反转录—聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测的应用

为呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）感染的临床诊断寻求敏感，特异的检测方法，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增毒培养液和急性呼吸道感染患者鼻咽分泌物中的ＲＳＶ基因，并应用地高辛标记ｃＤＮＡ探针对扩增产物进行鉴定。结果成功地提取了ＲＳＶｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经扩增得到４７１ｂｐ左右ｃＤＮＡ区带。流感病毒Ｂ，副流感病毒２型，腺病毒７对照无扩增带，ＲＳＶ培养液１０倍连续稀释至１：１０００，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增仍可见４     

一种快速诊断呼吸道合胞病毒感染的方法

应用引物设计原则，选择呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）基因组中高度保守的Ｆ基因作为扩增靶序列，独立设计合成了两对引物，建立了一个逆转录套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测ＲＳＶ ＲＮＡ的方法。提示：该方法具有快速、敏感，特异和观察结果客观等优点。     

套式聚合酶链反应检测丙肝病毒核酸

对７０例血清谷丙转氨酶（ＡＬＴ）异常、疑是丙型肝炎（ＨＣＶ）患者血清标本，用ＨＣＶ基因５＇非编码区引物作套式聚合酶链反应（套式ＰＣＲ），扩增产物为２６０ｂｐ，结果显示５２例丙型肝炎病毒核酸（ＨＣＶ－ＲＮＡ）阳性，１８例阴性，阳性率为７４．２％。１０例助血员血样ＨＣＶ－ＲＮＡ均为阴性。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析，阳性ＰＣＲ产物为ＨＣＶ－ＲＮＡ所特异。作者认为，采用高保守区核苷酸序列引物作套式ＰＣＲ检测ＨＣＶ－ＲＮＡ，可提高实验的敏感性和特异性。     

PCR法在疱疹病毒性脑炎诊断及疗效观察中的应用

选择疱疹病毒科病毒ＤＮＡ多聚酶基因高保守区中的一对引物，一次ＰＣＲ可同时扩增疱疹病毒科的４种病毒［单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ１）、单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ２）、ＥＢ病毒（ＥＢＶ）、及巨细胞病毒（ＣＭＶ）］相应的ＤＮＡ片段。根据扩增产物分子的大小及对扩增产物酶切分析，可将标本中的４种病毒准确分型。用该法检测临床疑为病毒脑炎患者和其他中枢神经系统疾病患者（对照组）的脑脊液（ＣＳＦ），脑炎组ＣＳＦ阳性率３０％（９／３０），对照组ＣＳＦ阳性率６．７％（２／３０）；其中８例为ＨＳＶ１阳性，２例为ＣＭＶ阳性，１例为ＨＳＶ２阳性。２例病毒脑炎患者经用无环鸟苷抗病毒治疗７～１０ｄ后其ＣＳＦ中的ＨＳＶ１ＤＮＡ由阳转阴。由此说明ＰＣＲ法不仅可早期诊断疱疹病毒性脑炎，还可显示抗病毒药物的疗效。     

多重聚合酶链反应检测新生儿性别决定基因

目的为了提高聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）检测人类性别决定基因（ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＹ，ＳＲＹ）的检出阳性率，建立了多重ＰＣＲ检测方法，使其准确度提高，保证实验准确无误。方法使用自行设计的一对引物（Ａ）与日本学者的引物对（Ｃ），同时对ＳＲＹ基因进行扩增的多重ＰＣＲ检测（ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｓ，ｍｕｌｔｉｐｌｅＰＣＲ）方法。引物对Ａ扩增ＳＲＹ基因的产物为２８０ｂｐ（Ｙ）；引物对Ｃ作为实验内对照，其扩增产物为３５５ｂｐ（Ｙ）和５９０ｂｐ（Ｘ）。结果用这一多重聚合酶链反应技术测定了２０６例新生儿脐静脉血ＳＲＹ基因。其中１０５例男性标本均出现２８０、３５５和５９０ｂｐ三条扩增带；１０１例女性标本仅有一条５９０ｂｐ扩增带。结果证明本实验的特异性很好并且没有出现假阴性现象。结论两对引物同时扩增使实验更加准确，特别是使用了内对照，可以观察反应是否成功，起到了双保险的作用。避免了假阴性出现是本实验设计的主要特色。     

呼吸道病毒单克隆抗体快速检测645例临床分析

为满足临床快速检测呼吸道病毒的需要。应用系列单克隆抗体ＡＰＡＡＰ桥联技术，对６４５例患者进行了流感病毒Ａ（ＦｌｕＡ）、流感病毒Ｂ（ＦｌｕＢ）、副流感病毒２（ＰＩＶ２）、副流感病毒１．３（ＰＩＶ１．３）、腺病毒（ＡｄＶ３．７）以及呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）的检测；其中１０９例同时取鼻部和咽部分泌物作配对检测，５６例确定为ＡｄＶ、ＲＳＶ阳性者，取血清标本用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）作特异性试验。结果，呼吸道感染组４４６例中检出２０８例（４６．６％），非感染性疾病组１９９例中检出２８例（１４．１％）；呼吸道感染组中儿童组检出率（５２．８％）高于成人组（４２．６％），二者感染的病毒种类也不相同；咽部分泌物的检出率（８１．７％）明显高于鼻部分泌物的检出率（３２．１％）。ＡｄＶ、ＲＳＶ抗原及抗体检测的符合率达９２．３％以上，分析表明，单克隆抗体快速检测有较高的特异性，且简便、快捷，能满足临床需要。     

用PTVS检测t（14；18）PCR产物的DNA序列

为确定聚合酶链反应（ＰＣＲ）和地高辛（ＤＩＧ）系统检测ｔ（１４；１８）的特异性，我们采用ＰＧＥＭ－Ｔｖｅｃｔｏｒ系统（ＰＴＶＳ）和双脱氧链终止技术克隆并测定了ＲＬ细胞系和一个ＮＨＬ患者－Ａｍｂｒｏｓｅｎ的ｔ（１４；１８）ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序列。结果表明两者的ＰＣＲ扩增产物均为ｂｃｌ－２－ＪＨ融合基因片段，证实ＰＣＲ－ＤＩＧ系统是一种特异的检测ｔ（１４；１８）的方法。同时还表明用ＰＴＶＳ对ＰＣＲ。产物进行克隆测序优于直接用双脱氧法测序。     

逆转录—半套式聚合酶链反应检测汉坦病毒RNA及其临床初步应用

目的：建立可用于汉坦病毒检测的ＲＴ－ＰＣＲ方法，并对其临床应用进行初步研究，方法：比较７６－１１８株和ＳＲ－１１株Ｓ基因序列，选择其保守区设计半套式引物，通过病毒培养上清及患者血清的扩增检测进行ＰＣＲ方法的敏感性，特异性及临床应用研究。结果所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法可检出１．２５ＰＦＵ的病毒量；对照组（正常细胞培养上清和正常人血清）经扩增检测为阴性，８６份级ＩＦＡ检测抗ＨＶ－ＩｇＭ阳性的肾综合征出血     

人宫颈癌多基因致癌机理的研究

应用核酸分子杂交、ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＡＳＯ杂交等技术，对人宫颈癌中Ｈａ－ｒａｓ等三种癌基因、ＨＰＶ１６病毒基因及Ｐ５３、Ｒｂ抑癌基因等多基因变化及其致癌机理进行了研究。结果表明：①宫颈癌中存在Ｈａ－ｒａｓ第１２位密码子Ｇ→Ｔ点突变，突变率为１８．２％（８／４４），并有Ｈａ－ｒａｓ基因扩增，扩增率为４５％（９／２０）；②ｃ－ｅｒｂＢ２基因在宫颈癌中的扩增率为７３．３％（１１／１５），５例伴有重排；③ｃ－ｍｙｃ基因在宫颈癌中的扩增率为９１．７％（１１／１２）；④ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７为引物的ＰＣＲ检测结果，宫颈癌中的阳性率为８０．５％（３３／４１）；⑤１２例宫颈癌中未发现Ｐ５８、Ｒｂ基因缺失。上述多基因致癌机理的研究表明，人宫颈癌中Ｈａ－ｒａｓ、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｅｒｂＢ２经点突变、扩增、重排而被激活，在癌变中起着协同致癌作用。ＨＰＶ１６基因的整合可能启动ｃ－ｍｙｃ，为癌变的起始因素，而Ｈａ－ｒａｓ、ｃ－ｅｒｂＢ２的基因改变可能为中、晚期事件，抑癌基因Ｐ５３、Ｒｂ的作用尚需进一步研究。     

PCR—谱酶法检测小儿肝炎综合征人疱疹解毒DNA的研究

为探讨婴儿肝炎综合征（ＮＨＳ）与疱疹病毒（ＨＳＶ）感染的关系。在疱疹病毒高度同源序列ＤＮＡ聚合酶基因中设计一对引物，能对ＨＳＶ－Ｉ、ＨＳＶ－Ⅱ、ＥＢＶ和ＣＭＶ四种疱疹病毒ＤＮＡ进行扩增，继而用凝胶电泳和限制性内切酶ＢａｍＨⅠ或ＳｍａⅠ酶切分析扩增产物进行鉴别，建立了能一次性分型检测上述四种病毒的ＰＣＲ－酶谱法。灵敏度可测到１ｆｇＤＮＡ，且该引物仅对四种疱疹病毒扩增。用建立的ＰＣＲ－酶谱法检测３０例     

用PCR技术及常规病毒学检测诊断呼吸道合胞病毒感染的方法学比较

分别采用病毒分离法、免疫荧光法及NestedPCR、RT－PCR十核酸探针杂交实验对78例呼吸性疾病患儿鼻腔抽吸物标本中呼吸道合胞病毒（RSV）的感染水平进行了检测。结果表明，在这4种检测方法中，以NestedPCR（巢式PCR）法最为敏感、稳定，RSV感染的阳性率为29·49％，且省时，准确。     

双重荧光实时RT-PCR技术鉴定H9N2亚型禽流感病毒

采用双重荧光实时RT-PCR技术,建立一种简便易行的H9N2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒H9N2亚型的HA和NA基因序列,设计特异性针对HA和NA的引物,分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针,构建双重实时荧光PCR一步法反应体系,同时检测样本中的HA和NA基因。结果显示:扩增曲线和特异性实验结果显示,该体系具有很好的扩增效率,且仅特异性识别H9N2亚型AIV的HA、NA基因,与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用重组质粒pMD19-T构建HA、NA阳性质粒,10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。结果证实,本研究所建立的双重荧光定量RT-PCR体系敏感性能达到10个RNA拷贝数。采用本方法检测60份感染动物样品及60份环境样品,与传统PCR方法相比,检测敏感性提高了100倍;与病毒分离鉴定方法比较,二者的鉴定结果完全吻合。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速易操作等优点,是H9N2亚型禽流感病毒鉴定的有效方法。     

彭州地区295例住院患儿呼吸道病毒检测分析?

目的：分析彭州地区295例住院患儿呼吸道病毒检测情况。方法采用直接免疫荧光法对295例住院患儿的鼻拭子进行腺病毒(adenovirus,ADV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、甲型流感病毒(influenza A,IA)、乙型流感病毒(influenza B,IB)和副流感病毒1、2、3型(parainfluenza 1、2、3,PIV1、PIV2、PIV3)7种病毒的检测,分析各种病毒检测情况。结果295例患儿病毒总阳性率34.58%(102/295),阳性率最高为 RSV(20.68%)。<1岁、1~3岁、3~7岁和≥7岁组病毒感染阳性率分别为47.25%、30.92%、27.27%和15.79%。急性上呼吸道感染及急性支气管炎患儿中以 IB 感染为主,阳性率分别为11.11%和16.00%,毛细支气管炎及肺炎患儿中以 RSV 感染为主,阳性率分别为40.00%和30.00%。结论彭州地区最常见的住院患儿感染病毒为 RSV,且7种病毒在不同年龄、不同呼吸道感染疾病中具有不同分布特点。     

小儿肺炎的病毒性病原学研究

目的:探讨小儿肺炎的病毒性病原学特点.方法:应用直接免疫荧光法,连续3年对13 642例住院肺炎患儿呼吸道分泌物中呼吸道合胞病毒(RSV),副流感病毒(PIV) 1、2、3型,流感病毒(IV)A型、B型和腺病毒(ADV)抗原进行检测.结果:病毒性肺炎占34.3%,其中RSV占25.8%,PIV4.7%,IV A 2.4%,IV B 0.2%,ADV 1.3%.RSV在≤1岁组检出率 33.1%,>1～3岁组19.7%,>3岁组5.1%(趋势χ2=763.4,P<0.001).ADV肺炎,>1～3岁组与>3岁组分别为2.3%及2.5%,均高于≤1岁组的0.7%(P<0.01).>1～3岁组IV A检出率3.4%,高于≤1岁组(χ2=18.2,P<0.01).>1～3岁组PIV 1肺炎占1.2%,较其它年龄组高(P<0.05).PIV 3,≤1岁组检出率 4.7%,>1～3岁组3.2%,>3岁组1.4%(趋势χ2=52.4,P<0.01).RSV感染率11月开始明显增高,持续到次年的3～4月份,但每年仍有差别.肺炎中RSV月感染率最高62.8%,IV A达15.7%.结论:小儿肺炎的病毒性病原,感染率高低依次为RSV、PIV、IV和ADV.RSV、PIV 3,年龄越大检出率越低.≤1岁婴儿ADV感染较少.幼儿较婴儿易致IV A感染.RSV流行见于冬春季,但存在变化.     

肺炎衣原体荧光PCR检测方法的建立和应用

目的采用Taqman探针技术,组建肺炎支原体荧光PCR基因检测方法。方法对GenBank登录的肺炎衣原体的基因序列进行生物信息学分析,针对保守区域设计引物和探针,组建实时荧光PCR检测方法。对来自本院的560份临床咽拭子样本和肺泡冲洗液样本进行检测。采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价。结果本实时荧光PCR方法对甲型流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒无特异性反应。本院的临床样本检出26份,其中咽拭子9份,肺泡冲洗液17份。结论肺炎支原体荧光PCR检测方法可用于肺炎衣原体感染的辅助诊断。     

前列腺特异性膜抗原cDNA的克隆及用于临床前列腺癌的检测

目的获得前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因,应用巢式反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测前列腺癌(PC)患者外周血中PSMA mRNA.方法从人前列腺癌细胞系LNCaP中提取总RNA,经RT-PCR扩增PSMA基因,克隆入pUC19质粒中,用全自动荧光测序仪测定其序列.根据PSMA cDNA序列设计合成引物,应用巢式RT-PCR方法检测36例PC患者和23例前列腺增生(BPH)患者外周血中PSMAmRNA,结果与巢式RT-PCR方法检测前列腺特异抗原(PSA)mRNA比较.结果获得了PSMA基因(由2 253 bp组成,可编码751个氨基酸),与已发表的PSMA cDNA序列一致.应用巢式RT-PCR方法检测PC患者外周血PSMA mRNA灵敏度和特异度分别为66 7%和100.0%,与巢式RT-PCR方法检测PC患者外周血PSA mRNA(灵敏度和特异度分别为30.6%和87.0%)比较差异显著.结论成功地克隆了PSMA基因并应用于临床PC诊断,巢式RT-PCR方法检测患者外周血中PSMA mRNA在PC诊断中的真实性和可靠性明显优于PSA mRNA.     

小儿呼吸道人偏肺病毒感染25例流行病学和临床特征分析

目的 探讨小儿呼吸道人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)的感染阳性率、流行病学及其临床特征.方法 2002年12月至2003年12月在本科固定时间收集新入院的急性呼吸道感染患儿的鼻咽分泌物,一式两份.1份采用免疫荧光快速诊断方法用于分析包括呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、腺病毒(adenovirus)、流感病毒(influenza virus) A、B副流感病毒(parainfluenza virus)1、2、3 这7种常见呼吸道病毒;另1份采用RT-PCR的方法检测上述患儿鼻咽分泌物中hMPV的L基因和M基因,鼻病毒与冠状病毒的基因.结果 检出 hMPV阳性标本25例,阳性率为9.7%,主要分布在秋冬季;25例hMPV阳性标本中单纯hMPV感染10例,占40%,15例(60%)系hMPV与其他病毒合并感染,其中包括8例hMPV与RSV合并感染,hMPV与鼻病毒、冠状病毒合并感染各2例,3例标本同时检出hMPV、RSV、鼻病毒为阳性;分析hMPV阳性呼吸道感染患儿的临床特征:男:女=16:9,12例(48%)临床诊断为毛细支气管炎,9例(36%)临床诊断为肺炎,4例(16%)为哮喘急性发作患儿,除hMPV和其他病毒合并感染更容易出现发热外,单纯hMPV感染与hMPV与其他病毒混合感染在发病年龄、性别、病程及临床表现上无明显差异.结论 hMPV是小儿急性呼吸道感染的重要病原,可与呼吸道其他常见病毒混合感染,仅从临床表现上很难将hMPV感染与其他呼吸道病毒感染区别.     

2009年海南省甲型H1N1流感病毒核酸检测结果

目的及时了解海南省2009年流感样病例及其密切接触者中甲型H1N1流感病毒感染情况。方法应用实时荧光定量PCR法对呼吸道鼻咽拭子标本中的流感病毒核酸进行定性检测。结果全年共检测哨点监测和爆发疫情标本1 148份,荧光定量PCR法检测结果：流感病毒A型核酸阳性为686份,B型核酸阳性为7份。流感样病例中流行型别以A型为主,占59.6%;A型中甲型H1N1流感病毒核酸阳性为500例,占72.9%（500/686）,其中学生占84.8%（424/500）。10月-11月份达到流行高峰。随机抽取30份核酸阳性标本进行核酸序列测定,27份为甲型H1N1流感病毒。结论 2009年海南省流感样病例中甲型H1N1流感病毒感染主要以学生为主,开展流感病毒核酸检测,有助于尽早了解流感样病例中流感病毒感染情况,为及时了解甲型H1N1流感疫情的动态变化以及制定科学有效的甲型H1N1流感防控策略提供可靠的实验室依据。     

广州地区急性呼吸道感染患者的病毒检出情况

【目的】 了解广州医学院第二附属医院急性呼吸道感染就诊人群病毒流行病学特征。【方法】 采用多重RT-PCR法,对2006.9至2009.8广州医学院第二附属医院门诊急性呼吸道感染患者鼻咽拭子检测呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(HRV)、流感病毒A型(FluA)、流感病毒B型(FluB)、人偏肺病毒(HMPV)及腺病毒(ADV)、副流感病毒(PIV)、冠状病毒(HCoV)8种病毒,分析其年份、季节及年龄分布特点。【结果】 3年共收集1388例标本,病毒检出率40.634%,RSV毒检出率最高(17.8%),其检出率逐年下降(P = 0.000);HMPV检出率于第2年升高(P = 0.016),第3年下降(P = 0.000)。RSV春季检出率高(P = 0.009);HRV秋季检出率高(P = 0.001);PIV春季检出率高(P = 0.000),夏季(P = 0.023)、冬季(P = 0.048)检出率低;FluA夏季检出率高(P = 0.000);HMPV春季(P = 0.05)、秋季(P = 0.01)检出率高。各季节不同病毒检出率有差异:春季,RSV(P = 0.000)及HRV(P = 0.004)检出率较高;夏季,HRV(P = 0.000)及FluA(P = 0.000)检出率较高;秋季,HRV(P = 0.000)检出率较高;冬季,HRV(P = 0.002)及RSV(P = 0.000)检出率较高。各年龄段病毒分布有差异:RSV(P = 0.004)、HRV(P = 0.029)及HMPV(P = 0.001)于 < 3岁组检出率较高;ADV(P = 0.000)与Flu B(P = 0.011)于3 ~ < 14岁组检出率较高;Flu A(P = 0.011)于14 ~ < 40岁组检出率较高。【结论】 病毒有季节流行趋势,RSV春季流行,FluA夏季流行,HRV则全年高发;病毒检出率与年龄有相关性,RSV、HRV及HMPV检出多见于婴幼儿,ADV与Flu B多见于3 ~ < 14岁人群,Flu A于14 ~ < 40岁组检出率较高。RSV检出率最高,并有年份强势流行趋势;且是各年龄组急性上呼吸道感染的主要病毒之一。     

0～2岁婴幼儿呼吸道病毒监测及临床特征分析

目的 了解绍兴市妇幼保健院0～2岁婴幼儿急性呼吸道感染病毒病原学构成及临床特征,为临床诊疗提供参考。方法 2011年10月—2013年9月绍兴市妇幼保健院住院的呼吸道感染患儿共3677例。采集每例患儿鼻咽吸取物1份,用荧光免疫方法进行病毒检测,包括呼吸道合胞病毒、流感病毒A和流感病毒B、副流感病毒1、2、3、腺病毒。结果 总的病毒阳性检出率25.40%。检出率较高的前3位病毒分别为呼吸道合胞病毒55.03%（514/934）,其流行月份在1～2月和11～12月;副流感病毒3,占17.24%（161/934）,其流行月份在5～8月;流感病毒A,占10.06%（94/934）,其流行月份在3～5月。0～3月患儿主要感染呼吸道合胞病毒（22.84%）,1～2岁患儿流感病毒A感染（3.82%）及腺病毒感染（3.73%）也较常见。呼吸道合胞病毒主要引起肺炎及毛细支气管炎,临床表现以咳嗽、气喘为主;流感病毒A、腺病毒主要引起上呼吸道感染,临床表现以发热为主。结论 病毒是0～2岁婴幼儿急性呼吸道感染的主要病原,以呼吸道合胞病毒、副流感病毒3较为多见,其感染存在季节性特征,临床特征有差异,在临床诊疗时应加以注意。