树突状细胞活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞对大鼠原发性肝癌细胞的体外杀伤

目的：研究负载肿瘤抗原的树突状细胞活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞对原发性肝癌细胞的杀伤效应,探讨其用于临床治疗的可行性,并为其应用提供实验依据。方法：联合应用粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子,白细胸介素－4和肿瘤坏死因子－a等,对大鼠骨髓单个核细胞进行体外诱导,同时加入大鼠原发性肝癌细胞株CBRH－7919细胞匀粗提物进行刺激,制备负载肿瘤抗原的树突状细胞后,活化同基因大鼠的 脾脏细胞,制备特异性细胞毒性T淋巴细胞,并采用MTT法检测效应细胞对CBRH－7919的杀伤效果,同时与效应细胞对K562的杀伤率进行比较。结果：大鼠骨髓单个核细胞诱导的负载肿瘤抗原的树突状细胞活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞对CBRH－7919具有较高的特异性杀伤作用。结论：负载肿瘤抗原的树突状细胞对原发性肝癌的治疗有潜在的临床应用前景。     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL对MCF-7细胞的体外杀伤效应

目的:采用MCF-7乳腺癌细胞裂解物致敏树突状细胞(DC),观察其体外诱导人T淋巴细胞产生特异性抗乳腺癌免疫的效能。方法:联合应用细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导出DC,体外负载MCF-7细胞冻融抗原,活化自身T淋巴细胞,采用ELISA法测定γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)水平,乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MCF-7细胞的杀伤效应。结果:负载抗原DC与T淋巴细胞共培养产生IFN-γI、L-12的水平,显著高于未负载抗原DC组(P<0.05)、单纯抗原组(P<0.01)和对照组(P<0.01);负载抗原DC诱导CTL对MCF-7的杀伤效应,显著高于其他3组(P<0.01)。结论:MCF-7细胞裂解物致敏DC诱导的人CTL,对MCF-7细胞具有明显的特异性杀伤效应。     

树突状细胞介导的肝癌免疫治疗实验研究

目的探讨以树突状细胞（DC）为介导的原发性肝癌免疫治疗新方法。方法采用肝癌细胞制备肿瘤细胞性抗原冲击致敏体外培养的DC,体外混合淋巴细胞反应检测抗原致敏DC;刺激同基因T淋巴细胞增殖的能力,观察负载肿瘤抗原的DC;体内外诱导产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）及其抗肿瘤能力。结果经肝癌细胞抗原致敏的DC;能诱导较强的自体T细胞增殖,且诱导特异性CTL,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC和未经肝癌细胞抗原致敏的DC;激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对非同种肿瘤细胞无明显的杀伤作用,经BEL7402肿瘤细胞抗原致敏的DC;经皮下免疫小鼠可诱导有效的免疫保护作用,可抵抗野生型BEL7402细胞的再攻击,肿瘤生长受到明显抑制,瘤体出现延迟,生长减慢。结论DC具有强大的刺激T淋巴细胞增殖和诱导产生特异性CTL的能力,在体内外均能激发特异性抗肿瘤免疫应答。     

白血病细胞抗原负载脐血DCs体外诱导抗白血病特异性CTLs应答研究

目的：探讨体外诱导脐血产生特异性细胞毒淋巴细胞的可行性。方法：通过体外联合细胞因子体外诱导10份脐血单个核细胞分化为树突状细胞（ dendritic cells,DCs）,同时让DCs细胞负载U937冻融抗原;使成熟DCs刺激同源的脐血T淋巴细胞生成细胞毒性T细胞（ cytotoxic T lymphocytes,CTLs）从而进行杀伤效应实验。 MTT法测定杀伤活性。结果：10份脐血标本均可培养出形态典型、功能成熟的DCs。经DCs诱导效应细胞DC-CTLs,在不同效靶比对U937细胞系、K562细胞株和对照组中,杀伤率以U937组最高（ P〈0.05）。结论：特定抗原负载的脐血DCs细胞有特异性的杀伤效应。     

黑色素瘤抗原-A3致敏的树突状细胞对人肝癌细胞的体外杀伤作用

【目的】观察经黑色素瘤抗原-A3(melanoma antigen gene,MAGE-A3)致敏树突状细胞(dendritic cells,DCs)活化的淋巴细胞对人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞的体外杀伤作用。【方法】采用粒—巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白介素-4(interleukin-4,IL-4)从人外周血中诱导树突状细胞,经MAGE-A3抗原致敏后与T淋巴细胞共培养,以淋巴细胞为效应细胞,分别以表达MAGE-A3抗原的肝癌细胞株H4M、不表达MAGE-A3抗原的正常肝细胞为靶细胞,收集T淋巴细胞进行肿瘤细胞杀伤试验。【结果】负载MAGE-A3抗原的DCs激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肝癌细胞有明显的杀伤作用,其对肝癌细胞的杀伤率显著性高于正常肝细胞对照组(P<0.05)。【结论】MAGE-A3蛋白抗原致敏的树突状细胞疫苗可激活特异性的CTL,在体外诱导出较强的对人肝癌细胞株的细胞毒作用。     

树突状细胞诱导肺癌特异性免疫应答治疗裸鼠移植瘤的实验研究

目的 利用树突状细胞递呈肿瘤抗原的能力诱导出肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),用其治疗人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤.方法 外周血单个核细胞体外经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4诱导产生树突状细胞,负载A549肺癌细胞裂解物诱导自体CTL,经细胞毒试验和EUSA测定CTL杀伤活性和细胞因子的分泌.同时制备荷瘤裸鼠模型,不同分组裸鼠一次或多次皮下注射CTL.结果 A549冻融抗原能促进CTL增殖,可诱导产生CTL对A549细胞的特异杀伤,在效靶比为40∶1时杀伤率可达79.6%;一次接种后荷瘤裸鼠肿瘤生长减缓,多次接种肿瘤明显缩小且生存时间较对照组显著延长,具有明显的保护作用.结论 树突状细胞能有效递呈肺癌冻融抗原,诱导产生具有一定治疗功效的抗肿瘤特异性CTL,提示临床应用以树突状细胞为基础的肺癌疫苗免疫治疗具有广阔前景.     

多发性骨髓瘤抗原致敏树突状细胞介导的体外抗瘤活性

目的：探讨多发性骨髓瘤KM3细胞株冻融抗原和弱酸洗脱抗原肽负载树突状细胞（DC）后诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对KM3细胞的杀瘤作用。方法：联合GM-CSF,IL-4和TNF-α,体外诱导单核细胞生成DC,并使其致敏KM3特异性冻融抗原或酸洗脱抗原,然后与自体T淋巴细胞共同培养3d,生成特异性CTL,并采用MTT法检测其对KM3细胞的杀伤率。结果：在细胞因子作用下,体外培养的外周血单个核细胞可诱导分化为成熟的DC;应用KM3肿瘤抗原致敏DC,诱导生成的CTL对KM3肿瘤细胞具有较强的杀伤效应。结论：KM3冻融抗原和酸洗脱抗原激发的DC与自体T淋巴细胞孵育能诱生抗KM3细胞特异性CTL。     

脐血树突状细胞经卵巢癌细胞刺激后抗卵巢癌免疫应答的体外研究

目的研究脐血来源的树突状细胞(DC)的体外扩增培养方法及诱导特异性抗卵巢癌细胞免疫效应.方法①从脐血中分离单个核细胞后,获得单核细胞(Mo).以粒细胞-巨噬细胞集落剂(GM-CSF)、IL-4、集落刺激因子(SCF)和酪氨酸激酶受体Ⅲ配体(Flt-3L)诱导分化扩增,共培养7d后用流式细胞仪进行表型分析;②诱导单核细胞分化的第3天加入人卵巢癌细胞株SKOV3的冻融抗原,共培养4d后获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏的DC与从脐血中分离的同种同体T淋巴细胞共培养6d,获得效应细胞;MTT法检测效应细胞对人卵巢癌细胞株SKOV3、人肝癌细胞株Hu-7的细胞毒作用;结果①脐血来源的Mo在细胞因子的作用下,7d后分化生成成熟的DC,高表达特异性抗原CD83、CD86、CD80、CD1a;②DC可负载并提呈肿瘤抗原,诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生,不同浓度的CTL对卵巢癌细胞株SKOV3均有特异性杀伤、抑制作用(P＜0.05).结论脐血中DC的前体细胞(即单核细胞)可在体外分化扩增为成熟的功能性DC,并可诱导出特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫效应,是一种临床应用前景良好的、方便有效的肿瘤免疫治疗方法.     

树突状细胞疫苗联合CpG-ODN对膀胱肿瘤细胞的免疫学效应研究

目的 探讨负载肿瘤抗原的树突状细胞(DC)疫苗联合含未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)序列的寡脱氧核糖核苷酸(CpG-ODN)对膀胱肿瘤细胞的免疫学效应.方法 用小鼠BTT739细胞反复冻融抗原致敏培养第7天的DC,48h后分别加入CpG-ODN及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导DC成熟,制备负载肿瘤抗原的DC疫苗,灭活后用于刺激T淋巴细胞制备效应细胞(CTL),乳酸脱氢酶释放实验测定各组CTL对BTT739细胞的杀伤活性,ELISA法测定效应细胞培养上清液的干扰素-γ(IFN-γ)水平,同时检测了CTL对自体淋巴细胞的杀伤活性.结果负载肿瘤抗原的DC诱导的效应细胞分泌较高水平的IFN-γ,并对BTT739细胞具有较高的杀伤效应,CpG-ODN活化的DC疫苗诱导的效应细胞分泌IFN-γ水平及对肿瘤细胞的杀伤活性均高于TNF-α活化的DC疫苗诱导的效应细胞(P<0.01).DC疫苗对自体淋巴细胞无明显免疫杀伤活性.结论 CpG-ODN可增强负载肿瘤抗原的DC疫苗对膀胱肿瘤细胞的免疫杀伤效应,并且对自体淋巴细胞无免疫杀伤活性,为膀胱癌的免疫治疗提供了实验基础.     

肝癌细胞HepG2与肝癌患者树突状细胞融合瘤苗的体外效应

目的将肝细胞癌(HCC)患者树突状细胞(DCs)与肝癌细胞HepG2融合制备瘤苗,检测其体外诱导同源T细胞产生特异性抗HepG2的免疫效应.方法以血细胞分离机分离富集HCC患者外周血单个核细胞(PBMCs),应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(rhlL-4)体外诱导培养DCs;聚乙二醇融合DCs与肝癌细胞HepG2,MTT法测定融合细胞(DCs/HepG2)刺激同源T淋巴细胞增殖分化能力,细胞毒性实验检测DCs/HepG2诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HepG2的特异性杀伤作用.结果融合细胞DCs/HepG2高表达成熟DC表面分子,其中CD8390.4%,CD8087.7%,CD8684.4%,HLA-DR98.5%;其刺激同源T淋巴细胞增殖的能力显著高于HepG2和DCs;DCs/HepG2活化的CTL对HepG2具有显著杀伤作用,其杀伤率为(63.5±4.6)%(效靶比例为20∶1).结论HCC患者外周血DC融合HepG2细胞可有效诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗HCC免疫效应,可能成为HCC免疫治疗的有效途径.     

脂肪组织干细胞分化为神经元样细胞研究

目的 :探索脂肪组织提取物 (PLA)细胞分化为神经元样细胞的可能性 ,为PLA细胞分化潜能的研究及其在神经科学领域的应用提供依据。方法 :以大鼠的PLA细胞为实验对象 ,利用 β 巯基乙醇 (β BME)、丁酸酯羟基茴香醚 (BHA)等作为分化诱导因子 ,对各阶段细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果 :诱导培养 2h后 ,大多数存活的细胞转变为类似于神经元的形态 ,分化培养基诱导 5h后 ,从简单的双极细胞到复杂的多极细胞均有出现 ,并可见部分神经元样细胞拉成网状 ,大多数存活细胞表现为NSE染色阳性。结论 :PLA细胞在体外培养条件下 ,可以向神经元样细胞分化。提示PLA细胞可能作为一种新的成体多能干细胞在神经科学领域加以利用。     

呼吸道合胞病毒感染的大鼠气道上皮细胞对树突状细胞的影响

目的探索呼吸道合胞病毒(RSV)感染的气道上皮细胞对大鼠髓系树突状细胞(mDCs)激活和功能的影响,为研究RSV诱发哮喘的机制提供依据。方法大鼠气道上皮细胞株进行培养。在对RSV进行扩增和滴度测定后,以不同作用时间、不同滴度的RSV感染大鼠气道上皮细胞。同时分离、培养扩增大鼠mDCs,采用transwell细胞共培养系统将大鼠气道上皮细胞和大鼠mDCs共培养。其mDCs通过RT-PCR和流式细胞术检测成熟标志物和Th2细胞因子的表达、同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)。结果大鼠mDCs与RSV感染的大鼠气道上皮细胞共培养后出现功能性成熟,包括大鼠mDCs表面共刺激分子MHCⅡ和CD86的表达增多,OX40L和TARC的mRNAs表达增高,大鼠mDCs刺激T细胞增殖的能力增强。结论 RSV感染大鼠气道上皮细胞能够促使大鼠mDCs进一步成熟并且可能具有支持Th2细胞分化和局部聚集的能力,可能是RSV诱发哮喘的一种机制。     

大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经细胞

目的探讨体外β-巯基乙醇(BME)、正规胰岛素(RI)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用.方法取体外扩增至3～4代的大鼠MSCs,分别用BME、RI和bFGF诱导,另设空白对照.诱导后1、5、24 h,计算神经元样细胞的分化率,分别鉴定神经元烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果诱导后1h,BME组分化率最高,5 h时bFGF组分化率最高,与其他组有显著差异(P＜0.01);BME组和RI组各自1h与5h的分化率有显著差异(P＜0.01);bFGF组5 h和24 h的分化率与1 h的分化率有显著差异(P＜0.01),但5 h和24 h的分化率无显著差异(P＞0.05).结论抗氧化剂和神经营养因子能诱导MSCs分化为神经元样细胞,而且具有较高的诱导效率.胰岛素的作用较弱;BME的诱导作用快而短暂;bFGF的诱导作用缓和而持久.     

大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经细胞

目的探讨体外β-巯基乙醇(BME)、正规胰岛素(R I)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用。方法取体外扩增至3~4代的大鼠MSCs,分别用BME、R I和bFGF诱导,另设空白对照。诱导后1、5、24 h,计算神经元样细胞的分化率,分别鉴定神经元烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果诱导后1 h,BME组分化率最高,5 h时bFGF组分化率最高,与其他组有显著差异(P<0.01);BME组和R I组各自1 h与5 h的分化率有显著差异(P<0.01);bFGF组5 h和24 h的分化率与1 h的分化率有显著差异(P<0.01),但5 h和24 h的分化率无显著差异(P>0.05)。结论抗氧化剂和神经营养因子能诱导MSCs分化为神经元样细胞,而且具有较高的诱导效率。胰岛素的作用较弱;BME的诱导作用快而短暂;bFGF的诱导作用缓和而持久。     

大鼠心脏微血管内皮细胞的培养

目的 培养大鼠心脏微血管内皮细胞,探讨其对研究血管病变的意义.方法 采用Nishida的方法,在无菌条件下分离Wistar大鼠心脏,用胶原酶、胰酶进行消化,通过离心,收集细胞进行培养.结果 培养的细胞呈单层贴壁生长,细胞初为圆形,贴壁后为短梭形,5～7 d呈"铺路石样"生长,培养的细胞在人工基膜(Matrigel)上形成管腔样结构.Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定为阳性.结论 本方法简单易行,对血管病变的研究有重要意义.     

地氯雷他定对慢性应激大鼠肠道肥大细胞的影响

目的:探讨地氯雷他定对慢性应激大鼠肠道肥大细胞的变化的影响。方法:将雄性SD大鼠30只随机分为对照组、慢性应激组、慢性应激+地氯雷他定组,每组10只,采用长期中等强度应激造成慢性应激大鼠模型,观察各组大鼠的行为学变化及肠道敏感性的变化并用激光共聚焦显微镜观察各组大鼠肠道的肥大细胞的变化。结果:慢性应激组比对照组表现出明显的焦虑样行为、肠道运动增强、肠道敏感性增加、肠道肥大细胞数目增加(P<0.05);地氯雷他定干预组比慢性应激组的焦虑样行为、肠道运动和肠道敏感性均明显减轻,同时肠道肥大细胞数目减少(P<0.05)。结论:慢性应激大鼠肠道敏感性增加;地氯雷他定能能通过控制肥大细胞的活动减轻慢性应激大鼠肠道高敏感。     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为心肌样细胞的条件。方法抽取大鼠骨髓,采用贴壁培养法分离MSCs进行培养、传代,在第4代MSCs中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)对其进行诱导分化,观察细胞形态学的变化,应用荧光免疫组织化学方法进行鉴定。结果大鼠MSCs贴壁呈集落生长,有成纤维细胞样外观。诱导后细胞呈梭形,排列方向渐趋一致,有肌管样结构形成,肌钙蛋白及Connexin43表达强阳性。结论大鼠MSCs体外在5-氮胞苷作用下可定向分化为心肌样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞样细胞分化

目的：研究大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)离体分离和培养方法,诱导MSCs向神经细胞样细胞分化。方法：通过梯度离心从大鼠骨髓中分离有核细胞,进行培养,去除不贴壁的细胞,分离纯化MSCs,对其生长特性进行分析。分别用硫代甘油和β-巯基乙醇对MSCs诱导分化,观察细胞形态变化,免疫组化检测分化细胞中nestin,神经元特异性烯醇化酶(NSE),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,进行鉴定。结果：用含15％胎牛血清(FCS)的L—DMEM培养MSCs,原代细胞贴壁生长,细胞形态均一,为纺锤形,有克隆形成。传代培养时,形态变为成纤维细胞样,生长特征呈“S”形,有较强的增殖能力,于第10代以后开始出现衰老征象。MSCs经硫代甘油和巯基乙醇诱导分化后,细胞形态发生改变,nsetin,NSE和GFAP阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞。结论：大鼠MSCs可以离体分离,培养,并能诱导向神经细胞样细胞分化。     

大鼠内淋巴囊免疫活性细胞的观察

目的 研究正常大鼠内淋巴囊免疫活性细胞的定位分布。方法 用10只健康成年SD大鼠，取颞骨经固定、脱钙后作冰冻切片，以抗大鼠CD3、抗IgA、抗IgG和抗IgM特异性抗体，运用免疫组织化学技术，观察内淋巴囊的活性细胞。结果 发现CD3^ ,IgA^ ,IgM^ 细胞存在于内淋巴囊的所有组织学部位，以上皮层为多，同时散在分布于上皮以下囊周组织。结论 大鼠内淋巴囊存在着各类免疫活性细胞，提示内淋巴囊在内耳免疫应答中发挥重要作用。     

大鼠肾组织干细胞的分离培养与鉴定

目的 分离培养及稳定扩增大鼠肾组织干细胞（kidney stem cell,KSC）,并鉴定其生物学特征及干细胞特性。方法 从4周龄雄性SD大鼠双肾肾乳头处分离培养KSC,倒置显微镜下观察细胞形态特征,通过流式细胞、免疫荧光技术鉴定KSC的表型特征,通过成骨、成脂诱导分化鉴定其分化能力,并通过实时定量荧光PCR（quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR）比较KSC与大鼠肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cell, RTEC）基因表达的差异。结果 KSC呈纺锤形或树枝状生长;免疫荧光结果显示KSC可表达平滑肌肌动蛋白（alpha-sooth muscle actin,α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）、神经钙粘蛋白（N-Cadherin）、神经巢蛋白（Nestin）、CD133,不表达钙粘蛋白-E（E-Cadherin）、细胞角蛋白(cytokeratin-18,CK-18)、紧密连接蛋白（zona occludens protein-1,ZO-1）;细胞流式结果显示,CD29、CD90、CD73表达比率分别为99.0%、95.8%和99.9%,CD45阳性率为3.4%;干细胞标记CD133和Nestin阳性率分别为33.2%和70.2%,双阳性率为31.4%;成脂诱导后油红O染色呈红色,成骨诱导后早期成骨细胞分化标志茜素红染色呈橙红色;qRT-PCR结果显示,与RTEC相比,原始胚胎干细胞标记物Nanog、Oct4/pou5f1、Sox2/sry-box-2的mRNA表达量在KSC中增高（ P<0.01）,间质标记物α-SMA、Vimentin mRNA表达量在KSC中增高（ P<0.01）,而成熟的上皮细胞标记物E-Cadherin、CK18mRNA表达量在KSG中降低（ P<0.01）。结论 肾乳头部位可以分离培养并稳定扩增出具有间充质干细胞特性的KSC。