人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的:探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。方法:实验于2004-09/2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在含有体积分数为0.1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4μg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增,分别在培养的第6和14天,流式细胞仪检测其KDR,CD133,CD34和vWF阳性率,并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定。结果:①人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6天的贴壁细胞表达KDR,CD133,CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%、(33.8±11.7)%、(73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR,CD34和vWF,不表达CD133,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%、(88.9±5.4)%和(78.3±13.6)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。结论:外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

巴曲酶可影响人外周血内皮祖细胞定向分化及增殖能力

背景:近年来内皮祖细胞促进机体血管新生方面的重要作用已形成共识,但内皮祖细胞的定向分化和扩增的问题是影响其疗效和广泛开展的主要原因。目的:观察人外周血内皮祖细胞体外分离、纯化、扩增和诱导分化为内皮细胞的可行性。方法:用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,接种于包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板中,培养6d后,收集贴壁细胞。以血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对贴壁细胞进行诱导培养。另外,分别以0.05,0.1,0.2BU/mL巴曲酶培养贴壁细胞,观察内皮祖细胞的增殖能力。结果与结论:经血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,说明诱导后的细胞为内皮细胞。巴曲酶在体外培养条件下可增加血内皮祖细胞的数量,以0.1BU/mL浓度作用显著,且作用时间与血内皮祖细胞增殖能力的改善呈正相关。     

人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定

背景:传统免疫磁珠法分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用大,细胞获得率较低,且内皮祖细胞的增生及分化受限.目的:尝试改良人脐带血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为实现内皮祖细胞移植、改善血管功能提供足量细胞来源.方法:采用密度梯度离心方法获得人带血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,通过免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源的内皮祖细胞进行鉴定.结果与结论:脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;在细胞培养至第7天,免疫组织化学显示:CD31、vWF在体外培养过程中的表达阳性;免疫荧光染色表明:(83.0±4.3)%的贴壁细胞双染呈阳性,并且DiI-acLDL标记的内皮祖细胞红色荧光在体外可以持续6周以上;第7天贴壁细胞流式细胞仪分析显示:CD34、CD133和KDR分别为(17.8±3.7)%、(22.1±4.4)%、(81.5±5.0)%.结果提示,实验成功从脐带血单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞,在其体外可扩增并向为内皮细胞方向分化.     

巴曲酶可影响人外周血内皮祖细胞定向分化及增殖能力

背景：近年来内皮祖细胞促进机体血管新生方面的重要作用已形成共识,但内皮祖细胞的定向分化和扩增的问题是影响其疗效和广泛开展的主要原因。目的：观察人外周血内皮祖细胞体外分离、纯化、扩增和诱导分化为内皮细胞的可行性。方法：用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,接种于包被有人纤维连接蛋白的细胞培养板中,培养6d后,收集贴壁细胞。以血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对贴壁细胞进行诱导培养。另外,分别以0.05,0.1,0.2BU/mL巴曲酶培养贴壁细胞,观察内皮祖细胞的增殖能力。结果与结论：经血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导后的细胞形态上表现内皮细胞特征,经流式细胞仪测定表达血管内皮细胞特有表面标志CD31和vWF,说明诱导后的细胞为内皮细胞。巴曲酶在体外培养条件下可增加血内皮祖细胞的数量,以0.1BU/mL浓度作用显著,且作用时间与血内皮祖细胞增殖能力的改善呈正相关。     

人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的：探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法，为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。 方法：实验于2004-09／2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血，经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞，在含有体积分数为O．1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4mg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增，分别在培养的第6和14天，流式细胞仪检测其KDR，CDl33，CD34和vWF阳性率，并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞、DiI-aeLDL来进行细胞功能学的鉴定。 结果：①人外周血单个核细胞经体外诱导分化，培养第6天的贴壁细胞表达KDR，CDl33，CD34和vWF，流式细胞仪检测其阳性率分别为（46．4&;#177;9．3）％、（33．8&;#177;1l、7）％、（73．5&;#177;6、3）％和（38．9&;#177;8、2）％，能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-aeLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR，CD34和vWF，不表达CDl33，流式细胞仪检测其阳性率分别为（8l、5&;#177;7、6）％、（88．9&;#177;5．4）％和（78、3&;#177;13．6）％，能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-aeLDL。 结论：外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞，为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

犬外周血淋巴管内皮祖细胞的分选及其向内皮细胞的诱导分化研究

目的研究犬外周血中CD34^＋／CD133^＋／VEGFR-3^＋淋巴管内皮祖细胞的生物学特征，探讨血管内皮生长因子-C（VEGF-C）／血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）信号途径在淋巴管内皮祖细胞向淋巴管内皮细胞分化中的作用。方法用密度梯度离心法从犬外周血分离单个核细胞，再用流式细胞仪从单个核细胞分选VEGFR-3^＋细胞。通过VEGF-C诱导使VEGFR-3^＋细胞向内皮细胞分化。在扫描电镜和透射电镜下观察细胞表面形态和超微结构，并在共聚焦激光扫描显微镜下观察特征性标志物的表达。结果VEGFR-3^＋细胞同时表达CD34和CD133。经流式细胞仪分析，外周血单个核细胞中CD34^＋／VEGFR-3^＋细胞的含量约为0.13％，VEGFR-3^＋／CD133^＋细胞的含量约为0.08％。CD34^＋／CD^33^＋／VEGFR-3^＋细胞的体积较大，直径约为15μm。经VEGF-C诱导后，细胞数目增多。细胞变为梭形，伸出板状伪足和许多丝状伪足。诱导后1周，细胞表达血管性血友病因子。诱导后2周，细胞表面出现小凹，细胞内可见Weibel-Palade小体。细胞表达淋巴管内皮细胞特异性标志物LYVE-1，CD133标志消失。结论在VEGF-C诱导作用下，外周血中的CD34^＋／CD133^＋／VEGFR-3^＋淋巴管内皮祖细胞能向淋巴管内皮细胞分化。VEGF-C／VEGFR-3信号途径在淋巴管内皮祖细胞的分化过程中起着重要作用。     

利用自体血清培养人外周血内皮祖细胞

背景:传统方法培养人外周血来源内皮祖细胞操作复杂,费用大,细胞获得率较低。目的:利用自体血清培养人外周血来源内皮祖细胞,并鉴定其功能。方法:采用密度梯度离心法从人外周血分离得到单个核细胞,体外培养分化为内皮祖细胞。按培养基条件不同分为EGM-2MV组、添加自体血清组(M199+体积分数10%自体血清+胰岛素样生长因子)、添加胎牛血清组(M199+体积分数10%胎牛血清+血管内皮细胞生长因子+碱性成纤维细胞生长因子+胰岛素样生长因子+表皮生长因子)。观察内皮祖细胞增殖、迁移能力;采用细胞形态观察、双荧光染色法及流式细胞仪等技术对培养的内皮祖细胞进行鉴定。结果与结论:培养第7天,EBM-2MV组和添加自体血清组细胞增殖能力和迁移率都优于添加胎牛血清组(P<0.05)。每组细胞经结合Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素双色荧光染色鉴定后双阳性率>80%,免疫细胞化学检测显示每组细胞CD133,CD34和KDR的表达均为阳性。证实在M199培养液中添加自体血清是一种简单、高效的培养内皮祖细胞方法。     

正常成人粒细胞集落刺激因子动员外周血内皮祖细胞的生物学特性

背景：内皮祖细胞具有很好的临床应用前景,特别是作为种子细胞参与组织工程血管构建及疾病治疗。目的：观察粒细胞集落刺激因子动员的外周血中内皮祖细胞的生物学特性。方法：获取粒细胞集落刺激因子动员正常人的外周血单个核细胞,同时获取8例正常成人外周血单个核细胞作为对照。将获取的细胞接种在预铺纤维连接蛋白的培养皿中进行体外培养。FACS和免疫组化法检测获取细胞的免疫表型;采用MTT比色法和黏附能力测定实验检测内皮祖细胞的增殖和黏附能力;实时定量PCR检测血管形成相关细胞因子的表达;荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）吞噬实验鉴定内皮功能;将获取的细胞接种在含有血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的基底膜胶中诱导血管生成。结果与结论：动员后外周血和未动员外周血内皮祖细胞具有相似的细胞形态和免疫表型,FACS和免疫组化检测结果显示上述两种内皮祖细胞都表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、FLK-1、ve-Cadherin、vWF和CD133。内皮细胞生长因子和基质细胞衍生因子1在动员后外周血内皮祖细胞中的表达水平增加;两种来源的内皮祖细胞都具有吞噬Dil-acLDL和在体外诱导血管生成的能力。但是,动员的外周血中内皮祖细胞的数量和增殖能力明显强于未动员外周血中的内皮祖细胞。结果可见动员后的外周血中可以分离出具有内皮祖细胞特性的细胞群体,该群体具有体外诱导血管生成的能力;与未动员的外周血内皮祖细胞相比,动员后外周血内皮祖细胞数量明显增加并具有更好的增殖能力。     

人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1×10^6／cm^2的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

兔骨髓源性血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

本研究探讨兔骨髓源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)的分离、培养及鉴定方法。抽取兔骨髓细胞,用梯度密度离心法获得单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过细胞形态观察、免疫组织化学试验、流式细胞术以及内皮祖细胞吞噬功能进行鉴定。结果表明,新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养48小时后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接呈梭形的内皮样细胞。内皮祖细胞免疫组织化学检测结果显示CD133(+),CD34(+),Ⅷ因子(++),KDR(++);流式细胞术鉴定结果显示CD133的阳性率为(18.23±7.12)%,CD34的阳性率为(47.71±14.85)%,CD31的阳性率为(71.61±13.51)%,KDR的阳性率为(87.24±11.40)%。细胞吞噬功能鉴定说明超过80%的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-acLDL和FITC-UEA-1。结论:密度梯度离心法体外分离兔骨髓源的单个核细胞,在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮祖细胞。     

体外扩增法分离培养兔骨髓来源的血管内皮祖细胞

背景:体外扩增法培养血管内皮祖细胞操作简便、费用低廉是实验中获取内皮祖细胞的主要方法。目的:拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞,为进一步观察自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础。设计、时间及地点:开放性实验,于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成。材料:6~8月龄新西兰大白兔8只,雌雄不拘,体质量(2.5±0.5)kg,抽取骨髓,密度离心法分离骨髓单个核细胞方法:将骨髓单个核细胞接种于密度为1×106cm-2,加入含有血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中体外扩增培养7d,通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合BS-1的细胞,双染色为橙色荧光。免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133,CD34,Flk-1的表达。主要观察指标:①细胞形态观察。②血管内皮祖细胞的增殖能力。③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果。④血管内皮祖细胞免疫组织化学鉴定结果。⑤血管内皮祖细胞表面标志物流式细胞仪检测结果。结果:①细胞形态观察:新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养72h后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接,呈梭形的内皮样细胞。②血管内皮祖细胞的增殖能力:培养2~4d血管内皮祖细胞增殖较快,之后增殖速度减缓,生长曲线呈典型"S"形外观,培养第6,7天血管内皮祖细胞生长再次增快,吸光度值分别达到0.58±0.15和0.62±0.23。③在血管内皮祖细胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上;与凝集素BS-1结合率几乎达100%;两者双染色率达90%以上。④血管内皮祖细胞免疫组织化学及流式细胞仪检测细胞表面标志物CD133,FlK-1,CD34均呈阳性。结论:体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体。     

外周血内皮祖细胞移植对肢体缺血的改善作用

背景:内皮祖细胞移植为肢体缺血的治疗提供了新的选择。目的:研究人外周血来源内皮祖细胞移植对改善肢体缺血的作用。方法:采用Ficoll密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞,体外诱导扩增6d后,检测其内皮祖细胞特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果。结果与结论:从人外周血单个核细胞诱导出的贴壁细胞可表达内皮祖细胞特异性标志物CD133、CD34和血管内皮生长因子受体2,说明从人外周血单个核细胞中可诱导出内皮祖细胞。移植内皮祖细胞后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均明显改善(P<0.05);在缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色荧光标记的内皮祖细胞的掺入。表明移植的内皮祖细胞可以定向整合到缺血局部,改善裸鼠的后肢缺血。     

成人外周血平滑肌祖细胞的体外培养

背景:外周血平滑肌祖细胞具有向平滑肌细胞分化的能力.目的:探索体外分离培养成人外周血平滑肌祖细胞的方法及其生长分化特性.方法:采用密度梯度离心法分离获得成人外周血单个核细胞,培养12 d后,应用流式细胞仪鉴定分析平滑肌祖细胞并分选纯化,继续培养诱导分化.采用倒置显微镜观察平滑肌祖细胞的形态变化,免疫荧光染色法观察其α-肌动蛋白的表达,同时应用Western blot法检测调宁蛋白、平滑肌肌球蛋白重链的表达情况.此外,观察平滑肌祖细胞的生长特性,绘制生长曲线.结果与结论:成人外周血单个核细胞诱导培养4 d时开始出现细胞集落,12 d时细胞呈明显梭形.流式细胞仪分析显示,CD14和CD105双阳性的平滑肌祖细胞占贴壁细胞的(71.8±7.2)%.分选纯化的平滑肌祖细胞培养到28 d呈旋涡状生长.间接免疫荧光染色显示,α-肌动蛋白表达呈阳性.Western blot检测显示,调宁蛋白和平滑肌肌球蛋白重链分别于14,21 d开始表达,并逐渐增加.生长曲线表明,细胞生长至第6天进入对数生长期,第12天后进入平台期.提示通过对外周血单个核细胞的诱导培养,可以获得大量的平滑肌祖细胞.它能稳定增殖,并可进一步分化为平滑肌细胞.     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CDl33、CD34、FIk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

绵羊骨髓来源内皮祖细胞的培养与鉴定

背景:当今,组织工程化静脉瓣的研究刚刚起步,种子细胞的选择是其关键,内皮祖细胞可以作为组织工程化静脉瓣体外构建理想的种子细胞.目的:通过体外培养与鉴定绵羊骨髓来源内皮祖细胞,探讨绵羊骨髓来源内皮祖细胞培养方法,为绵羊组织工程静脉瓣种子细胞选择提供实验基础.方法:绵羊骨髓经条件培养基进行选择培养获取骨髓单个核细胞,传代扩增后用磁珠分选出CD133+细胞再培养,流式细胞检测确认分前细胞CD133的表达情况;分选传代后绘制细胞生长曲线观察细胞生长能力,用免疫细胞化学检测细胞特异性分了CD133,D34,VWF的表达情况;FITC标记BS-1-Lectin和Dil标记ac-LDL标记细胞检测细胞吞噬功能.结果与结论:绵羊骨髓单个核细胞原代培养2 d细胞开始贴壁,7 d细胞完全融合,传代后第2天进入对数生长期,传代3～5 d形成为典型的铺路石样,传代后第7 d细胞进入增殖平台期;细胞传代后磁珠分选率为12.6%,流式细胞仪检测显示CD133阳性率为12.64%:免疫细胞化学检测显示细胞呈CD133、CD34、血管性血友病因子阳性表达.细胞能同时吞噬FITC-labeledBS-1-lectin,Dil-ac-LDL阳性率达85.3%.证实实验成功地从绵羊骨髓单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞.     

人脐带血内皮祖细胞与血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子共培养及其增殖和迁移能力

背景:目前组织工程心脏瓣膜再内皮化种子细胞主要来源于成熟内皮细胞,内皮祖细胞作为内皮细胞的前体细胞越来越受到人们的关注。目的:分离和扩增人脐带血内皮祖细胞,观测其体外生物学特性。方法:密度梯度离心法分离新鲜的脐血中单个核细胞,在含血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的培养液中培养扩增,通过形态学、免疫荧光和流式细胞仪等对贴壁细胞进行鉴定;并与脐静脉内皮细胞进行增殖和迁移能力比较。结果与结论:随着培养和诱导时间延长,贴壁细胞形态发生明显的改变,从小圆形变成梭形,逐渐分化成典型成熟内皮细胞的鹅卵石样形态,并可形成特征性的克隆;体外诱导7d后90%以上贴壁细胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性;贴壁细胞流式细胞仪分析显示:培养7d的细胞VEGFR-2、CD34和CD133表达分别占(77.4±4.9)%、(52.4±6.6)%和(19.4±2.1)%,培养28d的细胞VEGFR-2和CD34表达分别占(81.1±7.4)%和(7.6±3.1)%,而未检测到CD133表达;人内皮祖细胞增殖和迁移能力明显高于人脐静脉内皮细胞(P<0.05),并且细胞数量可扩增达109L-1。结果显示用密度梯度离心法和贴壁筛选法,可从人脐带血分离、纯化内皮祖细胞;内皮祖细胞可诱导分化为内皮细胞,增殖和迁移能力都很强。     

成人外周血平滑肌祖细胞的体外培养

背景：外周血平滑肌祖细胞具有向平滑肌细胞分化的能力。目的：探索体外分离培养成人外周血平滑肌祖细胞的方法及其生长分化特性。方法：采用密度梯度离心法分离获得成人外周血单个核细胞,培养12d后,应用流式细胞仪鉴定分析平滑肌祖细胞并分选纯化,继续培养诱导分化。采用倒置显微镜观察平滑肌祖细胞的形态变化,免疫荧光染色法观察其α-肌动蛋白的表达,同时应用Westernblot法检测调宁蛋白、平滑肌肌球蛋白重链的表达情况。此外,观察平滑肌祖细胞的生长特性,绘制生长曲线。结果与结论：成人外周血单个核细胞诱导培养4d时开始出现细胞集落,12d时细胞呈明显梭形。流式细胞仪分析显示,CD14和CD105双阳性的平滑肌祖细胞占贴壁细胞的（71.8±7.2）%。分选纯化的平滑肌祖细胞培养到28d呈旋涡状生长。间接免疫荧光染色显示,α-肌动蛋白表达呈阳性。Westernblot检测显示,调宁蛋白和平滑肌肌球蛋白重链分别于14,21d开始表达,并逐渐增加。生长曲线表明,细胞生长至第6天进入对数生长期,第12天后进入平台期。提示通过对外周血单个核细胞的诱导培养,可以获得大量的平滑肌祖细胞。它能稳定增殖,并可进一步分化为平滑肌细胞。     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景:成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系.目的:建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法.方法:应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3d 后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6 天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT 法和细胞计数测定第1,3 代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定.结果与结论:细胞生长曲线测定表明接种后第3 天细胞进入指数增生期,至第6 天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133 和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2.证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离培养及鉴定

背景:骨髓间充质干细胞的分离和培养扩增至今缺乏统一的方法.内皮祖细胞可以由外周血或骨髓中的单个核细胞诱导分化而成,但因获取骨髓单个核细胞的方法各异,分离效果亦有较大差异.目的:拟在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,并对其进行鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-10/2009-02在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成.材料:清洁级健康雄性SD大鼠2只,由安徽省动物中心提供.方法:抽取大鼠骨髓,通过密度梯度离心法提取单个核细胞,采用差速贴壁法分离骨髓间充质干细胞.原代骨髓间充质干细胞培养48h后,收集未贴壁细胞,加入含胎牛血清、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、重组人上皮生长因子的EGM-2完全培养液诱导骨髓间充质干细胞向内皮祖细胞分化.设立3组:分别为早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞、2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞、大鼠成熟主动脉内皮细胞,采用硝酸还原酶法间接测量细胞培养液中一氧化氮的含量.主要观察指标:骨髓间充质干细胞与内皮祖细胞体外培养情况,细胞培养液中一氧化氮的含量.结果:原代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,24 h内大部分细胞贴壁,9～10 d可达90%融合,纯化扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭性,传代周期为8 d左右,流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞C034,CD45呈阴性,CD105呈阳性.2次贴壁的内皮祖细胞培养3 d内贴壁,6 d形成集落,8～10 d出现条索状结构,呈微血管样生长,2周时大部分细胞呈多角形,细胞集落相互连接,呈典型的"铺路石"样,7～10 d细胞Dil-acLDL、FITC-UEA-1双染呈阳性,流式细胞仪检测Flk-1,CD133阳性.2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞培养液中一氧化氮含量明显高于早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞(P<0.05),但低于大鼠成熟主动脉内皮细胞(P<0.05).结论:差速贴壁法能有效地分离、纯化、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,加入多种细胞生长因子诱导后具有较强地向内皮细胞方向分化的能力,且2次贴壁细胞已具有部分内皮细胞的功能.     

大鼠外周血单个核细胞体外向内皮细胞诱导分化时的表型变化

背景:内皮祖细胞在贴壁分化过程中其干细胞标记以及内皮细胞表型的变化过程将有助于了解内皮祖细胞的分化特性.但日前还未找到区别于成内皮细胞特异性的细胞标记.目的:观察大鼠外周血单个核细胞外分化为内皮细胞的过程中干细胞标志物以及内皮细胞表型的变化.设计、时间及地点:细胞观察实验,2004 06/2008-12在青岛市市立医院心脏外科实验室完成.材料:抽取雄性SD大鼠外周血,应用Ficoll 密度梯度离心的方法获得单个核细胞.方法:单个核细胞体外培养于纤连蛋白处理的培养皿中,同时应用血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导,使之向内皮细胞转化. 主要观察指标:以免疫组织化学方法检测细胞CD31、CD34、Flk-1、vWF在第1～7大的表达.结果:贴擘细胞的0D31、CD34、FIk-1、vWF在不同时段呈不同程度的表达.干细胞标志物CD31、CD34在培养的第2天开始表达,第4天最强,以后逐渐弱,第6天消失.而Flk-1在第3天开始表达,以后逐渐增强,第7天时最强.vWF表达是逐步出现的,第7天时表达为100%.结论:大鼠外周血干细胞向内皮祖细胞分化的过程中,干细胞标志物逐渐消失,内皮细胞的表型逐步出现.