登革病毒高度保守的HLA-A*1101限制性T细胞表位鉴定和体内免疫反应研究

目的：鉴定登革病毒2型（DENV-2）HLA-A*1101限制性T细胞表位并探讨其诱导的T细胞反应的特征。方法：基于DENV-2的氨基酸序列,采用T细胞表位预测软件预测HLA-A*1101限制性候选T细胞表位;基于HLA-A*1101转基因小鼠,采用ELISPOT实验、ELISA实验和CD8+T细胞（CTL）杀伤实验研究候选表位的HLA-A*1101限制性和所诱导的T细胞反应的特征。结果：在合成的14条候选表位中,9条肽（NS1161-170、NS1263-272、NS36-15、NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80）免疫HLA-A*1101转基因小鼠可诱导产生肽特异性分泌IFN-γ的T细胞。除了分泌IFN-γ,C58-67和NS3576-584特异性T细胞也可分泌TNF-α,而E30-38特异性T细胞更可同时分泌TNF-α和IL-6。DENV-2感染的HLA-A*1101转基因小鼠体内也可检测到针对NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80的分泌IFN-γ的T细胞。采用上述6条肽的混合物免疫HLA-A*1101转基因小鼠所诱导的效应细胞可显著杀伤DENV-2感染的小鼠脾单核细胞。结论：本研究鉴定出了9条全新的DENV-2特异性HLA-A*1101限制性T细胞表位。     

丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的构建

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探讨其体内免疫学效应。方法:基于我们前期从HCV中鉴定的4条HLA-A*0201限制性CTL(细胞毒性T细胞)表位(NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180),2条HLA-A*1101限制性CTL表位(NS3609-617和NS5b251-259),1条HLA-A*2402限制性CTL表位(NS5b382-390)和2条Th(辅助性T细胞)表位(P73-15和NS5A276-288),合成编码串联CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表达质粒pc DNATM3.1/myc-His(-)A;阳性重组质粒分别免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402转基因小鼠,采用ELISPOT实验和CTL杀伤实验检测小鼠脾细胞内单个CTL表位特异性T细胞的水平及其杀伤靶细胞的效应。结果:合成了含有Kozak序列和编码Igκ信号链序列、7条CTL表位、2条Th表位的基因序列并顺利克隆入了真核表达质粒。阳性重组质粒免疫三种转基因小鼠后,采用ELISPOT实验检测到小鼠脾细胞内存在单个CTL表位特异性分泌IFN-γ的CTL,后者可杀伤负载单个CTL表位的脾细胞。结论:成功构建了可诱导CTL反应的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。     

丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL表位免疫学效应研究

目的：研究前期实验鉴定的2条丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL（活化的CD8＋T细胞）表位的体内外免疫学效应。方法：采用丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL表位肽C_181（LLSCLTTPV）和NS2_172（VLQAGLIRV）分别体外刺激HLA-A＊0201阳性健康志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）和免疫HLA-A＊0201转基因小鼠,采用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）/流式细胞术检测表位肽特异性CD8＋T细胞的水平。结果：C_181和NS2_172诱导HLA-A＊0201阳性PBMCs产生了高水平的肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ＋CD8＋T细胞;在C_181和NS2_172免疫的HLA-A＊0201转基因小鼠脾细胞中检测到了肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ＋CD8＋T细胞。结论：C_181和NS2_172具有较好免疫学效应,有望用于研发CTL表位肽疫苗。     

丙型肝炎病毒HLA-A＊1101和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位的研究

目的：鉴定出丙型肝炎病毒（HCV）特异性HLA-A＊1101限制性和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.方法：采用T细胞表位预测软件SYFPEITHI预测HCV特异性CD8＋T细胞表位,合成HLA-A＊1101限制性、A＊2402限制性候选表位;建立永生化的HLA-A＊1101阳性、A＊2402阳性B细胞株,采用竞争性肽结合实验检测候选表位与HLA-A＊1101或A＊2402分子的结合力;候选表位体外分别刺激HLA-A＊1101阳性或A＊2402阳性HCV感染者外周血单个核细胞（PBMCs）后,采用酶联免疫斑点（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）实验分别检测肽特异性分泌γ-干扰素（IFN-γ）的细胞的水平和（肝） 异性IFN-γ＋CD8＋T细胞的水平.结果：5条HLA-A＊1101限制性候选表位中,NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（VVFSDMETK）与HLA-A＊1101分子具有高结合力.3条HLA-A＊2402限制性候选表位中,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）与HLA-A＊2402具有高结合力;在HLA-A＊1101阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3 609和NS2_165特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞,而在HLA-A＊2402阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b 382特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞.结论：本研究证实NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（WFSDMETK）为全新的HCV特异性HLA-A＊1101限制性CD8＋T细胞表位,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）为全新的HCV特异性HLA-A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.     

登革病毒非结构蛋白1 氨基端抗原性分析及其检测登革病毒感染动物血清

目的    精确分析登革病毒(dengue virus,DENV)非结构蛋白1（non-structural protein 1, NS1)氨基(N)端抗原性和免疫原性,探讨NS1 N端多肽用于分型检测DENV感染可行性。方法    合成4型DENV 标准株NS1蛋白 N端1-15氨基酸残基序列多肽（D-1 P1、D-2 P1、D-3 P1和D-4 P1）,采用ELISA方法检测多肽同DENV NS1 血清型特异性单抗和各型DENV分别免疫小鼠血清的反应性,竞争抑制法进一步验证单抗和对应多肽反应特异性。分析4型DENV 标准株NS1 N端1-15氨基酸残基序列多肽在Pubmed中已报道的各型DENV分离株中的保守性。结果     6株DENV 1型特异性单抗（5A48A3, 5A65A2, 5B29A1, 5B71A8, 5C29A3和5E68A17）特异性的同D-1 P1;6株DENV-2 NS1型特异性单抗（5D21A1、5E19A5、 5A62A12、5A70A4、5E30A5和5E48A15）特异性的同D 2 P1反应。D-1 P1仅识别DENV 1免疫小鼠血清, 其他多肽同各型DENV 1免疫小鼠血清反应无差异。DENV-1、2、3、4 NS1 N端保守性依次为98.96%、89.09%、83.58%和57.81%。结论     DENV-1 NS1 N端是DENV-1血清型特异性优势线性表位,该多肽可用于研制诊断DENV-1感染试剂盒;DENV-2 NS1 N端是DENV-2血清型特异性表位,以上研究有助于DENV亚单位疫苗和DENV感染分型诊断试剂盒的研制。     

原发性胆汁性肝硬化患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶特异性CD8+CTL表位预测及鉴定

目的鉴定原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶(PDC-E2)上的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,为临床探索特异性免疫治疗奠定基础.方法应用数据库SYFPEITHI预测PDC-E2上两段涵盖B细胞表位和CD4 T细胞表位的氨基酸序列(163～184aa和36～49aa)附近可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,再通过T2细胞株、细胞增殖试验和细胞毒性检测分别分析各抗原肽与HLA-A*0201的结合力、诱导患者外周血单个核细胞(PBMCs)增殖能力及抗原肽诱导的抗原特异性T细胞杀伤毒性,逐步鉴定HLA-A*0201限制性CD8 CTL细胞表位.结果数据库初步预测到5个可能性较大的HLA-A*0201限制性抗原肽,其中两个抗原肽(159～167aa和165～174aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有较高的亲和力,这两个抗原肽能刺激大部分HLA-A*0201阳性PBC患者PBMC增殖,并且由其诱导产生的CTL具有特异杀伤活性.结论位于PDC-E2内酯酰区上的KLSEGDLLA(159～167aa)和LLAEIETDKA(165～174aa)是PBC患者体内HLA-A*0201限制性的CD8 CTL表位.     

结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的:预测及鉴定结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,为基于表位的结核疫苗研究提供依据.方法:应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HLA-A*0201分子的亲合力,选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞,检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性,逐步鉴定出Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位.结果:SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA-A*0201分子的抗原肽,其中3个抗原肽(170～178 aa、317～325 aa和144～153 aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有高结合力,而抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)能够诱导大多数HLA-A*0201阳性结核患者及PPD( )健康志愿者产生特异性CTL细胞,并分泌大量的IFN-γ,能够诱导CTL体外发生增殖,能够产生特异性杀伤活性.结论:成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,可作为结核疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础.     

HLA-A* 0201限制性GPC3表位肽的初步预测与筛选

目的:筛选HLA-A*0201限制性GPC3优势表位肽,为肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)特异性的免疫细胞治疗提供新的靶标。方法:通过表位预测网站初步筛选HLA-A*0201限制性GPC3表位肽,T2细胞结合实验筛选优势表位肽。结果:通过三大常用的表位预测网站,共筛选了13个评分较高的表位肽,化学合成表位肽,采用T2细胞结合实验显示,有4个表位肽与HLA-A2呈现较高亲和力。结论:抗原表位预测网站结合T2细胞结合实验能初步筛选亲和力较高的HLA-A*0201限制性GPC3表位肽,可能用于HCC特异性CTL治疗的候选标靶。     

轮状病毒结构蛋白VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位的初步鉴定

目的预测并初步鉴定轮状病毒Wa株结构蛋白VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位,为轮状病毒免疫保护机制研究及疫苗的研制奠定基础.方法应用表位亲和力预测软件SYFPEITHI及蛋白酶切位点预测软件PAProc和Fragpredict相结合预测VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位;用分子模拟对候选肽作进一步筛选;标准Fmoc方案合成候选肽,RP-HPLC纯化、分析,质谱进行鉴定;最后用T2细胞株测定候选肽与HLA-A*0201分子的亲和力及稳定性.结果结合SYFPEITHI、蛋白酶切位点预测结果及分子模建结果,选择分值最高同时在C-末端含有蛋白酶切位点的4条肽作为候选表位肽;标准Fmoc方案合成的各肽纯度均大于95%,质谱检测结果表明,各肽的相对分子质量与理论值基本一致;在候选的4条表位肽中,TLLANVTAV(340-348)和VLADANETL(333-341)与HLA-A*0201呈高亲和力结合,荧光系数(flurorescene index,FI)分别为2.66和2.64,同时肽-HLA-A*0201复合物半数解离时间(dissociation complex50,DC50)均大于8 h.结论TLLANVTAV(340-348)和VLADANETL(333-341)为潜在的HLA-A*0201限制性CTL表位.     

结核杆菌抗原CFP21/MTB12/Rv3881 C的HLA限制性细胞毒T淋巴细胞表位预测

目的:预测结核杆菌分泌抗原CFP21/MTB12/Rv3881c的HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法:利用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL方法预测分析抗原CFP21/MTBl2/Rv3881c的HLA-A*0201限制性CTL表位,进一步运用NetCTL方法对抗原CFP21/MTB12/Rv3881c的HLA-A其他等位基因和HLA-B限制性CTL表位进行预测分析.结果:初步筛选出3个候选抗原HLA-A*0201限制性CTL优势表位各4条,分别为CFP21 5-13、13-21、134-142、189-197;MTB12 26-34、36-44、40-48、61-69;Rv3881c 204-212、207-215、234-242、260-268.得到3个候选抗原HLA-A3和HLA-B7限制性CTL优势表位共21条.结论:初步筛选出抗原CFP21/MTB12/Rv3881c潜在的HLA-A*0201、HLA-A3、HLA-B7限制性表位33条.     

Identification of an HLA-A* 0201-restricted CD8+ T-cell epitope SSp-1 of SARS-CoV spike protein

A novel coronavirus, severe acute respiratory syndrome (SARS)-associated coronavirus (SARS-CoV), has been identified as the causal agent of SARS. Spike (S) protein is a major structural glycoprotein of the SARS virus and a potential target for SARS-specific cell-mediated immune responses. A panel of S protein-derived peptides was tested for their binding affinity to HLA-A * 0201 molecules. Peptides with high affinity for HLA-A * 0201 were then assessed for their capacity to elicit specific immune responses mediated by cytotoxic T lymphocytes (CTLs) both in vivo, in HLA-A2. 1/Kb transgenic mice, and in vitro, from peripheral blood lymphocytes (PBLs) harvested from healthy HLA-A2.1 donors. SARS-CoV protein-derived peptide-1 (SSp-1 RLNEVAKNL), induced peptide-specific CTLs both in vivo (transgenic mice) and in vitro (human PBLs), which specifically released interferon-gamma (IFN-gamma) upon stimulation with SSp-1-pulsed autologous dendritic cells (DCs) or T2 cells. SSp-1-specific CTLs also lysed major histocompatibility complex (MHC)-matched tumor cell lines engineered to express S proteins. HLA-A * 0201-SSp-1 tetramer staining revealed the presence of significant populations of SSp-1-specific CTLs in SSp-1-induced CD8 T cells. We propose that the newly identified epitope SSp-1 will help in the characterization of virus control mechanisms and immunopathology in SARS-CoV infection, and may be relevant to the development of immunotherapeutic approaches for SARS.     

Identification of an HLA-A＂ 0201-restricted CD8~ T-cell epitope SSp-1 of SARS-CoV spike protein

Identification of an HLA-A~* 0201-restricted CD8~+ T-cell epitope SSp-1 of SARS-CoV spike protein     

MUC4 HLA-A*0201限制性CTL表位的预测及结合力分析

目的：寻找并鉴定MUC4 HLA-A^＊0201限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位.方法：结合2种常用表位预测数据库（SYFPEITHI和ProPred-I）和工具,应用多种参数和方法进行综合分析,包括MHC结合力、蛋白酶体切割位点等综合预测方法.预测得到的抗原表位合成相应抗原肽.用T2细胞株测定各肽与HLA-A^＊0201分子的亲和力.结果：综合分析预测得到HLA-A^＊0201的5个可能表位;合成抗原肽经纯化后纯度＞95%;在5个候选表位肽中,LLLGVGTFV（u25-33）和LLGVGTFVV（1126-34）2个九肽与HLA-A^＊0201的结合力较强.结论：多参数表位预测结果和结合力分析实验结果一致性较好,两者联合应用初步认为LLLGVGTFV（1125-33）和LLGVGTFVV（1126-34）2个九肽为MUC4 HLA-A^＊0201限制性CTL表位的可能性最大.     

HLA-A2限制性NY-ESO-1b肽段诱导的CD8+ T细胞对稳定表达NY-ESO-1的HepG2肝癌细胞系的杀伤效应

目的:分析体外诱导的NY-ESO-1特异性杀伤性T淋巴细胞对稳定表达NY-ESO-1蛋白的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞系的杀伤效应,为进一步分析NY-ESO-1蛋白作为疫苗用于治疗HCC的可能性提供实验支持.方法:从HLA-A2阳性的肝癌患者体内分离出外周血单个核细胞,用NY-ESO-1肽段体外诱导特异性杀伤性T淋巴细胞,并通过酶联免疫斑点法分析特异性杀伤性T淋巴细胞对稳定表达NY-ESO-1蛋白的HCC细胞系HepG2细胞的杀伤效应.结果:转染了NY-ESO-1的HepG2细胞(HLA-A2 )可有效地被NY-ESO-1157-165抗原肽诱导的特异性CD8 T淋巴细胞所识别.效应细胞中大量GrB的释放表明其对稳定转染了NY-ESO-1基因的HepG2细胞有很强的杀伤作用.结论:HepG2细胞中表达的NY-ESO-1蛋白可被此肝癌细胞有效地加工处理,而且HLA-A2限制性的抗原肽NY-ESO-1157-165也可被有效地提呈到细胞表面,从而被效应T细胞所识别.     

人MUC4氨基酸序列片段CDT_8~+细胞表位的多参数预测

目的:预测人MUC4氨基酸序列(AAD53171)的CD8T细胞表位。方法:结合2种常用表位预测数据库和工具,应用多种参数和方法进行综合分析,包括主要组织相容抗原(MHC)结合力、蛋白酶体切割位点等综合预测方法。结果:得到HLA鄄A鄢0201的1(ATLLPVTSL)、145(ATPLPVTSL)和52(LPVTDASSV)3个可能表位,和HLA鄄A24的145(ATPLPVTSL)、1(ATLLPVTSL)两个可能表位。结论:本研究为应用合成肽抗原制备MUC4肿瘤疫苗提供了依据,提供了表位预测的可行方法。     

肾母细胞瘤基因衍生肽诱导细胞毒性T淋巴细胞对白血病患者骨髓CD34+细胞的体外杀伤效应

目的 探讨肾母细胞瘤基因(WT1)衍生肽负载树突状细胞(DC)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对白血病CD34+细胞的体外清除效应.方法 合成一段针对HLA-A*0201锚位的WT19聚肽,体外负载来源于HLA-A*0201*健康人的DC后,诱导产生WT1肽特异性CTL(A组),以噻唑盐(MTT)比色法观察其对WT1表达阳性白血病患者(HLA-A* 0201+者3例,HLA-A*0201-者3例)骨髓CD34+细胞、健康人(HLA-A*0201+者2例,HLA-A*0201-者1例)外周血CD34+细胞和白血病NB4、K562及U937细胞株的体外杀伤效应,粒细胞-巨噬细胞系集落形成试验观察其对白血病患者骨髓CD34+细胞和健康人外周血CD34+细胞粒细胞-巨噬细胞系集落形成单位(CFU-GM)形成的影响.设立单独DC诱导CTL(B组)和IL-2诱导T细胞(C组)作为对照.结果 在效靶比为20:1时,A组CTL对3例HLA-A*0201+白血病患者骨髓CD34+细胞和NB4细胞的杀伤活性(分别为55.3%±2.8%,67.1%±3.2%、49.4%±3.8%和55.0%±3.7%)明显高于对3例HLA-A*0201-白血病患者骨髓CD34+细胞、健康人外周血CD34+细胞及K562、U937细胞的杀伤活性(均<20%),并明显高于B组和C组CTL(均P＜0.01).2例HLA-A*0201+白血病患者骨髓CD34+细胞经A组CTL处理后CFU-GM集落相对形成率分别为17.8%±4.0%和20.8%±3.4%,明显低于经B组CTL处理后(分别为88.9%±3.4%和91.8%±5.7%,均P＜0.01);HLA-A*0201-白血病患者骨髓CD34+细胞、健康人外周血CD34+细胞经A组和B组CTL处理后CFU-GM集落相对形成率差异尤统计学意义.结论 WT1肽特异性CTL能够以HLA-1类抗原限制方式杀伤高表达WT1基因的白血病CD34+细胞,且能特异性抑制其CFU-GM集落形成,WT1基因的表达产物可以作为清除白血病CD34+细胞靶点.