双重荧光实时RT-PCR技术鉴定H9N2亚型禽流感病毒

采用双重荧光实时RT-PCR技术，建立一种简便易行的H9N2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒H9N2亚型的HA和NA基因序列，设计特异性针对HA和NA的引物，分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针，构建双重实时荧光PCR一步法反应体系，同时检测样本中的HA和NA基因。结果显示:扩增曲线和特异性实验结果显示，该体系具有很好的扩增效率，且仅特异性识别H9N2亚型AIV的HA、NA基因，与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用重组质粒pMD19-T构建HA、NA阳性质粒，10倍梯度稀释液为模板，进行荧光定量PCR。结果证实，本研究所建立的双重荧光定量RT-PCR体系敏感性能达到10个RNA拷贝数。采用本方法检测60份感染动物样品及60份环境样品，与传统PCR方法相比，检测敏感性提高了100倍；与病毒分离鉴定方法比较，二者的鉴定结果完全吻合。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速易操作等优点，是H9N2亚型禽流感病毒鉴定的有效方法。