自体血清与胎牛血清培养兔关节软骨细胞的生物学特性

背景：目前培养软骨细胞多使用胎牛血清。但近年异种血清培养组织向临床应用的安全性受到质疑,因此自体血清培养越来越受到重视。目的：比较体积分数10%兔自体血清与体积分数10%胎牛血清培养兔关节软骨细胞生物学特性的差异。方法：兔自体血清培养液制备后,分离培养兔关节软骨细胞,分别在体积分数10%自体血清和体积分数10%胎牛血清中进行单层传代培养至1,3,5代,采用光镜观察细胞形态变化,绘制生长曲线评估细胞增殖速度,观察甲苯胺蓝染色、Ⅰ,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果,以流式细胞仪分析细胞Ⅰ,Ⅱ型胶原以及CD26,CD44的表达变化。结果与结论：①在细胞形态上自体血清和胎牛血清培养的软骨细胞差异不大。②自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清培养的软骨细胞生长速度更快。③甲苯胺蓝染色结果示,无论是自体血清还是胎牛血清所培养的细胞,染色随代龄的增加逐渐变浅,细胞传至第5代时两组几乎均无异染。对于1代和3代细胞而言,自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清所培养的软骨细胞较为深染。④Ⅰ型胶原的表达随代数的增加而增加,而Ⅱ型胶原的表达则随代数的增加而减少。在3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅰ型胶原的表达水平低于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）;在1代和3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅱ型胶原的表达水平高于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）。⑤CD26表达呈现先升高后降低的趋势,而CD44的表达不随传代数的增加而改变。提示同异体体积分数10%的胎牛血清相比,体积分数10%的自体血清培养的兔软骨细胞生长速度快,且在大部分指标上可以较好地保持细胞表型。     

紫绀型先天性心脏病患儿外周血内皮祖细胞的体外分离培养和鉴定

背景:一些基础研究成果对于新生血管形成和内皮祖细胞的自动募集机制已做出了合理的解释,体外培养的内皮祖细胞可分化为成熟的内皮细胞,有助于血管内皮修复。目的:拟建立从紫绀型先天性心脏病患儿外周血获取内皮祖细胞的方法。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08/2008-04在中南大学湘雅二医院完成。材料:外周血来源于2007-10/12中南大学湘雅二医院胸外科收治的15例法洛四联症患儿,安静状态下末梢氧饱和度为(78.0±5.0)%。方法:采用Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离单个核细胞,以含体积分数为0.2的胎牛血清、4mg/L牛脑垂体提取物、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL氨苄青霉素、100g/L硫酸链霉素的M199培养基进行体外诱导分化,调整细胞密度为2×109L-1,接种至预铺人纤维连接蛋白的6孔培养板,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下,贴壁法纯化培养10d。主要观察指标:细胞形态和生长情况,Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白/FITC标记的荆豆凝集素双荧光染色鉴定结果,vWF、CD34及CD31免疫组化鉴定结果,PE标记CD133抗体与藻蓝蛋白标记KDR抗体免疫荧光鉴定结果,透射电镜观察内皮祖细胞特征细胞器。结果:接种后0.5h细胞贴壁生长,培养第7天形成典型的细胞集落,第14天呈铺路石样外观,细胞数量级可达108。培养第10天,贴壁细胞中70%呈Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白/FITC-UEA-Ⅰ双阳性,为正在分化的内皮祖细胞;vWF、CD34及CD31免疫组化染色均呈阳性表达;PE标记CD133抗体呈红色荧光,藻蓝蛋白标记KDR抗体呈蓝色荧光。透射电镜可见内皮祖细胞特征性幼稚线粒体及Weibel-Palade小体。结论:实验成功从紫绀型先天性心脏病患儿外周血中分离培养并获取高纯度的内皮祖细胞,且在体外稳定快速扩增。     

人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

背景：国内外有关内皮祖细胞的分离培养和鉴定方面的文章很多,但是人脐血和外周血内皮祖细胞的鉴别方面文章不多。目的：从人脐血和外周血中分离出内皮祖细胞,并对其进行培养和鉴定。方法：选取密度梯度离心法从脐血和外周血中分离获得单个核细胞,按照1×10^6／cm^2的浓度种植于预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,用含血管内皮生长因子的M199培养基进行诱导培养。结果与结论：人脐血和外周血中存在内皮祖细胞,浓度梯度离心联合贴壁筛选获得的单个核细胞在血管内皮生长因子的诱导培养下可分化成内皮祖细胞,内皮祖细胞表达CD34、CD133、CD105、KDR和CD31,能吞噬乙酰化低密度脂蛋白,结合荆豆凝集素1,它们可作为体外分选内皮祖细胞的标志。     

人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的:探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。方法:实验于2004-09/2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在含有体积分数为0.1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4μg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增,分别在培养的第6和14天,流式细胞仪检测其KDR,CD133,CD34和vWF阳性率,并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定。结果:①人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6天的贴壁细胞表达KDR,CD133,CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%、(33.8±11.7)%、(73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR,CD34和vWF,不表达CD133,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%、(88.9±5.4)%和(78.3±13.6)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。结论:外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

人外周血内皮祖细胞的诱导、分化与鉴定

目的:研究人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为自体外周血内皮祖细胞移植、促进血管新生提供一条治疗新途径。方法:采集健康志愿者外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在加有血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中培养和扩增,培养第7天,免疫组化(SABC法)和免疫荧光检测细胞表面抗原的表达,流式细胞仪检测其阳性率。结果:人外周血单个核细胞经体外诱导分化,表达内皮祖细胞的表面标志KDR、CD133和CD34,流式细胞仪检测其阳性率分别为75%、21%和69%。结论:外周血来源的单个核细胞能在一定的培养条件下分化为内皮祖细胞。     

应用体外扩增法对兔骨髓来源内皮祖细胞的分离培养和鉴定

目的拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞,为进一步研究自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础.方法实验于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成.①DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白(molecular probes公司),FITC标记的凝结素BS-1(vector公司),鼠抗人CD34抗体(Biolegend公司),兔抗人Flk-1抗体(Biolegeng公司),鼠抗人CD133单抗(R&D公司).②选用新西兰大白兔8只,抽取骨髓,密度离心法分离骨髓单个核细胞.接种密度为1×106/cm2,加入含有血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子的M199培养基中体外扩增培养7 d,观察细胞生长情况及增殖能力.③通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合BS-1的细胞,双染色为橙色荧光.④免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133,CD34,Flk-1 的表达.结果(①细胞形态观察新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养72 h后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接,呈梭形的内皮样细胞.②血管内皮祖细胞的增髓能力培养2～4 d血管内皮祖细胞增殖较快,之后增殖速度减缓,生长曲线呈典型"S"形外观,培养第6,7天血管内皮祖细胞生长再次增快,吸光度值分别达到0.58±0.15和0.62±0.23.③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果在血管内皮祖细 胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上;与凝集素BS-1结合率几乎达100%;二者双染色率达90%以上.④血管内皮祖细胞免疫组化及流式细胞仪检测结果细胞表面标志物CD133,Flk-1,CD34均呈阳性.结论体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体.     

体外培养基中加入细胞生长因子诱导大鼠骨髓单个核细胞向内皮细胞的分化

背景:内皮祖细胞在骨髓中的含量高于外周血,但也仅占骨髓单个核细胞的1%.因此,在一般实验室培养过程中也需要解决提高内皮祖细胞体外扩增数量并保持其低分化状态的问题.目的:观察在含胎牛血清的M199培养基中加入血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导内皮祖细胞的定向分化能力.设计、时间及地点:以细胞为观察对象的开放性实验,于2007-09/2008-02在辽宁中医药大学教学实验中心bsl-2级实验室完成.材料:体质量(200±20)g的健康成年Wistar大鼠.方法:无菌采集健康Wistar大鼠股骨骨髓,应用Ficoll密度梯度离心的方法获得单个核细胞,加入含胎牛血清 肝素 血管内皮细胞牛长因子和碱性成纤维细胞生长因子的M199实验培养液和不含诱导生长因子与肝素的M199培养液为对照组.主要观察指标:诱导骨髓细胞向内皮样细胞生长过程中,应用表面抗原免疫细胞化学染色鉴定细胞,以Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光实验鉴定培养细胞向内皮细胞分化的程度.结果:贴壁细胞培养诱导后具有内皮细胞的形态学特征,细胞呈上皮细胞样铺路石状贴壁生长,贴壁时间相对缓慢.加入M199实验培养液诱导后的第9天Ⅷ因子、CD31阳性表达的细胞分别为(55.1±7.2)%、(45.64±5.8)%, Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率为(78.2±5.4)%,提示为正在分化的内皮祖细胞.对照组相关抗原表达阴性,提示为分化早期的骨髓细胞.结论:结果显示骨體单个核细胞培养出可稳定扩增的内皮祖细胞,在体外特殊诱导环境下定向分化为内皮样细胞,且效果优于对照组.     

大鼠骨髓间充质干细胞生长特性和表面标志与培养基中胎牛血清浓度的关系

目的：探讨两种浓度胎牛血清培养的不同传代次数的骨髓间充质干细胞在生长特性及表面标志方面的差异性。方法：实验于2004年在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心进行。取健康Wistar大鼠5只，采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞，然后分别以体积分数为0．1和0．15的胎牛血清的L-DMEM培养基进行贴壁培养，观察原代和传代细胞的形态特征、生长曲线及表面标志CD45，CD11b，CD29和CD44的表达（骨髓间充质干细胞表达CD29和CD44，造血前体细胞表达CD45和CD11b）。结果：④两种浓度胎牛血清培养细胞均能获得贴壁梭形骨髓间充质干细胞，但体积分数为0．15的胎牛血清原代培养的细胞分裂增殖较快，集落融合较早，传代时间较短（平均10d）。（爹体积分数为0．1的胎牛血清传代培养第1，2代细胞均质性相对较差，CD45阳性率分别为23．4％，15,4％，CD11b阳性率分别为16．6％，10.3％，高于体积分数为0．15的胎牛血清培养组（P〈0．05），至第3代后两组已无差异，CD45和CD11b阳性率均小于5％，而CD29和CD44阳性率均大于95％。③两组的骨髓间充质干细胞生长曲线相似，但体积分数为0．15的胎牛血清培养的骨髓间充质干细胞对数生长期峰值出现较早，为第6天，而体积分数为0．1的胎牛血清培养组为第7天。结论：体积分数为0．1和0．15的胎牛血清培养的骨髓间充质干细胞在生长特性和表面标志方面存在差异。使用体积分数为0．1的胎牛血清已可满足骨髓间充质干细胞的分离纯化和培养扩增，但要在短期内获得较纯的骨髓间充质干细胞，使用体积分数为0．15胎牛血清优于体积分数为0．1胎牛血清。     

不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景:目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/4,牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少.目的:观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响.方法:用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定.结果与结论:脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖.流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变.     

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响

背景:骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,最常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性件隐患.目的:观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响.方法:自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养.分别以下列血清微环境培养:自身血清组:分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养:同种异体衄清组:分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组:分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养:DMEM组:分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养.在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率:生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达.结果与结论:大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组.24,48,72 h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P＜0.01).在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率最快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象.流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞.但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%.可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境.提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化.     

人外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

背景：内皮祖细胞是成熟内皮细胞的前体细胞,具有新生血管和新生内皮化作用,在许多方面均有广泛应用前景,但其生物学特征及鉴定方法仍存争议。目的：探索从人外周血分离培养内皮祖细胞的方法并鉴定其生物学特征。方法：外周采血后应用密度梯度离心法分离成人外周血单核细胞,在内皮细胞全培养基重悬后接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中,体外培养扩增获取人内皮祖细胞并观察其形态变化、生长增殖潜能及细胞表面抗原表达情况,并通过细胞一氧化氮分泌功能测定及体外血管形成实验检测其功能学特征。结果与结论：体外诱导培养后,六七天形成纺锤样细胞簇,两三周黏附细胞发育形成鹅卵石样外观细胞,逐渐融合呈外生性生长。在相同培养条件下,与人主动脉内皮细胞相比人内皮祖细胞具有高的增殖潜能。人内皮祖细胞表达CD31、CD34、CD144、KDR,表现为典型内皮细胞系表型,此外细胞可摄取ac-LDL并结合UEA-I。在功能上内皮祖细胞可分泌一氧化氮并可在Matrigel中形成管腔样结构。提示通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞体外黏附诱导培养可获取人外周血内皮祖细胞;细胞形态、增殖能力、生物表型特征结合细胞功能学的综合性鉴定方法用于内皮祖细胞的鉴定具有一定意义。     

犬外周血淋巴管内皮祖细胞的分选及其向内皮细胞的诱导分化研究

目的研究犬外周血中CD34^＋／CD133^＋／VEGFR-3^＋淋巴管内皮祖细胞的生物学特征，探讨血管内皮生长因子-C（VEGF-C）／血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）信号途径在淋巴管内皮祖细胞向淋巴管内皮细胞分化中的作用。方法用密度梯度离心法从犬外周血分离单个核细胞，再用流式细胞仪从单个核细胞分选VEGFR-3^＋细胞。通过VEGF-C诱导使VEGFR-3^＋细胞向内皮细胞分化。在扫描电镜和透射电镜下观察细胞表面形态和超微结构，并在共聚焦激光扫描显微镜下观察特征性标志物的表达。结果VEGFR-3^＋细胞同时表达CD34和CD133。经流式细胞仪分析，外周血单个核细胞中CD34^＋／VEGFR-3^＋细胞的含量约为0.13％，VEGFR-3^＋／CD133^＋细胞的含量约为0.08％。CD34^＋／CD^33^＋／VEGFR-3^＋细胞的体积较大，直径约为15μm。经VEGF-C诱导后，细胞数目增多。细胞变为梭形，伸出板状伪足和许多丝状伪足。诱导后1周，细胞表达血管性血友病因子。诱导后2周，细胞表面出现小凹，细胞内可见Weibel-Palade小体。细胞表达淋巴管内皮细胞特异性标志物LYVE-1，CD133标志消失。结论在VEGF-C诱导作用下，外周血中的CD34^＋／CD133^＋／VEGFR-3^＋淋巴管内皮祖细胞能向淋巴管内皮细胞分化。VEGF-C／VEGFR-3信号途径在淋巴管内皮祖细胞的分化过程中起着重要作用。     

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养与鉴定

背景：内皮祖细胞因其分离与培养的方法各不相同,在实验中难以重复。目的：探讨大量获取骨髓源性内皮祖细胞分离与培养的方法。方法：通过密度梯度离心法从4周龄SD大鼠骨髓中分离单个核细胞,使用EGM-2MV培养基进行诱导培养,采用形态学特征观察、摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC—UEA-1实验、免疫荧光化学鉴定其表面抗原CD133与VEGFR2等方法对其进行鉴定,并通过管腔形成实验观察形成管腔的能力。结果与结论：①形态学观察：分离的骨髓单个核细胞经诱导培养后,在生长的早期（8d左右）、晚期（15d左右）其细胞形态有一定差异,早期以纺锤形、三角形、圆形细胞多见,晚期以圆形、短梭形细胞多见。②摄取Dil-Ac-LDL与结合FITC-UEA-1实验：显示8,21d的细胞均为阳性。⑧免疫荧光化学染色：8d的细胞表达CD133、VEGFR2。④管腔形成实验：在Matrigel基质上15h左右能够生成血管样结构。结果表明：利用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞后以EGM-2MV进行诱导培养,经过鉴定证明获得的细胞符合内皮祖细胞的特征。这种方法能够简单、快速、可靠、大量地获取内皮祖细胞。     

大鼠骨髓与外周血来源内皮祖细胞生物学特性比较

背景：内皮祖细胞不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后血管发生和血管内膜损伤后修复,对治疗缺血性疾病意义重大,但目前对内皮祖细胞的分离、培养、鉴定还存在争议。目的：体外分离、培养大鼠骨髓与外周血来源的内皮祖细胞,并比较其生物学特性。方法：密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓和外周血单个核细胞,接种于纤维连接蛋白铺被的培养瓶中贴壁培养,用加入血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子的完全培养基诱导培养,对获得的贴壁细胞进行细胞形态学,免疫细胞化学染色,流式细胞仪,透射电镜,以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1双荧光染色法检测。结果与结论：骨髓来源的内皮祖细胞数量多,集落状生长,增殖能力强;外周血来源的内皮祖细胞数量较少,散在生长,消化后能贴壁但不能传代。两种不同来源的内皮祖细胞免疫细胞化学检测贴壁细胞CDl33、CD34、FIk-1、Ⅷ因子在不同时段呈阳性表达;激光共聚焦显微镜观察,Dil-acLDL、FITC-UEA-1均为双染。透射电镜检查外周血来源的内皮祖细胞发现W-P小体。提示大鼠骨髓和外周血均能分离培养出内皮祖细胞,但前者是早期内皮祖细胞,后者为晚期内皮祖细胞,两者生物学特性各不相同。     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景：成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系。目的：建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法。方法：应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3d后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT法和细胞计数测定第1,3代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定。结果与结论：细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第6天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2。证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞。     

正常成人粒细胞集落刺激因子动员外周血内皮祖细胞的生物学特性

背景：内皮祖细胞具有很好的临床应用前景,特别是作为种子细胞参与组织工程血管构建及疾病治疗。目的：观察粒细胞集落刺激因子动员的外周血中内皮祖细胞的生物学特性。方法：获取粒细胞集落刺激因子动员正常人的外周血单个核细胞,同时获取8例正常成人外周血单个核细胞作为对照。将获取的细胞接种在预铺纤维连接蛋白的培养皿中进行体外培养。FACS和免疫组化法检测获取细胞的免疫表型;采用MTT比色法和黏附能力测定实验检测内皮祖细胞的增殖和黏附能力;实时定量PCR检测血管形成相关细胞因子的表达;荧光标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）吞噬实验鉴定内皮功能;将获取的细胞接种在含有血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的基底膜胶中诱导血管生成。结果与结论：动员后外周血和未动员外周血内皮祖细胞具有相似的细胞形态和免疫表型,FACS和免疫组化检测结果显示上述两种内皮祖细胞都表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、FLK-1、ve-Cadherin、vWF和CD133。内皮细胞生长因子和基质细胞衍生因子1在动员后外周血内皮祖细胞中的表达水平增加;两种来源的内皮祖细胞都具有吞噬Dil-acLDL和在体外诱导血管生成的能力。但是,动员的外周血中内皮祖细胞的数量和增殖能力明显强于未动员外周血中的内皮祖细胞。结果可见动员后的外周血中可以分离出具有内皮祖细胞特性的细胞群体,该群体具有体外诱导血管生成的能力;与未动员的外周血内皮祖细胞相比,动员后外周血内皮祖细胞数量明显增加并具有更好的增殖能力。     

Toward closed-system culture of blood origin endothelial cells

BACKGROUND: Blood outgrowth endothelial cells (BOECs) are thought to arise from very rare progenitors that are present in the mononuclear fraction of marrow or peripheral blood. Recently, BOECs have been expanded from progenitors present in buffy coat into confluent monolayers on fibronectin- or collagen-coated polystyrene surfaces. A method for sterile closed-system culture of these cells has not been described, however. Here, efforts are described toward developing closed-system culture of BOECs derived from progenitors present in a mononuclear apheresis unit by use of a cord blood filter, a sterile connection device, and a fibronectin-coated polycarbonate cassette. STUDY DESIGN AND METHODS: Strongly adherent cells from a mononuclear apheresis unit were eluted from a cord blood filter and resuspended in EGM-2 with 10 percent serum. Approximately 2 x 10(8) eluted cells were introduced into human fibronectin-coated polycarbonate cassettes. Medium was introduced and removed from cassettes with a sterile connection device and changed every 2 days. After expansion, cells were either cryopreserved or characterized by fluorescence-activated cell sorting analysis and ability to take up Dil-Ac-LDL. RESULTS: After 2 to 3 weeks of culture, 3 to 28 colonies with cobblestone morphology were observed in cassettes and passed to new cassettes within 3 to 4 weeks. By approximately 5 weeks of culture, 2 x 10(6) cells were typically obtained. BOECs uniformly took up Dil-Ac-LDL and were CD31+, CD105+, CD146+, CD45-, and CD14-. A population of BOECs was HLA-ABC+ or CD34+. CONCLUSION: BOEC progenitors can be isolated from mononuclear apheresis units with cord blood filters, expanded with fibronectin-coated polycarbonate cassettes, and cryopreserved.     

骨髓基质细胞对人造血CD_34~+细胞体外扩增及基因转导的作用

目的：探讨造血基质细胞对人外周血干细胞体外培养扩增及基因转导的促进作用。方法：应用基质细胞支持培养扩增体系进行人造血干细胞体外培养扩增及基因转导。结果：骨髓基质细胞和造血生长因子共同支持组的造血ＣＤ＋３４细胞在体外培养３周后,其造血祖克隆形成能力较单纯造血生长因子支持组高３０．７％（Ｐ＜０．０５）。在有基质细胞支持时,逆转录病毒载体上清转导人造血ＣＤ＋３４细胞后,其造血细胞克隆中Ｎｅｏ基因阳性克隆是无基质支持对照组的２倍。结论：基质细胞的支持有维持造血干细胞原始造血活性及促进基因转导的双重好处。     

血管内皮生长因子在鼠尾胶原凝胶诱导三维血管新生中的作用研究

背景:血管新生在组织工程研究中已引起了高度重视.血管内皮生长因子在二维平面培养中已证实能促进血管新生.目的:观察血管内皮生长因子在三维血管新生中的作用.方法:取SD大鼠骨髓,分离出内皮祖细胞.待细胞融合至70%～80%时添加鼠尾另一层胶原凝胶建立三维立体模型.实验组采用完全培养液含M199培养液、胎生血清加血管内皮生长因子及双抗;对照组培养液中不含血管内皮生长因子.培养第1,4,7,20天观察骨髓来源内皮祖细胞的体外培养和扩增情况并进行细胞鉴定.三维立体模型建立后第3,6,9,12天进行形态观察及定性定量分析.结果与结论:实验组内皮祖细胞在三维基质内向胶原基质内生长,24 h内即可出现向胶原内的出芽及浸润并逐渐形成分支样结构,对照组细胞生长慢,出芽慢,管状结构细小,向胶原内浸润的深度浅,网状结构稀疏,不完整.实验组新生血管数目显著高于对照组(P<0.01).取第3,6,9,12天的凝胶块检测,可见内皮素1、内皮型一氧化氮合成酶3表达阳性.结果表明,血管内皮生长因子能动员和诱导内皮祖细胞促进血管新生.鼠尾胶原凝胶可以诱导内皮祖细胞表现出血管新生中的迁移、增殖和发芽等步骤.