化、扩增和诱导分化为内皮细胞的可行性。方法：用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,接种于包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板中,培养6d后,收集贴壁细胞。以血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对贴壁细胞进行诱导培养。另外,分别以0.05,0.1,0.2BU/mL巴曲酶培养贴壁细胞,观察内皮祖细胞的增殖能力。结果与结论：经血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,说明诱导后的细胞为内皮细胞。巴曲酶在体外培养条件下可增加血内皮祖细胞的数量,以0.1BU/mL浓度作用显著,且作用时间与血内皮祖细胞增殖能力的改善呈正相关。     

人脐血中CD133^＋血管内皮祖细胞的分离培养和生物学特性

目的:观察免疫磁珠法分离得到的CD133 血管内皮祖细胞的细胞表面标记及生物学特性。方法:实验于2002-11/2003-08在解放军第四军医大学西京医院烧伤外科实验室完成。①选取正常顺产或剖腹产人胎盘(解放军第四军医大学西京医院妇产科提供,产妇均知情同意)作为CD133 血管内皮祖细胞的标本来源。②人胎盘脐血ACD-B抗凝,稀释后取7mL脐血缓慢加入淋巴细胞分离液3mL,2100r/min离心30min,取棕黄色层低密度单个核细胞,洗涤去血小板。免疫磁珠与FITC-CD133单抗室温孵育30min,洗去多余单抗,将包被FITC-CD133的免疫磁珠加入到单个核细胞中,室温孵育30min,置于磁场中1min,吸弃细胞悬液,加入磁珠-细胞分离液从免疫磁珠上释放出CD133 血管内皮祖细胞。加入EGM-2MV培养基,接种于包被I型胶原的培养瓶中,24h换液除去未贴壁细胞,3d后半量换液,培养3～4周。③观察CD133 血管内皮细胞经免疫磁珠分离后的形态变化;采用流式细胞仪分析CD133 血管内皮祖细胞在脐血单个核细胞的比例及免疫磁珠的分离效率;免疫荧光及酶组织化学检测CD133 血管内皮祖细胞体外培养不同时期的表形变化;透射电镜观察成熟血管内皮细胞W-P小体的形成情况。结果:①CD133 血管内皮祖细胞体外培养形态观察:贴壁小细胞团在4～5d可见伪足伸出,7d后呈克隆状迅速生长,2～3周后密集区细胞呈“鹅卵石”样,培养4周融合后的细胞呈梭形。②CD133 血管内皮祖细胞分离率检测结果:CD133 血管内皮祖细胞在脐血单个核细胞中的比例为0.91%,经免疫磁珠分离后比例为85.52%。③CD133 血管内皮祖细胞体外培养不同时期的免疫表形变化:培养第5天极少数细胞CD133染色阳性,大部分细胞CD34及vWF染色阳性;第10天所有细胞CD133染色均呈阴性,大部分细胞CD34、vWF染色呈阳性。④成熟血管内皮细胞W-P小体的形成情况:透射电镜下培养第10天可见成熟血管内皮细胞所特有的W-P小体。结论:采用免疫磁珠法可以有效地从人脐血中分离纯化CD133 血管内皮祖细胞,不同培养时期通过CD133,CD34,vWF单抗以及透射电镜进行鉴定,证明其具有分化为成熟血管内皮细胞的能力。     

利用自体血清培养人外周血内皮祖细胞

背景:传统方法培养人外周血来源内皮祖细胞操作复杂,费用大,细胞获得率较低。目的:利用自体血清培养人外周血来源内皮祖细胞,并鉴定其功能。方法:采用密度梯度离心法从人外周血分离得到单个核细胞,体外培养分化为内皮祖细胞。按培养基条件不同分为EGM-2MV组、添加自体血清组(M199+体积分数10%自体血清+胰岛素样生长因子)、添加胎牛血清组(M199+体积分数10%胎牛血清+血管内皮细胞生长因子+碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子+表皮生长因子)。观察内皮祖细胞增殖、迁移能力;采用细胞形态观察、双荧光染色法及流式细胞仪等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定。结果与结论:培养第7天,EBM-2MV组和添加自体血清组细胞增殖能力和迁移率都优于添加胎牛血清组(P<0.05)。每组细胞经结合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素双色荧光染色鉴定后双阳性率>80%,免疫细胞化学检测显示每组细胞CD133,CD34和KDR的表达均为阳性。证实在M199培养液中添加自体血清是一种简单、高效的培养内皮祖细胞方法。     

人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞及其生物相容性

背景：内皮集落形成细胞是内皮祖细胞的一种亚型,体外培养扩增及其在组织工程中的应用尚不明确。目的：探索从人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞并观察其生物相容性。方法：采用密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,接种于Ⅰ型鼠尾胶原包被的培养板上,采用内皮祖细胞专用EGM-2培养基诱导培养,早期传代后扩增,免疫荧光鉴定细胞,并检测其体外成血管和增殖能力,与纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料复合培养后的生物相容性。结果与结论：脐血来源内皮集落形成细胞呈铺路石样集落生长,吞噬Dil-Ac-LDL并结合FITC-UEA-1,表达CD31,vWF,KDR和Tie-2,早期传代后拥有较强增殖潜能,可在体外大量扩增,在体外基质胶上可形成闭合管腔样结构,复合纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料后生物学特性不受影响。提示可从脐血中分离并体外大量扩增内皮集落形成细胞。     

人外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

背景：内皮祖细胞是成熟内皮细胞的前体细胞,具有新生血管和新生内皮化作用,在许多方面均有广泛应用前景,但其生物学特征及鉴定方法仍存争议。目的：探索从人外周血分离培养内皮祖细胞的方法并鉴定其生物学特征。方法：外周采血后应用密度梯度离心法分离成人外周血单核细胞,在内皮细胞全培养基重悬后接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中,体外培养扩增获取人内皮祖细胞并观察其形态变化、生长增殖潜能及细胞表面抗原表达情况,并通过细胞一氧化氮分泌功能测定及体外血管形成实验检测其功能学特征。结果与结论：体外诱导培养后,六七天形成纺锤样细胞簇,两三周黏附细胞发育形成鹅卵石样外观细胞,逐渐融合呈外生性生长。在相同培养条件下,与人主动脉内皮细胞相比人内皮祖细胞具有高的增殖潜能。人内皮祖细胞表达CD31、CD34、CD144、KDR,表现为典型内皮细胞系表型,此外细胞可摄取ac-LDL并结合UEA-I。在功能上内皮祖细胞可分泌一氧化氮并可在Matrigel中形成管腔样结构。提示通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞体外黏附诱导培养可获取人外周血内皮祖细胞;细胞形态、增殖能力、生物表型特征结合细胞功能学的综合性鉴定方法用于内皮祖细胞的鉴定具有一定意义。     

巴曲酶可影响人外周血内皮祖细胞定向分化及增殖能力

背景:近年来内皮祖细胞促进机体血管新生方面的重要作用已形成共识,但内皮祖细胞的定向分化和扩增的问题是影响其疗效和广泛开展的主要原因。目的:观察人外周血内皮祖细胞体外分离、纯化、扩增和诱导分化为内皮细胞的可行性。方法:用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,接种于包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板中,培养6d后,收集贴壁细胞。以血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对贴壁细胞进行诱导培养。另外,分别以0.05,0.1,0.2BU/mL巴曲酶培养贴壁细胞,观察内皮祖细胞的增殖能力。结果与结论:经血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,说明诱导后的细胞为内皮细胞。巴曲酶在体外培养条件下可增加血内皮祖细胞的数量,以0.1BU/mL浓度作用显著,且作用时间与血内皮祖细胞增殖能力的改善呈正相关。     

脐血来源的两种内皮祖细胞的分离、培养和鉴定

为了建立从人脐血分离培养两种内皮祖细胞的方法和培养体系，从脐血分离单个核细胞，在含有内皮细胞条件培养液的体系中培养得到两种细胞，利用摄取乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac—LDL）和结合欧洲荆豆凝集素（Ulex European Agglutinin 1，UEA—1）进行鉴定，并进一步用免疫细胞化学、RT-PCR、流式细胞术对它们进行内皮细胞相关的表型检测。结果表明，这两种细胞均能摄取DiI-Ac-LDL和结合UEA—1，表达内皮细胞的标志如CD31、CD144和血管假性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF），有CD31、酪氨酸激酶受体（kinase tyrosine insert domain receptor，KDR）、CD144和内皮一氧化氮合成酶（endothelial NO synthase。ENOS）的基因转录。但是，它们的增殖能力明显不同，分别称为循环成血管细胞和高增殖潜能内皮祖细胞。流式细胞计数结果显示，这两种细胞在一些表面标志表达方面也存在明显的差异。结论：利用含内皮细胞条件培养液的培养体系，成功地从脐血分离的单个核细胞中培养得到了两种内皮祖细胞。     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景：成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系。目的：建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法。方法：应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3d后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT法和细胞计数测定第1,3代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定。结果与结论：细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第6天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2。证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离培养及鉴定

背景:骨髓间充质干细胞的分离和培养扩增至今缺乏统一的方法.内皮祖细胞可以由外周血或骨髓中的单个核细胞诱导分化而成,但因获取骨髓单个核细胞的方法各异,分离效果亦有较大差异.目的:拟在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,并对其进行鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-10/2009-02在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成.材料:清洁级健康雄性SD大鼠2只,由安徽省动物中心提供.方法:抽取大鼠骨髓,通过密度梯度离心法提取单个核细胞,采用差速贴壁法分离骨髓间充质干细胞.原代骨髓间充质干细胞培养48h后,收集未贴壁细胞,加入含胎牛血清、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、重组人上皮生长因子的EGM-2完全培养液诱导骨髓间充质干细胞向内皮祖细胞分化.设立3组:分别为早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞、2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞、大鼠成熟主动脉内皮细胞,采用硝酸还原酶法间接测量细胞培养液中一氧化氮的含量.主要观察指标:骨髓间充质干细胞与内皮祖细胞体外培养情况,细胞培养液中一氧化氮的含量.结果:原代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,24 h内大部分细胞贴壁,9～10 d可达90%融合,纯化扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭性,传代周期为8 d左右,流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞C034,CD45呈阴性,CD105呈阳性.2次贴壁的内皮祖细胞培养3 d内贴壁,6 d形成集落,8～10 d出现条索状结构,呈微血管样生长,2周时大部分细胞呈多角形,细胞集落相互连接,呈典型的"铺路石"样,7～10 d细胞Dil-acLDL、FITC-UEA-1双染呈阳性,流式细胞仪检测Flk-1,CD133阳性.2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞培养液中一氧化氮含量明显高于早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞(P<0.05),但低于大鼠成熟主动脉内皮细胞(P<0.05).结论:差速贴壁法能有效地分离、纯化、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,加入多种细胞生长因子诱导后具有较强地向内皮细胞方向分化的能力,且2次贴壁细胞已具有部分内皮细胞的功能.     

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定

目的:目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取,但其分离培养方法尚不成熟,外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用,但得到的内皮祖细胞纯度较低.实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法.方法:实验于2006-08/2007-08 在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成.①实验材料:2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供,雌雄不拘,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133, 采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达.结果:①培养4 d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长.培养7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观.2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈"微血管样"排列生长.②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性,RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达.结论:采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增.     

小径聚氨酯人工血管内皮化种子细胞的体外诱导分化及种植实验

背景：目前，小径人工血管移植后由于缺乏内皮细胞衬里和抗血栓特性，长期通畅率低。有研究尝试用成熟内皮细胞种植人工血管以增强其抗血栓能力，以提高长期通畅率，但由于种子细胞和支架材料存在的缺陷，其效果并不令人满意。因此，临床上亟需寻找合适的种子细胞及血管支架材料，改善小径人工血管移植长期通畅率低这一现状。 目的：探讨体外诱导骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞的可行性，并种植聚氨酯小径人工血管表面。为小径聚氨酯人工血管内皮化提供合适的种子细胞。 设计：观察性实验。 单位：中山大学附属第一医院心血管医学部，免疫学教研室。 材料：实验于2004-09／2005-05在中山大学附属第一医院完成。健康志愿者成人骨髓（n=7）约10mL。 方法：收集健康成人骨髓单个核细胞．置于纤维连接蛋白预衬的DMEM培养基中．用血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子加以诱导，通过荧光显微镜和免疫组化分析等方法观察和鉴定诱导后的细胞。将诱导分化的内皮祖细胞种植到聚氨酯小径人工血管表面，用扫描电镜观察。 主要观察指标：①细胞形态学变化。②免疫组化VWF和CD34抗体染色结果。③聚氨醣小径人工血管表面内皮祖细胞的黏附生长状态。结果：①在血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等诱导因子存在的条件下，骨髓单个核细胞分化成为内皮祖细胞，倒置荧光显微镜下呈典形的“纺锤样”梭形细胞，单层细胞贴壁生长融合时呈铺路石样排列。②免疫组化示VWT和CD34抗体染色阳性。②扫描电镜下，未种植细胞的聚氨酯小径人工血管表面呈典型的多孔蜂窝状结构，孔径大小比较适合内皮祖细胞爬行。种植细胞后．聚氨酯小径人工血管表面有大量的内皮祖细胞黏附、爬行及铺展生长，有时可见内皮祖细胞长入蜂窝状孔径内。 结论：在体外能将骨髓单个核细胞诱导分化成为内皮祖细胞，而诱导分化的内皮祖细胞在小径聚氨酯人工血管上黏附生长状态良好,提示体外诱导骨髓单个核细胞分化为内皮祖细胞可作为小径聚氨酯人工血管内皮化的种子细胞。     

人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞及其生物相容性

背景:内皮集落形成细胞是内皮祖细胞的一种亚型,体外培养扩增及其在组织工程中的应用尚不明确。目的:探索从人脐血中分离培养扩增内皮集落形成细胞并观察其生物相容性。方法:采用密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,接种于Ⅰ型鼠尾胶原包被的培养板上,采用内皮祖细胞专用EGM-2培养基诱导培养,早期传代后扩增,免疫荧光鉴定细胞,并检测其体外成血管和增殖能力,与纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料复合培养后的生物相容性。结果与结论:脐血来源内皮集落形成细胞呈铺路石样集落生长,吞噬Dil-Ac-LDL并结合FITC-UEA-1,表达CD31,vWF,KDR和Tie-2,早期传代后拥有较强增殖潜能,可在体外大量扩增,在体外基质胶上可形成闭合管腔样结构,复合纳米羟基磷灰石/磷酸三钙材料后生物学特性不受影响。提示可从脐血中分离并体外大量扩增内皮集落形成细胞。     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景：目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。目的：分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。方法：密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果与结论：随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示：培养7d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占（77.4±4.9）%、（52.4±6.6）%和（19.4±2.1）%,培养28d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占（81.1±7.4）%和（7.6±3.1）%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞（P〈0.05）,并且细胞数量可扩增达109L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞因其分离与培养的方法各不相同,在实验中难以重复。目的：探讨大量获取骨髓源性内皮祖细胞分离与培养的方法。方法：通过密度梯度离心法从4周龄SD大鼠骨髓中分离单个核细胞,使用EGM-2MV培养基进行诱导培养,采用形态学特征观察、摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC—UEA-1实验、免疫荧光化学鉴定其表面抗原CD133与VEGFR2等方法对其进行鉴定,并通过管腔形成实验观察形成管腔的能力。结果与结论：①形态学观察：分离的骨髓单个核细胞经诱导培养后,在生长的早期（8d左右）、晚期（15d左右）其细胞形态有一定差异,早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见,晚期以圆形、短梭形细胞多见。②摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验：显示8,21d的细胞均为阳性。⑧免疫荧光化学染色：8d的细胞表达CD133、VEGFR2。④管腔形成实验：在Matrigel基质上15h左右能够生成血管样结构。结果表明：利用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞后以EGM-2MV进行诱导培养,经过鉴定证明获得的细胞符合内皮祖细胞的特征。这种方法能够简单、快速、可靠、大量地获取内皮祖细胞。