定向诱导的骨髓基质细胞移植后在大鼠缺血脑组织中的分布

目的探讨人骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，MSCs）源神经细胞体内移植后的分布状况。方法采用密度梯度离心结合贴壁分离法分离、纯化人MSCs。MSCs经bFGF预诱导24h及阿魏酸钠（Sodium Ferulate）诱导24h后用于移植。采用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注动物模型．缺血2h后行再灌注，24h后经栓塞侧颈内动脉注入诱导后的MSCs（5×10^6/0．8ml）（n=61。2w后取脑组织行冰冻切片．通过检测人细胞核特异抗体MAB1281来鉴定移植的人MSCs。结果MSCs经阿魏酸钠诱导后．细胞逐渐圆缩并伸出突触．呈现神经细胞样形态。在移植大鼠脑内可检测到MAB1281呈阳性表达的人MSCs．且MSCs主要分布在缺血侧损伤灶的周围，明显高于对侧同部位及其它脑区。结论人MSCs源神经细胞移植后在大鼠脑内存活并主要聚集在脑内缺血灶的周围。     

稀土化合物氯化镧影响神经干细胞增殖的探讨

目的初步探讨稀土化合物氯化镧（Lanthanum chloride，LaCl3）对体外培养的NSCs增殖状况的影响。方法采用成球悬浮法分离培养小鼠神经干细胞（mNSCs）；将生长状态良好的第3代mNSCs分为空白对照组、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）组、LaCl3组，分别采用常规NSCs培养液、含10ng／ml TNF-α的NSCs培养液、含2.5μmol／L LaCl3的NSCs培养液培养NSCs 1-3天。采用神经球计数、神经球体积测量方法以及采用免疫荧光细胞化学方法检测与细胞增殖相关的指标（CyclinD1）来观察NSCs的增殖状况。结果神经球计数和神经球体积测量结果显示，TNF-α组和LaCl3组神经球数量分别为[（74.56±2.6）个／瓶]和[（62.32±2.8）个／瓶]，较空白对照组[（42.28±3.5）个／瓶]明显增多，P〈0.05；神经球体积分别为[（0.82±0.16）×10^6（μm^3）]和[（0.66±0.12）×10^6（μm^3）]，较对照组[（0.26±0.0.08）×10^6（μm^3）]明显增大，P〈0.05。免疫细胞荧光检测细胞增殖结果显示，TNF-α组和LaCl3组中，Cyclin D1阳性细胞率分别为（68.6±4.2）％和（51.2±2.8）％，明显高于空白对照组的（35.6±2.6）％，P〈0.01。结论一定浓度的Lacl3具有促进NSCs增殖的作用。     

小鼠胚胎干细胞在胎肾微环境中共培养后表达肾标志物

胚胎干（ES）细胞是一种多潜能细胞具有分化成为来自三个胚层各种细胞甚至包括生殖细胞的能力。最新的研究表明，胚胎于细胞在与胚胎脏器细胞共培养后可以定向分化为多种特定细胞表型，他们包括肝细胞、心肌细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞．并在某些情况下甚至可能形成成熟的器官组织结构。已有研究报道说明ES细胞通过在体外环境中直接形成拟胚体（EBs）可以分化成为肾细胞．并且最新的研究成果表明分离自这些EBs的细胞移植入体内后可以形成肾近端小管样结构并且未在其周同发现畸胎瘤形成。但是ES细胞是否可以通过和胎肾细胞相互作用继而获得定向分化并未见诸报道。在实验中我们发现．在与小鼠胎肾细胞共培养后．ES细胞分化成为了肾系细胞。处理后的ES细胞可以检测到与肾发育相关的特征基因．如WT-1、exm-2和Wnt-4基因的表达．我们也发现了终末分化的肾细胞标志物．如podocalyxin、Nephl和RSOR基因的表达。在实验前后，我们同样探寻了ES细胞多分化潜能标记分子的基因表达情况，结果显示共培养后分化的ES细胞Oct-4、Nanog和Klf-4基因表达明显减弱。综上，胎肾细胞微环境可能促使ES细胞定向分化为肾系细胞，提示胚胎器官细胞微环境在ES细胞转分化过程中可能扮演了重要作用。     

脂多糖诱导巨噬细胞产生诱导型一氧化氮合酶的实验研究

目的 观察脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对小鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(in-ducible nitric oxide svnthase,iNOS)的诱导作用.方法 常规方法获取小鼠腹腔巨噬细胞随机分成两组:空白对照组(培养基中不含LPS)及LPS组(分别含LPS 0.01,0.1.1.0,10mg/L的培养基培养24h).采用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)和Western Blotting方法测定诱导型一氧化氮合酶的基因及蛋白表达水平.结果 RT-PCR和Westem Blotting结果表明,经0.1mg/L LPS刺激后细胞iNOS mRNA及蛋白表达水平均明显升高,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05),并且在一定范围内呈剂量--效应关系.结论 LPS可诱导小鼠巨噬细胞产生诱导型一氧化氮合酶.     

人诱导性多能干细胞的培养及鉴定

目的 建立稳定的人诱导性多能干细胞(iPS细胞)培养体系.方法 取第3～5代的小鼠胚胎成纤维细胞,丝裂霉素C处理后用作饲养层.人iPS细胞接种于饲养层上生长,胶原酶消化或机械法传代.倒置显微镜下观察iPS细胞生长状态;观察拟胚体形成能力;RT-PCR检测iPS细胞多能性基因的表达情况.结果 (1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEn为贴壁生长细胞,呈梭形或多角形.细胞增殖旺盛.(2)生长在饲养层上的人iPS细胞呈典型的克隆状生长.克隆呈圆形或椭圆形,边界清晰.克隆内细胞排列紧密,细胞体积小,核大,细胞核,质比高.RT-PCR结果 显示人iPS细胞强表达多能性基因Oct4,Nanog,Sox2;去除饲养层后悬浮培养能形成拟胚体(EB).结论 本实验的培养体系适合人iPS细胞的培养,人iPS细胞能稳定增殖,保持自我更新及分化潜能.     

TNF-α体外诱导rMSC向神经细胞分化的研究

目的 探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.方法 采用密度梯度离心法分离rMSCs,取培养至3～5代的rMSCs以含TNF吨-α5ng/ml的培养基培养,镜下观察细胞诱导后形态的变化,采用免疫荧光细胞化学染色法检测神经前体细胞标志物巢蛋白nestin和神经元特异性烯醇化酶在细胞中的表达强度和分布.结果 rMSCs经TNF-α诱导6h后基本表现为典型神经样细胞形态,nestin和NSE呈阳性表达.结论 TNF-α具有体外诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的作用.     

人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化及相关基因时序表达的影响

背景:大量有关动物的体内外研究表明,骨髓间充质干细胞在心肌微环境或模拟心肌微环境的作用下可分化为心肌细胞.然而,类似的人类研究报道较少,同时相关的分化机制也不甚清楚.目的:探讨人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响及相关基因的时序表达.方法:体外分离培养人类骨髓间充质干细胞,传至第4代加入自体心肌匀浆上清液诱导骨髓间充质干细胞,持续作用2周.相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态变化,免疫荧光方法鉴定心肌特征性肌动蛋白α和肌钙蛋白的表达,应用半定量RT-PCR技术分析Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC、肌钙蛋白等相关基因在分化过程中的动态时序表达.结果与结论:经心肌匀浆上清液诱导后,骨髓间充质干细胞体积变大,立体感增强,形态近似棒状.诱导2周时肌动蛋白α及肌钙蛋白阳性细胞比例分别为25.53%和23.48%.Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C基因在诱导后3 d表达开始增强, 其中GATA-4、MEF-2C诱导后5 d达高峰,以后维持在较高水平,Nkx-2.5则随诱导时间逐渐增强;α-MHC、肌钙蛋白基因诱导前无表达,于诱导第3天出现表达,以后维持在高水平.结果提示,心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞具有定向诱导作用,在此过程中,伴随着Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC和肌钙蛋白基因的时序表达变化.     

内皮细胞缺氧后miR-210、miR-92a、miR-126表达及意义

目的进一步探讨缺氧后血管新生的调控机制。方法常规方法培养人微血管内皮细胞,低氧培养箱制备内皮细胞缺氧模型（观察组）,正常细胞作为对照组。采用real time PCR法检测两组内皮特异性microRNA（miR-210、miR-92a、miR-126）表达变化。结果与对照组比较,miR-210、miR-92a、miR-126分别上调了（5.19±0.99）、（3.02±0.88）、（3.87±0.83）倍,P均〈0.05。结论缺氧可促使内皮细胞特异性microRNA表达改变,此可能为缺氧后血管新生的主要调控机制。     

颅脑损伤后海马区notch信号分子及其相关miRNA的表达变化

目的 观察颅脑损伤后海马区notch1相关微小RNA(miRNA)、notch1及nestin的表达变化,探讨颅脑损伤后神经干细胞增殖机制.方法 采用自由落体法复制闭合性颅脑损伤小鼠模型,于伤后4 h、1 d和3 d处死动物.(1)实时聚合酶链反应(Real-time PCR)检测伤后4 h、1 d和3d伤侧海马区mir-326、mir-34a和notch1 mRNA的表达变化.(2)免疫荧光染色检测伤后3 d伤侧海马齿状回区notch1和nestin蛋白表达变化.结果 (1)颅脑损伤后4 h、1 d和3 d组海马区mir-326和mir-34a表达水平分别为假手术组的(0.36±0.16)、(0.16±0.04)、(0.36±0.17)倍和(0.48±0.15)、(0.50±0.04)、(0.25±0.14)倍,均低于假手术组(P＜0.01);(2)颅脑损伤后4 h、1 d和3 d组海马区notch1 mRNA表达水平分别为假手术组的(1.77±0.17)、(2.55±0.48)和(2.44±0.58)倍,均高于假手术组(P＜0.05);颅脑损伤后3 d组海马齿状回区notch1阳性细胞明显多于假手术组[(18.20±3.56)个比(0.40±0.55)个,P＜0.01].(3)颅脑损伤后3 d组海马齿状回区nestin阳性细胞数明显高于假手术组[(21.80±5.07)个比(0.80±0.45)个,P＜0.01].结论 在颅脑损伤后海马区神经干细胞增殖过程中,mir-326和mir-34a表达明显降低,其靶基因notch1 mRNA和蛋白表达明显升高,提示mir-326和mir-34a可靶向抑制notch信号分子,调控伤后神经干细胞增殖过程.

Abstract：

Objective To observe the expression of notch1-related miRNA, notch1 and nestin,and explore the regulatory mechanism of neural stem cells proliferation in hippocampus of mice after traumatic brain injury (TBI). Methods Mice were suffered closed head injury, and then sacrificed at 4th h,1st day and 3rd day post-injury. Real-time polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the expression levels of mir-326, mir-34a and notch1 mRNA in mice hippocampus at 4th h, 1st day and 3rd day post TBI. Immunofluorescence was conducted to determine protein expression levels of notch1 and nestin in mice hippocampus at 3rd day post TBI. Results ( 1 ) Relative to sham group, the levels of mir-326 and mir-34a at 4th h, 1st day and 3rd day after TBI in the hippocampus were respectively (0. 36 ± 0. 16),(0. 16±0.04), (0.36±0. 17) and (0.48±0. 15), (0.50±0.04), (0.25 ±0. 14) fold (P＜0.01);(2) Relative to sham group, the levels of notch1 mRNA at 4th h, 1st day and 3rd day post TBI injury in the hippocampus were respectively (1.77 ±0. 17), (2.55 ±0.48) and (2.44±0.58) fold (P＜0.05).Notch1 + cells in the DG at 3rd day post TBI were significantly increased compared to sham group ( 18.20± 3.56 vs 0. 40 ±0. 55 ,P ＜0. 01 ); (3) Nestin + cells in the DG at 3rd day post TBI were increased apparently compared to sham group (21.80 ± 5. 07 vs 0.80 ± 0. 45, P ＜ 0. 01 ). Conclusion mir-326 and mir-34a may play a key role in trauma-induced neural stem cells proliferation in hippocampus in vivo by targeting notch1 signaling.     

缺血性脑损伤后MicroRNA 210及其靶基因ephrinA3的表达变化

Mir-210为缺氧特异性微小RNA(microRNA),缺氧环境下表达稳定上调~([1]);且有证据表明内皮细胞中过表达mir-210可下调其靶基因ephrinA3的蛋白表达,进而显著促进内皮细胞形成血管~([2]).我们通过构建大鼠急性脑缺血模型,观察脑缺血后各时间点缺血皮质区mir-210及其靶基因ephrinA3的表达变化,对其在脑缺血后血管新生过程中可能起到的调控作用进行了初步探讨.